二茂鐵位置異構對偶聯(lián)陽離子多肽自組裝行為及其抗菌效果的影響

李奕捷 ，王婧雯 （1.上海交通大學藥學院，上海 01100；.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，西安 710038）

細菌感染是威脅人類健康的重要衛(wèi)生問題之一，抗生素的出現(xiàn)和應用為治療細菌感染做出了巨大貢獻[1]。然而，近年來抗生素濫用導致了多種細菌耐藥現(xiàn)象加劇，抗生素的抗菌能力變得越來越有限[2]。天然抗菌肽是一種應用前景廣泛的抗菌劑[3]，通常帶有正電荷，可被吸附到細菌細胞膜的表面，通過“桶板”模型、“地毯”模型等方式來損傷細胞膜，以殺死細菌，很少引起細菌耐藥[4]，且在此基礎上衍生設計的自組裝陽離子多肽相較于天然抗菌肽，具有便于合成、設計簡單、容易修飾、結構可調的優(yōu)點[5—7]。但對于陽離子抗菌肽，單一的抗菌機制往往要求較高的表面電位，這可能會引起一定的細胞毒性和溶血性，因此，引入其他抗菌機制設計協(xié)同抗菌納米材料成為了近年來研究的熱點[8]。

芬頓反應產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可協(xié)同抗菌[9]。ROS 引起的氧化應激會損害核酸骨架，同時還可通過誘導細胞死亡信號通路的激活來進行細胞內殺菌，細菌感染引起的微酸性環(huán)境能夠明顯促進芬頓反應的發(fā)生，從而實現(xiàn)對細菌的特異性損傷[10]。因此，如何有效地與芬頓反應偶聯(lián)以達到更好的協(xié)同抗菌效果是學者們研究的重點。研究表明，具有相同氨基酸組成但順序或者空間位置不同的肽序列對納米結構的最終自組裝具有顯著影響，如Ma等[11]合成了2種異構肽Ac-RFSFSFR-NH2和Ac-SFRFRFS-NH2，二者含有相同的絲氨酸、精氨酸和苯丙氨酸殘基，但順序不同，二者分別組裝形成了β-折疊結構和無規(guī)球狀結構，結構的不同可影響其表觀電位和抗菌效果。本研究采用標準固相合成法合成一組同分異構的二茂鐵（Ferrocene，F(xiàn)c）偶聯(lián)自組裝多肽，從其二級結構表征、ROS生成效率、抗菌活性以及生物相容性等方面，探究調節(jié)官能團位置異構對多肽自組裝行為和生物活性的影響，以期為進一步開發(fā)新型協(xié)同抗菌納米材料提供思路和策略。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20AR 型半制備型液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），6230 型液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用（TOF-MS）儀（美國Agilent 公司），UV-2700型紫外可見分光光度計、NICOLET iS5型傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR）儀、Varioskan Flash-602 型多功能酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，F(xiàn)L-6500 型熒光光譜儀[珀金埃爾默儀器（上海）有限公司]，Zetasizer Nano ZS 型納米粒度儀及Zeta電位分析儀（英國Malvern 公司），J-1500 型圓二色光譜（circular dichroism spectrum，CD）儀[佳司科（上海）貿(mào)易有限公司]，Tecnai G2 型生物型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（美國FEI 公司），BX53-611 型研究級正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

Rink-酰胺樹脂、賴氨酸[Fmoc-Lys（Mtt）-OH，K]、賴氨酸[Fmoc-Lys（Boc）-OH，K]、Fmoc-L-苯丙氨酸（F）、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽、二甲基甲酰胺（DMF）均購自吉爾生化（上海）有限公司，批號分別為GLS211122-49101、GLS20080-3-36813、GLS220802-36802、GLS200919-35701、GLS201005-00702、GLS21098-2210；N-Boc-N′-三苯甲基-L-組氨酸（H）、硫代黃素T（ThT）均購自上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司，批號分別為BSA288、BNP774；Fc 甲酸（批號C11558015）購自樂研試劑有限公司；正辛酸（C8）、三異丙基硅烷、4-甲基-哌啶、30%過氧化氫（H2O2）溶液、2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）均購自上海泰坦科技股份有限公司，批號分別為T912082、77927158、A52011、P2047146、P2033707；LB肉湯（批號1227K031）購自上海索萊寶生物科技有限公司；CCK-8試劑、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基均購自上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為C0043、8122476。

