基于表面增強拉曼光譜技術的柑橘表皮咪鮮胺和抑霉唑農(nóng)藥殘留檢測

李雯雯,龍長江,4*,李善軍,3,4,陳 紅,4

1. 華中農(nóng)業(yè)大學工學院,湖北 武漢 430070 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游農(nóng)業(yè)裝備重點實驗室,湖北 武漢 430070 3. 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)技術體系,湖北 武漢 430070 4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑橘全程機械化科研基地,湖北 武漢 430070

引 言

為防治病蟲害和提升農(nóng)產(chǎn)品外部感觀,農(nóng)藥被大量使用,但不規(guī)范使用和濫用農(nóng)藥等問題不僅導致農(nóng)殘超標危害食用者的健康,也加劇了環(huán)境污染[1-3]。農(nóng)產(chǎn)品的安全問題受到社會普遍關注,而準確檢測農(nóng)殘一直是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測的重點。繁多的農(nóng)藥種類以及嚴格的檢出濃度要求,給農(nóng)殘的準確快速檢測帶來了極大的挑戰(zhàn),因此,探究新的準確快速農(nóng)殘檢測方法對保證食品安全具有重要意義。

目前常規(guī)的農(nóng)藥殘留檢測方法包括氣相色譜法(gas chromatography,GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)等色譜技術[4]。以上方法可檢測到痕量組分,但也存在操作復雜、耗時長等問題,無法實現(xiàn)柑橘表面農(nóng)殘快速檢測。拉曼光譜作為一種新技術,可用于物質(zhì)的定性分析,通過物質(zhì)對光譜的吸光度計算還可以進行定量分析,但由于其靈敏度較低,不適用于農(nóng)殘檢測。而表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman scattering,SERS)通過吸附在貴金屬表面的分析物,可使拉曼信號強度增強數(shù)百萬倍以上,因此可用于低濃度物質(zhì)的檢測[5-7]。Pan等[8]基于金納米棒(Au NRs),結合SERS技術與化學計量學法檢測柑橘中的噻苯達唑,檢出限為0.33 μg·mL-1。Feng等[9]用自制的銀溶膠作為活性基底,將分子印跡聚合物(MIPs)與表面增強拉曼光譜(SERS)相結合,測定橙汁中的噻苯咪唑,該方法測得橙汁中噻苯咪唑的檢出限為4 mg·L-1。張莎等[10]基于自制的納米金溶膠,采用將表面增強拉曼光譜技術與化學計量學方法相結合的方式檢測臍橙果皮中的抑霉唑,用支持向量回歸算法(support vector regression,SVR)建立模型,預測集相關系數(shù)(prediction coefficient,RP)為0.915,RMSEP (root mean square error of predictions)為4.840 7 mg·L-1。Fouad等[11]采用自制的金納米棒為基底,結合表面增強拉曼光譜技術對橙汁中的西維因農(nóng)藥進行檢測,結果表明,橙汁中的西維因濃度與偏最小二乘(partial least squares,PLS)模型預測的濃度呈線性相關,其預測相關系數(shù)RP為0.91,檢出限為506 μg·L-1。有研究用自制的金溶膠,將SERS與化學計量學方法結合,檢測以臍橙為載體的亞胺硫磷與毒死蜱的混合農(nóng)藥,用PLS算法建立臍橙表皮兩種混合農(nóng)藥的回歸模型,預測相關系數(shù)RP為0.912。以上研究表明將金屬納米粒子作為增強基底的SERS技術可實現(xiàn)農(nóng)殘的精準檢測。

本工作以柑橘中常用的咪鮮胺和抑霉唑農(nóng)藥為研究對象,采用SERS技術結合化學計量學方法,采集不同濃度梯度的混合農(nóng)藥光譜,實現(xiàn)對柑橘中咪鮮胺和抑霉唑的定性和定量分析。本研究可為柑橘果皮中咪鮮胺和抑霉唑的快速檢測提供技術參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器:采用DXR3型激光顯微拉曼光譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司),激光波長為785 nm,物鏡選擇10×,采集曝光時間3 s,樣品曝光次數(shù)2次,激光能量30 mW,采集范圍在300～2 000 cm-1。

材料:金溶膠(CP-1)和銀溶膠(CP-S1)均購于廈門普識納米科技有限公司;咪鮮胺粉末標樣(純度為98.6%)和抑霉唑粉末標樣(純度為99.7%)均購于北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司;柑橘保鮮乳油(有效成分為28%,咪鮮胺與抑霉唑的有效成分比是6∶1)購于廣東植物龍生物科技股份有限公司;甲醇、乙腈、氯化鈉、無水硫酸鎂、PSA固相萃取填料(N-丙基乙二胺)凈化吸附劑。

