雷公藤甲素聯(lián)合吉非替尼對(duì)EGFR突變NSCLC細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)分析

張 藝 ，郭 芬 （1.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 咸寧 437100；.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，湖北 咸寧 437100）

肺癌是癌癥致死的首要原因，其中約85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），嚴(yán)重影響人類健康[1]。近年來，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）編碼基因分型的鑒定和EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）靶向藥物的發(fā)展，極大地改變了EGFR基因突變晚期NSCLC患者的治療結(jié)局[2]。然而，幾乎所有的EGFR基因突變陽(yáng)性患者都會(huì)在治療1 年內(nèi)對(duì)EGFR-TKIs 產(chǎn)生獲得性耐藥[3]，故探尋能夠預(yù)防或克服EGFR-TKIs 耐藥的治療方案成為該領(lǐng)域的主要研究方向。

近期研究證實(shí)，某些天然藥物成分可通過不同的信號(hào)通路來推遲或阻止EGFR-TKIs耐藥的發(fā)生[4]。雷公藤甲素（triptolide，TPL）是從中藥雷公藤中提取分離的一種二萜類化合物，具有顯著的抗腫瘤活性，且在逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥方面具有一定潛力[5—6]，然而其具體機(jī)制尚不清楚。既往有研究證實(shí)，TPL可調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，且與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，又稱Akt）通路的關(guān)系尤其密切[7]；同時(shí)，PI3K/Akt通路與EGFR-TKIs 耐藥的發(fā)生密切相關(guān)[8]。為此，本課題組基于PI3K/Akt 通路，以耐藥細(xì)胞為對(duì)象，初步探索TPL 對(duì)第一代EGFR-TKIs 吉非替尼獲得性耐藥的抑制作用及潛在機(jī)制，旨在為進(jìn)一步闡明TPL 的藥理作用提供參考，亦為預(yù)防或逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs 耐藥提供候選治療策略。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BD Accuri C6 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences 公司）、XBQ-2H 型細(xì)胞培養(yǎng)儀（上海佐研儀器科技有限公司）、LD-96A型酶標(biāo)儀（山東萊恩德智能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

TPL對(duì)照品（批號(hào)111567-202005，純度≥98%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；吉非替尼片（批號(hào)211102，規(guī)格0.25 g）購(gòu)自日本Kagamiishi Plant，Nipro Pharma Corporation。TPL 對(duì)照品和吉非替尼片均保存于二甲基亞砜（DMSO）中（最終質(zhì)量濃度均為100 μg/mL），臨用前以無血清培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；核糖核酸酶Ⅰ購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；MTT試劑（批號(hào)c7062）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔源PI3K p85α 單克隆抗體（批號(hào)ab191606）、兔源Akt3+Akt2+Akt1 重組單克隆抗體（批號(hào)ab32505）、小鼠源哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）單克隆抗體（批號(hào)ab87540）、兔源微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3α（microtubule-associated protein 1 light chain 3α，MAP1LC3A）單克隆抗體（批號(hào)ab52768）、兔源MAP1LC3B 多克隆抗體（批號(hào)ab51520）、Alexa Fluor?488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)ab150077）、Alexa Fluor?488 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 二抗（批號(hào)ab96879）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人EGFR 低敏感性NSCLC 細(xì)胞系H1975（即EGFRT790M/L858R 突變的耐藥細(xì)胞系）和高敏感性NSCLC細(xì)胞系H1299（即EGFR野生型的非耐藥細(xì)胞系）均購(gòu)自日本Riken細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將H1299 和H1975 細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、L-谷氨酰胺（2 mmol/L）、1%青霉素-鏈霉素雙抗和25 mmol/L HEPES 緩沖液的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)90%時(shí)，用0.25%胰酶消化并按照1∶3的比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)，取傳至第2代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 TPL、吉非替尼單用及兩藥聯(lián)合對(duì)2種細(xì)胞敏感性影響的檢測(cè)

