食管癌細胞中沉默Survivin基因對ATG16L1表達的影響

朱世茂 李惠武 劉 玲 楊銀銀 海妮薩依姆·圖爾蓀 李 卉

Survivin是細胞凋亡抑制蛋白家族成員,由 BIRC5 基因編碼,位于人染色體17q25號位置[1]。Survivin在細胞中發(fā)揮多種功能,如調節(jié)細胞分裂,抑制凋亡,促血管生成,可以作為腫瘤免疫治療抗原等[2]。Survivin在幾乎所有人類腫瘤中高表達,如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、食管癌、結直腸癌、胃癌等,但在分化成熟的正常組織中不表達或低表達[3,4]。其在正常細胞和癌細胞中差異表達的特點使Survivin成為癌癥治療的一個極具吸引力的靶點[5]。

圖2 RAPA作用于細胞后的自噬體數(shù)的變化A.對照組;B.PAPA組

圖3 YM155作用Eca109細胞后ATG16L1mRN和Survivin mRNA表達A.ATG16L1的mRNA表達變化;B.Survivin的mRNA表達變化

當細胞受到細胞內(nèi)外因素如饑餓、缺氧、小分子化合物、氧化、內(nèi)質網(wǎng)應激和病原體入侵等刺激時,會誘導自噬產(chǎn)生[6～8]。自噬啟動以后,在延伸階段需要兩個泛素樣結合系統(tǒng)參與膜延伸擴張,即泛素樣蛋白ATG12-ATG5-ATG16L1系統(tǒng)和LC3/Atg8家族蛋白(包括 LC3 和 GABARAP 亞家族)[9]。其中自噬相關蛋白ATG16L1在兩個泛素樣蛋白系統(tǒng)都中起著至關重要作用,同時在自噬的不同階段具有不同的功能,是自噬相關蛋白中一個關鍵參與者[10]。

食管癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一,Survivin在包括食管癌在內(nèi)的大多數(shù)人類腫瘤的致癌作用中起重要作用[11]。自噬是目前腫瘤研究的熱點,自噬的增加和減少參與了癌癥、神經(jīng)性、自身免疫性疾病和感染等疾病的病理過程[12]。ATG16L1在自噬中起主要作用,其在自噬體的形成過程中充當分子支架介導蛋白間的相互作用[13]。因此,在研究腫瘤細胞自噬的過程中,Survivin和ATG16L1兩者之間的關系值得深入探討,可為進一步揭示靶向Survivin臨床治療癌癥的作用機制提供理論參考。

材料與方法

1.細胞系和主要試劑:食管鱗癌細胞株Eca109細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific公司,兔抗人ATG16L1抗體、兔抗人Survivin抗體購自美國CST公司、兔抗人p62等抗體購自武漢博士德公司、雷帕霉素購自美國Selleck公司,山羊抗兔IgG、鼠抗β-actin抗體購自上海中杉金橋公司、TaKaRa試劑盒購自中國大連TaKaRa公司。

2.細胞培養(yǎng)和Survivin-siRNA轉染:人食管鱗癌細胞株Eca109細胞復蘇后在37℃、5% CO2條件的恒溫細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。將細胞分為空白對照組(control組)、RAPA誘導組、陰性對照組(包括negative control、siNC和RAPA+negative control、RAPA+siNC)和Survivin-siRNA轉染組(包括Survivin-siRNA和RAPA+Survivin-siRNA),RAPA工作濃度均為50nmol/L。取對數(shù)生長期的 Eca109 細胞進行電轉染,轉染條件:電壓 280V,電阻 550Ω,電容 900F,之后接種于 6 孔板中,每孔加入2ml培養(yǎng)基。在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后收取細胞。

3.實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測基因的mRNA水平表達:Trizol法提取細胞總RNA并測定RNA的純度和濃度。按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA,使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)進行定量,最后根據(jù)公式2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。生工生物工程(上海)股份有限公司合成所需引物,引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

4.Western blot法檢測蛋白水平表達:采用RIPA裂解液裂解細胞進行細胞總蛋白的提取, BCA法進行總蛋白濃度的測定。將總蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離后轉印至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉液室溫1h,單克隆抗體一抗(稀釋比例1∶1000)孵育,4℃搖床過夜。孵育結束后,將條帶放入洗膜盒中,盒中提前加入1×TBST洗膜液,洗3次,10分鐘/次。室溫孵育二抗(山羊抗兔1∶5000,山羊抗鼠1∶20000)1h。洗滌之后用ECL顯影試劑顯色。Image J軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