1.3 菌株與細胞

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）ATCC 43300、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、人皮膚成纖維細胞（HFF-1）均購自上海雅吉生物科技有限公司，批號分別為HDLR908、HBJT086、GEYI879。

2 方法

2.1 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的制備、純化及分子量測定

采用標準固相合成法[12]進行合成。用5 mL 二氯甲烷和5 mL DMF 膨脹Rink-酰胺樹脂（0.5 mmol）30 min，DMF洗滌3遍后，加入4-甲基-哌啶/DMF（1∶4，V/V）溶液15 mL 反應15 min，再用DMF 洗滌3 遍，重復上述操作；然后加入樹脂4 倍量的氨基酸（或Fc、C8）/苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽/三異丙基硅烷（2∶2∶5，m/m/m）溶液，加入DMF 8 mL，反應至少2 h，循環(huán)以上操作，逐步延長設計的肽序列；最后用8 mL DMF洗滌樹脂3 次，用8 mL 二氯甲烷洗滌樹脂5 次，接著加入10 mL三氟乙酸/三異丙基硅烷/水（92.5∶5∶2.5，V/V/V）溶液，反應3 h。通氮氣將該溶液揮發(fā)至2～3 mL，乙醚沉淀得到Fc-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK、C8-K（C8）FFHK的粗產(chǎn)物。

采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法[13]對上述3種粗產(chǎn)物進行純化。以0.1%三氟乙酸溶液（A）-0.1%三氟乙酸乙腈溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3 min，5%B；3～13 min，5%B→30%B；13～26 min，30%B→60%B；26～28 min，60%B→95%B；28～32 min，95%B→5%B）；流速為10 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為5 mL；收集22～26 min 的洗脫液。采用TOF-MS 儀[14]測定多肽分子量。洗脫液于-65 ℃真空冷凍干燥后得到Fc-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK、C8-K（C8）FFHK 3 種多肽的凍干肽粉末。

2.2 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的穩(wěn)定性檢測

取“2.1”項下3種多肽的凍干肽粉末，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）均勻溶解，得質量濃度均為10 mg/mL的單一溶液，室溫下放置24 h待其自組裝得到單一多肽儲備溶液，然后用PBS（pH6.0）稀釋得到質量濃度均為1 mg/mL的單一多肽溶液，分別于室溫下放置24、96 h時，采用紫外可見分光光度計測定多肽溶液的紫外吸收光譜，Zeta電位分析儀測定其Zeta電位，以驗證3種多肽的穩(wěn)定性。

2.3 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的二級結構表征

取“2.1”項下3種多肽的凍干肽粉末適量，按“2.2”項下方法進行自組裝，然后用不同pH的PBS稀釋，得到不同質量濃度的儲備肽液，以進行實驗研究。

2.3.1 CD的測定

在CD 儀上記錄3 種多肽的CD 圖譜，具體方法如下：在恒定氮氣流量下，將上述稀釋后的儲備肽液（500 μg/mL）放置在光通長度為0.1 cm的矩形石英室中，設置CD光譜范圍為185～260 nm，狹縫寬度為0.1 nm。每組設3個平行，每個樣品重復測量3次，取平均值。

2.3.2 FTIR的測定

將自組裝24 h后的3種多肽進行冷凍干燥得到凍干肽粉末，并與KBr 粉末共同碾磨至無明顯顆粒后，壓成片狀，使用FTIR儀于1 500～1 700 cm-1范圍內測量3種多肽的紅外吸收情況。

2.3.3 ThT熒光光譜的測定

以ThT 為熒光染料檢測3 種多肽中β-折疊的含量。將ThT（0.2 mg/mL）與“2.3”項下儲備肽液（2 mg/mL）/PBS按1∶1（V/V）混合，暗處放置2 h，采用熒光光譜儀進行檢測，設置激發(fā)波長為450 nm，吸收波長為470～700 nm。每組設3個平行。