待H1299和H1975細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿60%左右時(shí)，取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。待細(xì)胞完全貼壁后，分為空白組（僅含細(xì)胞和培養(yǎng)液）、不同濃度TPL組（1、5、10、15、20、25、30 nmol/L，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）、不同濃度吉非替尼組（1、2、4、8、12、16、20 μmol/L，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）、不同濃度TPL+吉非替尼組（5 nmol/L TPL 分別聯(lián)合2、5、10、20 μmol/L 吉非替尼，10 nmol/L TPL 分別聯(lián)合2、5、10、20 μmol/L吉非替尼，參考前期MTT篩選結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)液，各藥物組加入相應(yīng)藥液，空白組不作處理。培養(yǎng)24、48、72 h 后，收集各組細(xì)胞，加入5 mg/mL MTT 試劑20 μL，在37 ℃下孵育4 h，使用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（optical density，OD）值并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）＝藥物組OD值/空白組OD值×100%。計(jì)算吉非替尼（作用24、48、72 h）的半數(shù)抑制濃度（IC50）和吉非替尼單用及兩藥聯(lián)用（作用48 h）的藥物敏感度指數(shù)（sensitivity index，SI）：SI＝ΔX/ΔY（式中，ΔX是細(xì)胞存活數(shù)，ΔY是正常細(xì)胞總數(shù)）。若SI＝1.0，表示細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性不明顯；SI＞1.0，表示細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性較高；SI＜1.0，表示細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性較低[9]。采用中位藥效法（Chou-Talalay法）計(jì)算TPL聯(lián)合吉非替尼作用48 h的聯(lián)合用藥指數(shù)（combination index，CI）：CI＝d1/D1+d2/D2（式中，d1和d2分別為聯(lián)合用藥時(shí)吉非替尼和TPL的濃度；D1和D2分別為產(chǎn)生與聯(lián)合用藥相等效應(yīng)時(shí)吉非替尼和TPL 單用的濃度）。CI＞1為兩藥拮抗，CI＝1為兩藥相加，CI＜1 為兩藥協(xié)同[6]；以受影響的細(xì)胞比例（Fa）為橫坐標(biāo)、CI為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，若Fa 為0.2～0.8 則表示藥物有效[7]。

2.3 TPL 聯(lián)合吉非替尼對(duì)H1975 細(xì)胞凋亡及周期分布影響的檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好的H1975 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分為空白組（僅含細(xì)胞和培養(yǎng)液），低、高濃度TPL 組（5、15 nmol/L，參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），吉非替尼組（2 μmol/L，參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），低濃度TPL+吉非替尼組、高濃度TPL+吉非替尼組（5 nmol/L TPL+2 μmol/L 吉非替尼，15 nmol/L TPL+2 μmol/L 吉非替尼，參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)液，各藥物組加入相應(yīng)藥液，空白組不作處理。培養(yǎng)24、48 h后，收集各組細(xì)胞，并固定于冷的75%乙醇中，隨后用含200 mmol/L Na2PO4和0.1% Triton X-100 試劑的DNA 緩沖液處理，再以含200 μg/mL核糖核酸酶Ⅰ的PI試劑染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率及周期分布情況。

2.4 TPL與EGFR分子對(duì)接分析

從PDB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）加載EGFRT790M/L858R 突變型及野生型編碼產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu)，去除水分子后，基于AMBER99 力場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)子化處理；利用MMFF94s 力場(chǎng)優(yōu)化TPL 的分子結(jié)構(gòu)。利用MOE 分子對(duì)接軟件模擬TPL 和EGFR 的結(jié)合位點(diǎn)?；诮Y(jié)合對(duì)接能量對(duì)TPL 的所有結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行排序，并選擇能量最低的構(gòu)象進(jìn)行結(jié)合模式展示。