1.2 樣品制備

1.2.1 標準樣品的制備

分別稱取5 mg咪鮮胺、抑霉唑固體粉末于5 mL容量瓶中,向容量瓶中加入甲醇,定容至刻度線,得到濃度為1 000 mg·L-1的咪鮮胺、抑霉唑農(nóng)藥標準溶液。再將1 000 mg·L-1咪鮮胺標準溶液和1 000 mg·L-1抑霉唑標準溶液分別稀釋為100、50、10、5、1和0.5 mg·L-1的標準溶液,以確定最低檢出限。

1.2.2 乳液農(nóng)藥樣品的制備

將咪鮮胺和抑霉唑混合乳油保鮮劑溶于超純水中,配置濃度為1 000 mg·L-1的保鮮劑混合溶液。

1.2.3 樣品制備與凈化

制備:挑選購于華中農(nóng)業(yè)大學水果店的丑橘,表面干凈無損壞,經(jīng)超純水洗滌表面,放置通風處直至晾干。待果皮干燥后,將果皮剝下放入粉碎機中粉碎。粉碎后分別取5 g果皮于規(guī)格為50 mL離心管中,依次加入10 mL乙腈、10 mg氯化鈉和40 mg無水硫酸鎂,超聲震蕩2 min,使其混合均勻,再分別加入1.25 mL濃度為1 000 mg·L-1的咪鮮胺和抑霉唑混合乳油保鮮劑溶液,超聲震蕩2 min混合均勻,再以4 500 r·min-1的轉速于離心機上離心5 min。

凈化:量取離心后的混合溶液6 mL上清液于10 mL離心管中,再加入10 mg無水硫酸鎂和20 mg N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑于離心管中,超聲震蕩2 min,再以4 500 r·min-1的轉速離心5 min,離心后,取2 mL上清液過濾,得到50 mg·L-1的咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥的丑橘果皮凈化液。

將含咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥橘皮凈化液稀釋成濃度范圍為5～42 mg·L-1的溶液,梯度為1 mg·L-1。

1.2.4 團聚劑制備

氯化鈉作為團聚劑,將氯化鈉粉末溶于超純水中,分別配制0.2、0.6、1.0和1.4 mol·L-1氯化鈉標準溶液10 mL。

1.3 光譜采集

分別取少量咪鮮胺、抑霉唑固體粉末于載玻片上,用顯微拉曼光譜儀采集其拉曼光譜。取10 μL咪鮮胺和抑霉唑混合乳油保鮮劑于凹形載玻片上采集其拉曼光譜。將咪鮮胺標準溶液和抑霉唑標準溶液分別與氯化鈉溶液、金溶膠增強基底混合,將兩種混合樣本溶液置于2 mL取樣瓶中,迅速搖勻,用移液槍取10 μL混合溶液于凹形載玻片上,室溫下用顯微拉曼光譜儀采集其光譜,每次采集5條光譜,對5條光譜取平均值作為樣品的原始光譜。分別加入100 μL濃度為5～42 mg·L-1的咪鮮胺和抑霉唑橘皮萃取液的混合溶液、50 μL氯化鈉溶液、200 μL銀溶膠增強基底于2 mL取樣瓶中,迅速搖勻,用移液槍取10 μL混合溶液于凹形載玻片上,室溫下用顯微拉曼光譜儀采集其光譜,每次采集5條光譜,對5條光譜取平均值作為樣品的原始光譜。

1.4 拉曼光譜數(shù)據(jù)處理

為削弱光譜采集過程中的噪聲、基線漂移等干擾,在建立回歸模型之前,對數(shù)據(jù)進行預處理。選擇指數(shù)平滑處理(smoothing)、基線校正(Baseline)、一階導數(shù)(1st derivative)、二階導數(shù)(2nd derivative)、多元散射校正(multiplicative signal correction,MSC)、標準正態(tài)變換(standard normal variate transform,SNV)六種光譜預處理方法。其中基線校正、平滑處理、一階、二階導數(shù)主要用于減小基線漂移,從而提高精度。而SNV和MSC主要用于減小樣本出現(xiàn)的顆粒影響。選擇支持向量回歸(SVR)、灰狼算法優(yōu)化的支持向量回歸(grey wolf optimizer-support vector regression,GWO-SVR)、粒子群算法優(yōu)化的支持向量回歸(particle swarm optimization-support vector regression,PSO-SVR)、遺傳算法優(yōu)化的支持向量回歸(genetic algorithm-support vector regression,GA-SVR)四種定量回歸模型做預測回歸,以訓練集相關系數(shù)(correlation coefficient,RC)、預測集相關系數(shù)(prediction coefficient,RP)、訓練集均方根誤差(root mean square errors of calibration,RMSEC)、預測集均方根誤差(root mean square error of predictions,RMSEP)作為評價指標評價模型性能[12-13]。