2.3.4 納米形貌觀察

采用生物型TEM進行觀察。取5 μL稀釋后的儲備肽液（300 μg/mL），沉積在碳涂層銅網(wǎng)格上，用濾紙迅速吸取多余的溶液，然后在樣品上方滴入2%乙酸鈾酰水溶液負染色，再用濾紙吸取多余的溶液，將樣品置于室溫下晾干3 h，最后用生物型TEM（工作電壓120 kV）對樣品進行亮場透射電鏡成像。

2.4 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的體外ROS生成效率研究

2.4.1 溶液體系ROS生成效率的測定

采用亞甲基藍（methylene blue，MB）褪色反應來表示ROS 的生成效率。ROS 的產(chǎn)生使得MB 在664 nm 波長處吸光度下降。將實驗分為Control組、Fc-K（C8）FFHK組和C8-K（Fc）FFHK 組，Control 組加入H2O2（1 mg/mL，pH6.0）和MB 溶液（10 mg/L，pH6.0），F(xiàn)c-K（C8）FFHK 組和C8-K（Fc）FFHK 組均在Control 組的基礎上加入“2.2”項下多肽儲備溶液的稀釋液（0.1 mg/mL，pH6.0），將各組的水溶液分別等量混合，將混合后的溶液各取2 mL，置于37 ℃搖床，分別在20、40、60、120 min時，采用紫外可見分光光度計于664 nm波長處檢測吸光度。

2.4.2 細胞內ROS生成效率的測定

采用DCFH-DA 探針檢測細胞內的ROS 生成效率。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的E. coli菌株用不同pH（pH6.0、pH7.4）的PBS 稀釋，采用紫外可見分光光度計得到在600 nm 波長處吸光度（簡稱“OD600”）值為0.15 的菌液。將實驗分為Control 組（給予PBS）、H2O2組（給予PBS 及100 μg/mL H2O2）、Fc-K（C8）FFHK 組[給予PBS 及100 μg/mL Fc-K（C8）FFHK]、C8-K（Fc）FFHK 組[給予PBS 及100 μg/mL C8-K（Fc）FFHK]、Fc-K（C8）FFHK+H2O2組[給予PBS、100 μg/mL H2O2及100 μg/mL Fc-K（C8）FFHK]、C8-K（Fc）FFHK+H2O2組[給予PBS、100 μg/mL H2O2及100 μg/mL C8-K（Fc）FFHK]，上述各組分別與2 種pH（pH6.0、pH7.4）下培養(yǎng)的E. coli菌株共孵育，于37 ℃恒溫箱中反應8 h；隨后以2 500 r/min離心3 min去除PBS，用生理鹽水洗滌菌株3 遍；加入500 μL DCFH-DA 生理鹽水溶液（100 μg/mL）重懸E. coli菌株，于37 ℃下孵育30 min，再用生理鹽水洗滌菌株3 遍；最后用100 μL 生理鹽水重懸E. coli菌株，吸取3 μL 滴加在蓋玻片上，置于正置熒光顯微鏡下觀察。

2.5 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的抗菌活性評價

2.5.1 生長曲線法測定最低抑菌濃度

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MRSA、E. coli菌株用PBS（pH6.0）稀釋，得到OD600值為0.15的菌液。同時按“2.2”項下方法配制不同質量濃度（200～16 000 μg/mL）的多肽溶液，接種于96孔板中，每孔加入180 μL上述菌液及10 μL 各質量濃度的多肽溶液、10 μLH2O2（10 mg/mL），使得3 種多肽的最終質量濃度為10～800 μg/mL；另取10 μL PBS 按上述操作后作為對照，每組設3 個平行。將96 孔板置于37 ℃酶標儀中測量OD600值。細菌生長活力呈現(xiàn)濃度依賴性下降，當OD600值不再升高時的最低質量濃度被認為是最低抑菌濃度（MIC）[15]。