2.5 TPL 聯(lián)合吉非替尼對(duì)H1975 細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取生長(zhǎng)良好的H1975 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、干預(yù)。培養(yǎng)24、48 h后，收集各組細(xì)胞，分別用核因子固定液和滲透緩沖液固定和滲透，然后加入PI3K、Akt、mTOR、MAP1LC3A、MAP1LC3B 一抗（稀釋比例均為1∶2 000），4 ℃孵育過夜；再加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶1 000），孵育1 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)并使用FlowJo V10 軟件分析目的蛋白的熒光強(qiáng)度以表示其表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 TPL、吉非替尼單用及兩藥聯(lián)合對(duì)2種細(xì)胞敏感性的影響

隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，TPL、吉非替尼對(duì)H1975 和H1299 細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，且具有濃度、時(shí)間依賴趨勢(shì)（圖1A、1B）。作用24、48、78 h 時(shí)，吉非替尼對(duì)H1975 細(xì)胞的IC50分別為15.10、11.67、7.31 μmol/L，對(duì)H1299 細(xì)胞的IC50分別為15.78、12.75、9.48 μmol/L。作用48 h 時(shí)，吉非替尼對(duì)H1975 細(xì)胞的SI 為0.73；與5 或15 nmol/L 的TPL 聯(lián)用后，SI 分別升至1.88、2.30，提示聯(lián)用后藥物對(duì)H1975細(xì)胞的敏感性有所增加；此外，兩藥聯(lián)合作用48 h 對(duì)H1975 細(xì)胞的CI 均小于1（Fa 約為0.5），提示兩藥聯(lián)合對(duì)H1975 細(xì)胞的增殖具有協(xié)同抑制效應(yīng)。但兩藥聯(lián)用對(duì)H1299 細(xì)胞的CI 均大于1（Fa多低于0.2），提示兩藥聯(lián)合對(duì)H1299細(xì)胞的增殖并無上述協(xié)同抑制效應(yīng)（圖1C、圖1D）。

圖1 TPL、吉非替尼單用及兩藥聯(lián)用對(duì)2種細(xì)胞敏感性的影響（±s，n＝6）

3.2 TPL 聯(lián)合吉非替尼對(duì)H1975 細(xì)胞凋亡及周期分布的影響

H1975細(xì)胞培養(yǎng)24 h或48 h時(shí)，各藥物組細(xì)胞的凋亡率均較空白組顯著升高（P＜0.05）。同時(shí)，與空白組比較，各藥物組G0/G1期細(xì)胞的比例均顯著升高，S期、G2/M期（僅高濃度TPL組作用48 h和聯(lián)用組）細(xì)胞的比例均顯著降低，且高濃度TPL組細(xì)胞的凋亡率及周期變化普遍較吉非替尼組，聯(lián)用組較吉非替尼、TPL單用組，高濃度聯(lián)用組較低濃度聯(lián)用組更明顯（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 TPL聯(lián)合吉非替尼對(duì)H1975細(xì)胞凋亡率及周期分布的影響（±s，n＝6，%）

表1 TPL聯(lián)合吉非替尼對(duì)H1975細(xì)胞凋亡率及周期分布的影響（±s，n＝6，%）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與吉非替尼組比較，P＜0.05；c：與低濃度TPL組比較，P＜0.05；d：與高濃度TPL組比較，P＜0.05；e：與低濃度TPL+吉非替尼組比較，P＜0.05。