2 結果與討論

2.1 金、銀溶膠效果對比

每種被測物分子與金、銀溶膠粒子的結合程度并不相同,在多數(shù)情況下,使用銀納米粒子作為增強基底,其增強效果是金納米粒子的10～100倍[14-15]。為了選擇合適的增強基底獲得最佳增強效果本研究分別使用金、銀溶膠作為增強基底,對比分析濃度為10 mg·L-1的咪鮮胺標準溶液及抑霉唑標準溶液的SERS譜圖。如圖1所示,金溶膠作為增強基底時,對兩種物質(zhì)的標準溶液增強效果更好,更多咪鮮胺、抑霉唑的拉曼特征峰能夠被檢測到。兩種增強基底對同一特征峰的增強效果也不同。當銀溶膠作為增強基底時,其對咪鮮胺光譜圖中位于699和1 015 cm-1的特征峰沒有增強作用,位于826 cm-1的特征峰也出現(xiàn)偏移現(xiàn)象。銀溶膠對抑霉唑657 cm-1的特征峰沒有增強作用,對1 184 cm-1的特征峰增強效果也遜色于金溶膠。綜合考慮,在后續(xù)實驗中選擇金溶膠作為咪鮮胺、抑霉唑標準溶液的增強基底。

2.2 基于金溶膠的咪鮮胺、抑霉唑農(nóng)藥殘留的定性分析

拉曼光譜不同的峰是由于不同物質(zhì)化學鍵的振動、轉動或者伸縮引起的,所以不同位置的特征峰可以表示不同的化學鍵,進而代表不同的分子,此為拉曼光譜的“指紋”特性[16]。以金溶膠為拉曼增強基底,采集濃度為10 mg·L-1的咪鮮胺標準溶液、抑霉唑標準溶液的表面增強拉曼光譜,并分別與咪鮮胺粉末和抑霉唑粉末的拉曼光譜進行對比。結果如圖2所示。

圖2 10 mg·L-1咪鮮胺標準溶液、抑霉唑標準溶液與咪鮮胺粉末、抑霉唑粉末拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of Prochloraz standard solution with concentration of 10 mg·L-1,imazole standard solution with concentration of 10 mg·L-1,prochloraz powder and imazole powder

表1 咪鮮胺拉曼譜帶歸屬Table 1 Raman band assignment of Prochloraz

表2 抑霉唑拉曼譜帶歸屬Table 2 Raman band assignment of imazalil

2.3 金溶膠與農(nóng)藥體積比例對SERS光譜的影響

表面增強拉曼信號的強弱與基底的活性相關,而基底和被測分子的相對濃度直接影響基底的活性,所以探究金溶膠與被測分子的相對濃度很有必要。分別向100 μL金溶膠中加入25、50、100、150、200 μL的10 mg·L-1咪鮮胺溶液、抑霉唑溶液,采集其表面增強拉曼光譜,分別研究金溶膠與咪鮮胺及抑霉唑的不同體積比對拉曼光譜強度的影響。從圖3、圖4結果可以看出,保持金溶膠體積為100 μL,逐漸增加被測物咪鮮胺標準溶液和抑霉唑標準溶液的體積,可以看到拉曼信號呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢。當加入100 μL金溶膠與100 μL的10 mg·L-1咪鮮胺溶液時,特征峰699和829 cm-1的拉曼峰最強。同樣,當加入100 μL金溶膠與100 μL的10 mg·L-1抑霉唑溶液時,特征峰662和1 168 cm-1的拉曼峰最強。分析認為持續(xù)增大被測物的體積時,吸附在金溶膠納米粒子上的咪鮮胺和抑霉唑分子逐漸達到飽和,導致納米粒子與被測分子間相互排斥,進而減弱特征峰的拉曼信號。因此,在后續(xù)實驗中選取咪鮮胺、抑霉唑農(nóng)藥與納米粒子的體積比為100∶100作為最佳體積比。

圖3 咪鮮胺與金溶膠體積比對SERS強度的影響Fig.3 Effect of Prochloraz to gold sol volume ratio on SERS intensity