5.雙熒光素酶報告基因實驗:具體檢測方法參考碧云天的雙螢光素酶報告基因檢測操作手冊。主要步驟是將Survivin過表達質粒和p62雙報告基因質粒(包括內(nèi)參照海腎質粒)共轉染24h后,使用PBS洗細胞1次,根據(jù)說明加入細胞裂解液,室溫裂解細胞15min,吸取100μl細胞裂解液,放入專用的96孔板,加入100μl恢復到室溫的螢火蟲熒光素酶工作液,使用多功能酶標儀檢測;孔中添加100μl配制好的1×海腎熒光素酶工作液,使用多功能酶標儀檢測,最后對收集的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。

6.細胞免疫熒光觀察自噬體數(shù)目:取對數(shù)生長期的Eca109細胞,消化成懸液后接種于6孔板內(nèi)的玻璃爬片上,待細胞貼壁后,用濃度為50nmol/L的雷帕霉素誘導細胞,以未做處理的細胞作為對照組。加入磷酸緩沖鹽溶液液清洗并棄掉洗液,用4%多聚甲醛室溫固定15min后用磷酸緩沖鹽溶液清洗3次,10分鐘/次。一抗(1∶200)室溫、黑色濕盒封閉1h,然后洗滌3次,10分鐘/次。使用熒光二抗室溫、黑色濕盒孵育1h,然后洗滌3次,10分鐘/次。最后在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察并采集圖片。

結 果

1.RAPA誘導Eca109細胞后檢測p62和LC3-Ⅱ蛋白的表達:使用RAPA誘導Eca109細胞后,Western blot法檢測結果顯示,與對照組比較,RAPA組中LC3-Ⅱ的表達升高(圖1A),p62蛋白表達水平降低(圖1B),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),自噬體數(shù)目(紅色光點)增多(圖2)。提示在Eca109細胞中RAPA誘導建立自噬模型。

2.YM155作用Eca109細胞自噬模型后檢測ATG16L1和Survivin的 mRNA水平表達:使用Survivin特異性抑制劑YM155干預Eca109細胞自噬模型24h后,RT-qPCR檢測結果顯示,與對照組比較,RAPA組中ATG16L1mRNA的表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖3A),Survivin mRNA的表達無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖3B);與RAPA組比較,RAPA+YM155組中Survivin和ATG16L1的mRNA 表達均顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(圖3,P<0.05)。

3.YM155作用Eca109細胞后檢測ATG16L1和Survivin的蛋白表達變化:使用Survivin特異性抑制劑YM155干預Eca109細胞與細胞自噬模型24h后,Western blot法檢測結果顯示,與對照組比較,RAPA組中ATG16L的蛋白表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Survivin的蛋白表達無明顯變化,無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05);與RAPA組比較,RAPA+YM155組ATG16L1和Survivin的蛋白表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4)。

圖4 YM155作用于Eca109細胞后ATG16L1和Survivin的蛋白表達*P<0.01; **P<0.001

4.Survivin-siRNA轉染Eca109細胞后檢測Survivin和ATG16L1的mRNA水平表達:Survivin-siRNA轉染24h后,RT-qPCR檢測結果顯示,與對照組比較,RAPA組中ATG16L1mRNA的表達顯著升高(P<0.01,圖5A),Survivin mRNA的表達無顯著變化(P>0.05,圖5B);與RAPA組比較,RAPA+Survivin-siRNA組中ATG16L1 和Survivin的mRNA表達均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0. 01,圖5)。

5.Survivin-siRNA作用Eca109細胞后檢測ATG16L1和Survivin的蛋白表達:Western blot法結果顯示,與對照組比較,RAPA組中Survivin蛋白表達無明顯變化(P>0.05),ATG16L1的蛋白表達量明顯升高(P<0.01);與RAPA誘導組比較,RAPA+Survivin-siRNA組中Survivin和ATG16L1的蛋白表達降低(P<0.001,圖6)。

圖6 survivin-siRNA作用于Eca109細胞后Survivin和ATG16L1蛋白表達水平變化*P<0.01,**P<0.001

圖7 過表達Survivin對p62的影響A.雙熒光素酶報告基因實驗檢測過表達Survivin后細胞中p62的熒光素酶活性;B.過表達Survivin后p62蛋白表達。*P<0.01,**P<0.001