組別空白組吉非替尼組低濃度TPL組高濃度TPL組低濃度TPL+吉非替尼組高濃度TPL+吉非替尼組培養(yǎng)24 h凋亡率11.32±2.25 27.52±2.33a 26.43±2.64a 38.93±6.56abc 46.69±2.64abcd 52.12±4.81abcde G0/G1期比例57.60±4.63 63.15±5.04a 64.58±7.41a 70.21±6.38ab 77.82±5.26abcd 85.69±6.42abcde S期比例21.49±2.60 16.31±1.41a 12.61±5.12a 10.96±4.58ab 6.63±1.24abcd 4.43±0.26abcde G2/M期比例10.71±1.03 9.86±0.42 12.48±5.45 11.32±2.10 7.12±1.49abcd 5.49±0.69abcde培養(yǎng)48 h凋亡率22.16±2.38 35.47±2.55a 35.33±3.51a 40.43±2.43abc 50.78±2.30abcd 62.54±3.66abcde G0/G1期比例61.23±8.21 65.20±4.23a 67.41±2.52a 74.61±6.23abc 85.79±4.73abcd 93.87±6.90abcde S期比例30.64±5.13 21.03±2.08a 22.75±5.00a 17.72±0.39abc 11.81±3.29abcd 7.24±0.58abcde G2/M期比例20.85±3.91 18.73±4.05 18.18±3.42 16.68±0.62a 9.80±2.44abcd 5.70±0.28abcde

3.3 TPL與EGFR分子對(duì)接分析

TPL 的羥基可與EGFRT790M/L858R 突變編碼產(chǎn)物的Thr854 殘基形成氫鍵，結(jié)合對(duì)接能量為-6.504 kcal/mol（1 kcal＝4.19 kJ）；而TPL 與EGFR野生型編碼產(chǎn)物之間沒有氫鍵，結(jié)合對(duì)接能量為-4.460 kcal/mol。結(jié)果見圖2。

圖2 TPL與EGFR T790M/L858R突變和EGFR野生型編碼產(chǎn)物結(jié)合的二維模型

3.4 TPL 聯(lián)合吉非替尼對(duì)H1975 細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，各藥物組培養(yǎng)24、48 h 時(shí)通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、mTOR 的表達(dá)均顯著下調(diào)，而自噬相關(guān)蛋白MAP1LC3A、MAP1LC3B的表達(dá)均顯著上調(diào)，且高濃度TPL組上述指標(biāo)的變化均較吉非替尼組，聯(lián)用組較吉非替尼、TPL 單用組，高濃度聯(lián)用組較低濃度聯(lián)用組更明顯（P＜0.05），結(jié)果見圖3。

圖3 TPL聯(lián)合吉非替尼對(duì)H1975細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

4 討論

吉非替尼是第一代EGFR-TKIs，可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR 結(jié)構(gòu)域中的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）位點(diǎn)而阻止酪氨酸磷酸化，阻斷EGFR所介導(dǎo)的信號(hào)通路持續(xù)激活，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，該藥被廣泛用于EGFR基因突變陽(yáng)性NSCLC 患者的一線治療[1，7—8]。然而臨床實(shí)踐顯示，多數(shù)患者用藥后不久便會(huì)發(fā)生EGFR-TKIs耐藥，從而導(dǎo)致治療失敗[10—11]。

TPL 是一種具有強(qiáng)烈細(xì)胞毒性的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，對(duì)乳腺癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞均有顯著的抑制作用，還可增強(qiáng)5-氟尿嘧啶、順鉑、阿霉素等化療藥物的抗腫瘤作用，從而提高化療藥物的治療效果[6，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的TPL對(duì)H1975、H1299細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，且有時(shí)間和濃度依賴趨勢(shì)。

藥物相互作用評(píng)價(jià)在醫(yī)藥學(xué)各個(gè)領(lǐng)域都具有重要的價(jià)值，特別是在需聯(lián)合用藥的惡性腫瘤化療領(lǐng)域，其中CI分析是評(píng)估化療藥物相互作用的常用指標(biāo)之一，當(dāng)Fa 值為0.2～0.8、CI＜1 則表示聯(lián)用藥物具有協(xié)同效應(yīng)[6—7，13]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的TPL聯(lián)合吉非替尼可對(duì)H1975細(xì)胞的增殖產(chǎn)生協(xié)同抑制效應(yīng)（Fa約0.5，CI＜1）；而兩藥聯(lián)合對(duì)H1299 細(xì)胞幾乎沒有上述效應(yīng)（Fa 多低于0.2，CI＞1），同時(shí)反映藥物敏感度的SI 也從單用的0.73升至聯(lián)用的1.88、2.30，可能是因?yàn)镠1299細(xì)胞為吉非替尼敏感細(xì)胞，而H1975 細(xì)胞因存在EGFRT790M/L858R突變而對(duì)吉非替尼不敏感，TPL聯(lián)合吉非替尼增加了耐藥細(xì)胞的敏感性，提示TPL有逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的潛力。此外，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果同樣顯示，TPL聯(lián)合吉非替尼可明顯誘導(dǎo)H1975細(xì)胞凋亡并將其阻滯于G0/G1期。這些結(jié)果均證實(shí)了TPL聯(lián)合吉非替尼可發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用，能更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡并阻滯細(xì)胞周期。