2.4 NaCl團聚劑對SERS光譜的影響

不同金屬粒子與被測物分子之間的電荷結合程度存在差異,為檢測低濃度物質(zhì)帶來挑戰(zhàn)。雖然金溶膠屬于惰性溶膠,但它對電解質(zhì)十分敏感。向金溶膠中加入團聚劑NaCl,可以加快金屬粒子與被測物分子的結合速度,改善金溶膠的表面增強效果。加入電解質(zhì)之后,Au+的電荷平衡被破壞,使得粒子更加容易與被測物聚集,快速創(chuàng)造更多“熱點”以提高增強的效果。同時過量的Cl-加入會使聚集的粒子越來越大,產(chǎn)生聚沉的情況,反而減少熱點的活性,影響其增強效果。如圖5和圖6所示,選擇較常用的團聚劑NaCl,其濃度從0到1.4 mol·L-1時,咪鮮胺的特征峰699和829 cm-1以及抑霉唑的特征峰966和1 492 cm-1呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢,分析這一現(xiàn)象的原因是在此條件下的金溶膠納米粒子表面的正電荷較多,使得咪鮮胺、抑霉唑農(nóng)藥分子與金溶膠更好地結合,但隨著NaCl濃度的增加,發(fā)生聚沉,降低其拉曼散射峰強度[19]。綜合以上實驗結果,在確定合適的農(nóng)藥與金溶膠的體積比(100∶100)后,選擇團聚劑NaCl的濃度為1 mol·L-1。

圖5 團聚劑NaCl濃度對咪鮮胺SERS的影響Fig.5 Effect of agglomerator NaCl concentration on prochloraz SERS

圖6 團聚劑NaCl濃度對抑霉唑SERS的影響Fig.6 Effect of agglomerator NaCl concentration on the SERS of imazalil

2.5 咪鮮胺和抑霉唑檢出限

在上述實驗條件下(被測物與增強基底體積比為100∶100,團聚劑NaCl濃度為1 mol·L-1),分別配制50、10、5、1和0.5 mg·L-1五個濃度梯度的咪鮮胺標準溶液和抑霉唑標準溶液,分別采集其SERS光譜。從圖7和圖8發(fā)現(xiàn),隨著被測物咪鮮胺標準溶液和抑霉唑標準溶液的濃度降低,特征峰逐漸減弱。當咪鮮胺濃度為0.5 mg·L-1時,僅能看到特征峰1 074 cm-1。當濃度為1 mg·L-1時可以看到特征峰427、829和1 074 cm-1,因為存在兩個以上特征峰才能確定物質(zhì)的存在,所以得到咪鮮胺的檢出限低于1 mg·L-1。當抑霉唑濃度為0.5 mg·L-1時,可以看到特征峰1 374和1 492 cm-1,由此可得抑霉唑的檢出限低于0.5 mg·L-1。

圖7 不同濃度咪鮮胺光譜圖Fig.7 Spectra of Prochloraz at different concentrations

圖8 不同濃度抑霉唑光譜圖Fig.8 Spectrum of imazalil at different concentrations

2.6 混合農(nóng)藥的定性分析及溶膠選擇

在以上實驗基礎上,對咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥的橘皮萃取液進行定性定量分析。從圖9可以看到,混合農(nóng)藥的特征峰存在于427、699、984、1 074、1 268、1 374和1 504 cm-1,其中427、699、1 074和1 268 cm-1屬于咪鮮胺的特征峰,而984、1 374和1 504 cm-1屬于抑霉唑的特征峰。對比表1、表2以及農(nóng)藥粉末的拉曼譜峰歸屬可以發(fā)現(xiàn),984 cm-1原位置為965 cm-1的C—N—C的彎曲振動,1 504 cm-1原位置為1 494 cm-1的C—N—C非對稱伸縮和C—H面內(nèi)彎曲振動。說明混合農(nóng)藥的特征峰相互間存在一定影響。對比圖9中分別使用金、銀溶膠的混合農(nóng)藥橘皮萃取液的特征峰可以看到,金、銀溶膠檢測特征峰數(shù)量相近,但使用銀溶膠后的混合農(nóng)藥的拉曼峰強度遠高于使用金溶膠的結果,所以使用銀溶膠作為增強基底研究混合保鮮劑橘皮萃取液的濃度梯度變化并建立模型。

圖9 混合農(nóng)藥金銀溶膠對比、咪鮮胺、抑霉唑粉末光譜圖Fig.9 Comparison of mixed pesticide gold silver sol,spectrum of Prochloraz and imazole powder