6.過表達Survivin對p62的影響:雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,在 Eca109 細胞轉染Survivin過表達質粒后,與pGL3-p62 promoter組比較,pGL3-p62 promoter+SVVcDNA組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.001,圖7A);Western blot法檢測結果顯示,與對照組比較,過表達Survivin后,Survivin表達量明顯上升,p62的表達量明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01,圖7B)。

討 論

食管癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一,全球食管癌發(fā)生率和病死率分別位居第7位和第6位[14]。食管癌的兩種主要組織學亞型是鱗狀細胞癌和腺癌[15]。食管鱗狀細胞癌是食管癌的重要亞型,由于缺乏早期檢測食管鱗狀細胞癌的靈敏方法,許多患者在診斷時已有鄰近浸潤或遠端轉移[16]。盡管目前手術和放化療水平都有很大進步,但食管鱗癌患者的預后相對較差,存活率普遍較低[11]。

在細胞自噬的研究中,mTOR蛋白特異性抑制劑雷帕霉素可以激活自噬,是一種常用的自噬誘導劑,常用來構建細胞自噬陽性模型[17,18]。LC3和p62都是檢測自噬活性的標志性蛋白。在自噬過程中,細胞內(nèi)的LC3-Ⅰ型被脂化加工成為LC3-Ⅱ型,并鑲嵌定位在在自噬體膜上,隨著自噬的進展,自噬體增多,LC3-Ⅰ型蛋白向LC3-Ⅱ型蛋白轉換增加[19]。由于LC3-Ⅰ型比LC3-Ⅱ型更容易降解,因此最常見的方法是通過蛋白免疫印跡檢測LC3-Ⅱ型來衡量細胞的自噬活性,而自噬底物蛋白p62參與自噬體的降解過程,其表達量增加可抑制細胞自噬[20,21]。前期研究表明使用50nmol/L的雷帕霉素誘導Eca109 細胞后,利用射透電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察,可以成功建立細胞自噬模型[22]。本實驗研究中使用RAPA誘導食管鱗癌細胞株Eca109后,Western blot法檢測結果顯示,與對照組比較,RAPA誘導組中p62蛋白的表達水平降低,LC3-Ⅱ型蛋白的表達水平升高。表明RAPA誘導后細胞自噬增強,成功建立細胞自噬模型。

自噬與腫瘤的進展、治療以及預后關系密切。研究表明,Survivin能以不同于凋亡的方式幫助細胞逃避死亡,其中之一是操縱自噬,通過干擾自噬參與細胞應激反應。它可與自噬中的不同自噬相關蛋白相互作用,研究證明 Beclin1 能夠與 Survivin 結合從而干預自噬。本研究中使用Survivin特異性抑制劑YM155和轉染Survivin-siRNA干預食管鱗癌細胞株Eca109細胞自噬模型后,PCR和Western blot法檢測結果顯示,與RAPA組比較, RAPA誘導組使用抑制劑YM155和轉染Survivin-siRNA 后,ATG16L1的mRNA和蛋白表達均顯著降低,表明RAPA誘導自噬蛋白ATG16L1表達升高的作用被抑制,Survivin的存在影響ATG16L1的表達。

p62是一個多功能的泛素化接頭蛋白,作為多功能信號樞紐,控制多種細胞過程,如在癌癥發(fā)展、炎癥和免疫、細胞分化和自噬等過程中的發(fā)揮至關重要[23]。在自噬途徑中,p62作為選擇性自噬受體和底物主要通過PB1、LIR和UBA 3種結構域與自噬蛋白相互作用[24]。哺乳動物內(nèi)的蛋白質自噬性降解需要 LC3相互作用區(qū)域(LC3-interacting region,LIR)結構,p62通過LIR結構域與LC3相互作用,促進了自噬體結構的形成[25]。本實驗研究中雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示,Survivin能夠抑制p62的啟動子活性,Western blot法檢測結果顯示過表達Survivin后p62的蛋白表達降低,初步表明Survivin可能對p62基因有靶向調控作用。

綜上所述,在研究沉默食管癌細胞中Survivin基因對自噬相關蛋白ATG16L1表達的影響過程中,在食管鱗癌細胞株Eca109細胞中沉默Survivin后,自噬相關蛋白ATG16L1的表達下調,推測 Survivin調節(jié)ATG16L1的表達可能是通過Survivin靶向抑制p62完成的,只是分子間的作用關系有待于進一步實驗驗證,為揭示Survivin基因在腫瘤細胞自噬發(fā)生中的作用提供了一定的理論基礎。