2.5.2 平板法評價抑菌能力

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MRSA、E. coli菌株用PBS（pH6.0）稀釋，得到OD600值為0.15 的菌液。同時采用倍比稀釋法配制不同質量濃度（15～800 μg/mL）的多肽溶液，接種于96孔板中，加入180 μL上述菌液及10 μL各質量濃度的多肽溶液、10 μL H2O2（10 mg/mL），即得混合物；另取10 μL PBS 按上述操作后作為對照。各組于37 ℃下反應8 h，隨后在無菌條件下吸取100 μL，均勻地平鋪在LB肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)18 h后，通過菌落的數(shù)量來評價多肽的抑菌能力。

2.6 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的生物相容性評價

2.6.1 細胞毒性檢測

使用CCK-8 法對3 種多肽的細胞毒性進行評價。將HFF-1 按5×103個/孔接種在96 孔板中，在37 ℃、含5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h至細胞貼壁，隨后將原始細胞培養(yǎng)基替換為添加有不同質量濃度的3種多肽溶液（25、50、100、200 μg/mL）的新鮮杜氏改良Eagle培養(yǎng)基，其中只加入新鮮杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基的作為對照，每組設3 個平行。24 h 后將培養(yǎng)基替換為含有10% CCK-8的新鮮杜氏改良Eagle培養(yǎng)基，孵育2 h，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的吸收值，并計算細胞活力：細胞活力（%）＝（測量值-空白值）/（對照值-空白值）×100%。

2.6.2 溶血性檢測

將新鮮兔血樣品（0.5 mL）與PBS（1 mL，pH 7.4）混合，以4 500 r/min離心5 min，分離紅細胞，用PBS清洗5次后，再用PBS 稀釋至5 mL。取0.3 mL，加入1.2 mL 3種不同質量濃度的多肽溶液（50、100、200 μg/mL），渦旋混合均勻，在室溫下放置3 h 后，以2 500 r/min 離心3 min，取上清液。使用酶標儀于540 nm波長處測量上清液的吸光度（A）；以去離子水代替多肽溶液作為陽性對照，PBS 代替多肽溶液作為陰性對照，并按下式計算溶血率：溶血率（%）＝（A多肽-APBS）/（A去離子水-APBS）×100%。

3 結果與分析

3.1 Fc 偶聯(lián)自組裝多肽的制備、純化及分子量測定結果

本研究合成并純化得到2 種同分異構多肽Fc-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK 以及對照多肽C8-K（C8）FFHK 3種多肽分子（圖1）。3種多肽的純度均大于95%（圖略）；Fc-K（C8）FFHK 和C8-K（Fc）FFHK 的理論分子量均為1 042.44，C8-K（C8）FFHK的理論分子量為956.12，與TOF-MS結果相符（圖略）。

圖1 Fc-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK和C8-K（C8）FFHK的結構式

3.2 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的穩(wěn)定性結果

Zeta電位的變化能夠驗證分散體系的物理穩(wěn)定性[16]。本研究結果顯示，室溫下放置24、96 h時，F(xiàn)c-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK 的紫外吸收圖譜幾乎沒有改變。放置96 h 時與放置24 h 時相比，F(xiàn)c-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK的Zeta電位分別減少了0.3、0.5 mV，證明2 種多肽的穩(wěn)定性良好，具有作為抗菌肽藥物進行研究和應用的基本條件[17]。

3.3 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的二級結構表征結果

CD 圖譜特征區(qū)可以表明多肽溶液中存在二級結構，包括β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲等[14]。CD圖譜結果顯示，F(xiàn)c-K（C8）FFHK和C8-K（Fc）FFHK在208 nm波長處均有明顯的負峰，這表明Fc-K（C8）FFHK和C8-K（Fc）FFHK中存在α-螺旋二級結構，且二者在225 nm 波長處的正峰歸屬于芳香性基團Fc 的π-π共軛；C8-K（C8）FFHK 在203、222 nm附近波長處均有負峰，這表明C8-K（C8）FFHK中同樣存在α-螺旋二級結構，峰位置的微小偏移可能來自Fc或者F氨基酸提供的共軛結構。