2.7 建立混合農(nóng)藥定量預測模型

采集5～42 mg·L-1不同濃度混合農(nóng)藥的橘皮萃取液的SERS光譜,每個濃度采集5條光譜,用平均光譜作為該濃度范圍的原始光譜。在38個濃度梯度的范圍內(nèi)隨機均勻選取25條光譜作為校正集,13條光譜作為驗證集。采集到的混合農(nóng)藥的橘皮萃取液的拉曼光譜會受到熒光以及噪聲信號的影響,因此選用平滑處理、一階導數(shù)、二階導數(shù)、多元散射校正(MSC)、標準正交變換(SNV)、基線校正六種預處理方法對原始光譜進行處理。為了評價模型的預測精度和速度,選擇合適的特征波段829和1 168 cm-1后,在最優(yōu)預處理情況下對比了支持向量回歸(SVR)、灰狼算法優(yōu)化的支持向量回歸(GWO-SVR)、粒子群算法優(yōu)化的支持向量回歸(PSO-SVR)、遺傳算法優(yōu)化的支持向量回歸(GA-SVR)四種回歸模型的建模效果。其中GWO-SVR初始化狼群數(shù)量M=20,最大迭代次數(shù)T=50,根據(jù)要優(yōu)化模型對SVR中的參數(shù)C和g進行優(yōu)化,參數(shù)的取值范圍均為0.001～100;PSO-SVR模型中最大進化粒子數(shù)量初始參數(shù)M=200,種群最大數(shù)量初始值S=20,局部搜索能力C1和全局搜索能力C2分別為1.5和1.7;GA-SVR模型中最大進化迭代數(shù)的初始參數(shù)M=100,種群最大數(shù)量初始值S=20,交叉概率和變異概率分別為0.4和0.01。

由表3和表4可得,一階導數(shù)結合灰狼算法優(yōu)化的支持向量機回歸模型效果最好,校正集相關系數(shù)RC為0.978,校正集均方根誤差RMSEC為1.655 mg·L-1,預測集相關系數(shù)RP為0.967,預測集均方根誤差RMSEP為2.227 mg·L-1。GWO-SVR、PSO-SVR、GA-SVR運行時間相差不大,平均時間均在2～4 s,都遠短于SVR的運行時間。綜上所述,該方法可以實現(xiàn)對柑橘表皮咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥的快速準確檢測,為柑橘表皮農(nóng)藥檢測提供了一個新途徑。

表3 咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥不同預處理方式下的預測結果Table 3 Prediction results of Prochloraz and imazalil mixed pesticides under different pretreatment methods

表4 咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥不同建模方式下的結果對比Table 4 Comparison of results under different modeling methods of Prochloraz and imazalil mixed pesticides

3 結 論

采用SERS技術結合化學計量學方法對柑橘表皮咪鮮胺、抑霉唑混合農(nóng)藥進行檢測。

(1) 對比金、銀溶膠的增強效果,選擇金溶膠作為咪鮮胺標準溶液、抑霉唑標準溶液的增強試劑,選擇銀溶膠作為咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥的橘皮萃取液的增強試劑,使得檢測效果更好。

(2) 通過對比分析,確定溶膠增強基底與兩種農(nóng)藥標準溶液體積比為1∶1,根據(jù)該比例加入1 mol·L-1NaCl溶液,促進咪鮮胺和抑霉唑農(nóng)藥分子與金溶膠吸附,增強拉曼信號。采用化學計量學方法測得咪鮮胺標準溶液和抑霉唑標準溶液的檢出限低于1和0.5 mg·L-1,低于國家規(guī)定的柑橘類作物農(nóng)藥最大殘留限。

(3) 對咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥橘皮萃取液做了定量分析,選取829和1 168 cm-1特征峰,對比了支持向量回歸(SVR)、灰狼算法優(yōu)化的支持向量回歸(GWO-SVR)、粒子群算法優(yōu)化的支持向量回歸(PSO-SVR)、遺傳算法優(yōu)化的支持向量回歸(GA-SVR)四種模型在最優(yōu)預處理下的建模效果。結果顯示,一階導數(shù)預處理方法結合灰狼算法優(yōu)化的支持向量回歸模型得到的效果最佳,預測集相關系數(shù)Rp為0.967,預測集均方根誤差RMSEP為2.227 mg·L-1。SERS技術與化學計量學方法結合可以實現(xiàn)柑橘表皮咪鮮胺和抑霉唑混合農(nóng)藥殘留的快速準確檢測。

致謝:感謝華中農(nóng)業(yè)大學工學院實驗室劉浩蓬工程師提供的幫助。