本研究進(jìn)行的計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，與EGFR野生型編碼產(chǎn)物相比，TPL與EGFRT790M/L858R突變型編碼產(chǎn)物的結(jié)合更穩(wěn)定，進(jìn)一步佐證了TPL 聯(lián)合吉非替尼的協(xié)同抑制作用。有研究表明，TPL 可通過氫鍵與EGFR 結(jié)構(gòu)域中的ATP 結(jié)合，結(jié)合自由能為-5.69 kcal/mol，且結(jié)合是穩(wěn)定的[14]。本研究結(jié)果與上述研究基本一致，提示化合物的結(jié)構(gòu)特征決定了其與EGFR的親和力，這可能也是影響聯(lián)用藥物協(xié)同效應(yīng)的重要原因。

由于細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性涉及多種因子和途徑的復(fù)雜交替過程，因此揭示聯(lián)合靶向治療的特定分子途徑是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。PI3K/Akt 途徑是EGFR 下游的一條重要信號(hào)通路，EGFR 磷酸化激活后可形成Shc-Grb2-SOS1 復(fù)合物，從而激活PI3K，激活的PI3K 可催化磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的生成并進(jìn)一步促進(jìn)Akt激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其生長(zhǎng)[15—16]。本研究結(jié)果顯示，吉非替尼、TPL 單用和兩者聯(lián)用均可下調(diào)PI3K、Akt 蛋白的表達(dá)，且兩者聯(lián)用的效果優(yōu)于吉非替尼、TPL單用。這提示PI3K/Akt通路可能是TPL的潛在作用靶點(diǎn)之一，TPL 聯(lián)合吉非替尼具有協(xié)同增效的效果。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，自噬與化療敏感性的關(guān)系較為復(fù)雜，其中MAP1LC3A、MAP1LC3B等蛋白是MAP1LC3/LC3 自噬家族成員，可反映細(xì)胞的自噬水平[17]。有研究指出，mTOR 通路與自噬有關(guān)，抑制mTOR 通路可部分激活細(xì)胞自噬[18]；同時(shí)，作為PI3K/Akt 通路下游的重要調(diào)控因子，mTOR可促使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療/靶向藥物產(chǎn)生耐藥性[19]?？紤]到誘導(dǎo)自噬與EGFR-TKIs 耐藥有關(guān)[20]，本研究檢測(cè)了MAP1LC3A、MAP1LC3B、mTOR 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，吉非替尼、TPL 單用和兩者聯(lián)用均可顯著上調(diào)細(xì)胞中MAP1LC3A、MAP1LC3B的表達(dá)，下調(diào)mTOR蛋白的表達(dá)，且兩者聯(lián)用的效果優(yōu)于吉非替尼、TPL 單用。這提示H1975 細(xì)胞的自噬得以增多，其對(duì)藥物的敏感性有所提高；同時(shí)，PI3K/Akt/mTOR 通路可能是TPL作用的另一潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，TPL 聯(lián)合吉非替尼可對(duì)EGFRT790M/L858R 突變NSCLC 細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，其作用可能與下調(diào)PI3K/Akt/mTOR 通路和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)。這一結(jié)論為TPL的增效作用提供了潛在的研究方向，但仍需后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。