FTIR 圖譜能夠通過酰胺Ⅰ區(qū)和酰胺Ⅱ區(qū)的特征峰形來表明蛋白或肽鏈二級結構的存在[18]。本研究結果顯示，F(xiàn)c-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK和C8-K（C8）FFHK均在1 631 cm-1處有明顯的特征峰，表明溶液中存在β-折疊。ThT 熒光光譜結果顯示，在同一波長條件下，F(xiàn)c-K（C8）FFHK中β-折疊含量最高。

納米形貌觀察結果顯示（圖2），F(xiàn)c-K（C8）FFHK自組裝成帶寬為（11±4）nm 的扭曲納米帶，C8-K（Fc）FFHK組裝成直徑為（9±2）nm 的短納米纖維，C8-K（C8）FFHK則組裝成直徑為（8±2）nm的圓柱狀納米纖維。

圖2 Fc-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK和C8-K（C8）FFHK的TEM圖

納米結構的差異與多肽序列有關[19]。C8-K（C8）FFHK 是典型的叉指狀結構，叉指狀結構通常以分級組裝的方式進行自組裝，親水性的氨基酸圍繞疏水中心排布形成膠束，再以分級組裝的方式逐步自組裝形成圓柱狀納米纖維。Fc-K（C8）FFHK 和C8-K（Fc）FFHK 納米形態(tài)的差異來自Fc 殘基和C8殘基的相對位置差異：當長烷基鏈處于多肽主鏈時，多肽更傾向于聚集形成疏水中心，以“聚集-成核-延長”的過程形成圓柱狀納米結構，但是由于Fc的存在，共軛結構之間的π-π電子堆疊作用阻礙了納米纖維在縱向上的不斷生長，難以延長形成交聯(lián)的納米纖維，因而自組裝形成長度較短的納米纖維結構；當Fc殘基處于多肽主鏈時，分子間氫鍵和芳香基團之間的π-π電子堆疊作用成為了分子縱向延長的主要驅動力，F(xiàn)c-K（C8）FFHK 最終形成了扭曲的納米帶結構[19]。

綜上，F(xiàn)c 位置的改變可以調節(jié)多肽的自組裝驅動力，如疏水相互作用、π-π電子堆疊作用等，進而調控多肽的自組裝進程，而C8-K（C8）FFHK 也進一步證明了N端官能團Fc對自組裝的調控作用。

3.4 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的體外ROS生成效率結果

MB 褪色反應結果顯示（圖3），隨著反應時間的延長，F(xiàn)c-K（C8）FFHK 組吸光度較Control 組明顯下降，而C8-K（Fc）FFHK 組吸光度微弱下降；反應120 min 時，F(xiàn)c-K（C8）FFHK組吸光度為0.17，C8-K（Fc）FFHK組吸光度為0.36。

圖3 Fc-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK 的MB 褪色反應紫外吸收光譜圖

DCFH-DA 本身沒有熒光且可以自由穿過細胞膜，可在胞內水解生成DCFH，DCFH 被ROS 氧化成有熒光的DCF。因此，檢測特定波長下的熒光強度可以反映細胞內的ROS水平。當pH為6.0時，與Fc-K（C8）FFHK共孵育的E. coli菌株綠色熒光強度最強，而與C8-K（Fc）FFHK共孵育的E. coli菌株熒光強度較弱，這表明Fc-K（C8）FFHK在微酸性環(huán)境下，ROS生成效率明顯高于C8-K（Fc）FFHK；當pH為7.4時，二者共孵育的E. coli菌株均顯示微弱的熒光強度（圖4），這表明微酸性環(huán)境也是芬頓反應能夠高效進行的重要因素之一[20]。

圖4 不同處理方式下E. coli菌株細胞內ROS的生成熒光圖（×40）

3.5 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的抗菌活性結果

前文結果顯示，F(xiàn)c-K（C8）FFHK、C8-K（Fc）FFHK 的結構和ROS 生成效率有明顯的差異。為進一步探究上述差異對抗菌效果的影響，本研究以OD600值來反映細菌相對數(shù)量以驗證細菌的生長情況。MRSA 生長曲線（圖5）結果顯示，F(xiàn)c-K（C8）FFHK 和C8-K（Fc）FFHK 的MIC 值均為50 μg/mL，C8-K（C8）FFHK 的MIC 值則高達400 μg/mL。對于E. coli菌株，F(xiàn)c-K（C8）FFHK 和C8-K（Fc）FFHK也顯示出抗菌活性的差異，F(xiàn)c-K（C8）FFHK的MIC值為100 μg/mL，C8-K（Fc）FFHK的MIC 值為250 μg/mL，這與2 種同分異構多肽的納米形貌不同有關。革蘭氏陰性菌細胞膜具有比革蘭氏陽性菌更厚的脂質層，而Fc-K（C8）FFHK具有交聯(lián)和柔性的納米結構，其疏水殘基能夠靈活地進入細胞膜中，這增加了芬頓反應在細胞內部發(fā)生的概率，同時通過疏水基團與脂質雙分子層更加緊密的相互作用，進一步提高了自組裝體以“桶板”模型的方式來物理損傷細胞膜的能力[21—22]。因此，納米形貌的不同可能影響了芬頓反應抗菌和物理損傷細胞膜兩種機制的協(xié)同，2 種同分異構多肽展現(xiàn)出具有明顯差異的抗E. coli能力。

圖5 不同質量濃度的3種多肽處理后MRSA和E. coli的生長曲線圖

平板菌落結果進一步佐證了3種多肽抑菌能力的差異。MRSA的平板菌落圖（圖6A）顯示，質量濃度為100 μg/mL 時，經(jīng)Fc-K（C8）FFHK 和C8-K（Fc）FFHK 處理后的瓊脂平板中幾乎無生長的菌落；對于C8-K（C8）FFHK，當質量濃度為400 μg/mL時，瓊脂平板中仍然能夠觀察到零星的菌落，表明存在Fc時，F(xiàn)c誘導的芬頓反應能夠顯著地提高Fc-K（C8）FFHK和C8-K（Fc）FFHK對MRSA的抑菌能力。此外，F(xiàn)c-K（C8）FFHK 和C8-K（Fc）FFHK抑菌能力差異不明顯，這可能是因為Fc-K（C8）FFHK 和C8-K（Fc）FFHK介導的物理損傷細胞膜和芬頓反應抗菌機制在抗MRSA時均實現(xiàn)了良好的協(xié)同效應[23]。對于E. coli菌株，F(xiàn)c-K（C8）FFHK 的抑菌能力最佳，C8-K（Fc）FFHK次之，C8-K（C8）FFHK遠低于前兩者（圖6B）。

圖6 不同質量濃度的3種多肽處理后MRSA和E. coli的平板菌落圖

3.6 Fc偶聯(lián)自組裝多肽的生物相容性結果

CCK-8結果顯示，質量濃度為200 μg/mL時，經(jīng)3種多肽處理后的HFF-1 細胞活性均在70%以上，這說明Fc-K（C8）FFHK在E. coli菌株的2倍MIC下仍有較好的生物相容性；對于C8-K（Fc）FFHK，當質量濃度達到E. coli菌株的2倍MIC值（500 μg/mL）時，會產(chǎn)生一定的細胞毒性（細胞活性低于70%）。溶血性實驗結果顯示，3種多肽的溶血率均小于2%，這提示3種多肽不會產(chǎn)生嚴重的溶血現(xiàn)象。

4 結語

同分異構的Fc-K（C8）FFHK和C8-K（Fc）FFHK自組裝形成了不同的納米結構，其Zeta 電位具有一定差異。在生物活性方面，F(xiàn)c 的位置不同會顯著地影響細胞內ROS生成效率和抗菌活性，但交聯(lián)的扭曲納米帶結構能夠提高自組裝多肽的ROS 生成效率及其進入細胞內部的概率，從而獲得更強的抗菌活性，這為進一步設計功能化多肽材料以及協(xié)同抗菌納米材料提供了合理的策略和有力的支撐。但是將研究環(huán)境轉移到人體內時，自組裝多肽結構和形貌以及體內藥代動力學的變化還需深入研究，對于自組裝多肽在細胞內的最終歸宿和潛在的免疫原性也有待進一步探討。