不同抗性甘藍品種對黑腐病的生理響應

張鑫鑫

（山西運城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，山西 運城 044000）

結(jié)球甘藍簡稱甘藍，是一種十字花科蕓薹屬蔬菜作物，栽培歷史悠久，在世界各地廣泛栽培［1］。隨著甘藍在世界各地的普遍推廣，復種指數(shù)居高以及重茬嚴重，各種病害相繼出現(xiàn)，由野油菜黃單胞菌引起的黑腐病為其中一種主要病害［2］。

甘藍黑腐病常發(fā)生于溫暖、潮濕的氣候條件下［3］。近年來，甘藍黑腐病在我國蔬菜生產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，病征表現(xiàn)為：初期，葉片邊緣出現(xiàn)黃褐色V 形病斑。隨著病原菌在植株體內(nèi)蔓延，出現(xiàn)維管束變黑、植株枯死的情況，且常伴隨軟腐病的發(fā)生，嚴重影響甘藍的產(chǎn)量和質(zhì)量［4-9］。

國內(nèi)外許多學者研究發(fā)現(xiàn)，小麥、花椰菜、大豆、煙草、花生、菜豆、水稻、黃瓜、大白菜等多種植物感染病原菌后，葉片和根系的生理生化活動會發(fā)生一些獨特的變化，這些變化與植物的抗病性相關［10-12］。但是，目前關于結(jié)球甘藍感染黑腐病菌后葉片及根系發(fā)生的生理生化反應的研究報道較少。因此，本研究選用5 個抗性不同的甘藍材料，分別比較結(jié)球甘藍在感染黑腐病菌后根系以及葉片生理生化指標的變化與品種抗病性的關系，旨在為深入研究結(jié)球甘藍對黑腐病的抗病機理和加快抗病品種選育工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌株由西北農(nóng)林科技大學園藝學院甘藍抗病育種研究室提供，編號YU，致病力較強［13］，該菌株分離自陜西省榆林市田間自然發(fā)病的甘藍病葉。

1.1.2 供試甘藍材料

選擇田間抗甘藍黑腐病差異顯著的5 個品種：高抗材料QK2502（HR）、抗病材料QG70（R）、中抗材料LQ66（MR）、感病材料QG50（S）、高感材料B02（HS）雜種一代種子，均由西北農(nóng)林科技大學園藝學院甘藍抗病育種研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng)

試驗在西北農(nóng)林科技大學科研溫室進行。挑選供試甘藍種子，選擇籽粒飽滿、整齊一致的種子，先在75%酒精中處理1 min，再用滅菌蒸餾水沖洗2～3 次，在25 ℃催芽箱中催芽2 d，選取發(fā)芽一致的種子播種于50 孔穴盤滅菌基質(zhì)中，播種后的育苗盤置于溫室中正常管理。

1.2.2 黑腐病菌懸浮液制備

菌株YU 在接種前18 h 轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，搖床28 ℃、190 r/min 培養(yǎng)18 h，再用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度至1×108cfu/mL。

1.2.3 接種

待供試材料長至3 葉1 心期進行接種。接種前24 h 將材料澆透并覆蓋塑料薄膜保濕，第2 天用小型噴霧器將菌液均勻噴灑到植株葉片上，以葉片無液滴滴落為度。噴施無菌水作為空白對照。每個處理20 株苗，設置3 次重復。接種后繼續(xù)用塑料薄膜保濕36 h，后揭去塑料薄膜，將幼苗放在溫度26、19 ℃，濕度90%條件下正常管理，光照時長14 h［14］。

1.2.4 取樣

從接種當天起，分別于0、1、3、5、7 d 的固定時間對甘藍幼苗葉片進行取樣，取樣后將樣品保存于－80 ℃冰箱中備用，其中，地下部相關生理指標的測定取樣時間是1、7 d。

1.2.5 測定項目和采用方法

甘藍材料根系相關指標：根長，采用直接測量法；根系鮮重，采用直接稱量法；根系活力，采用TTC 法［15］。

甘藍材料葉片相關指標：過氧化物酶（POD）活性，采用愈創(chuàng)木酚氧化法［16］；超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用NBT 光還原法［17］；苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，采用王敬文和薛應龍（1981）［18］的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各處理重復3 次，結(jié)果計算平均值，然后采用Microsoft Office Excel 2010 和SPSS 17.0 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Duncan’s 多重比較分析差異顯著性。

2 結(jié)果分析

2.1 接種黑腐病菌對不同抗性甘藍材料根系的影響

由表1 可知，與未接種黑腐病菌的5 個甘藍材料幼苗相比，在接種后第1 天，接種幼苗根長和根系鮮重變化均較小，均未達到顯著水平（P＜0.05）；QG70（R）幼苗根系活力表現(xiàn)出顯著升高。在接種后第7 天，經(jīng)接種后5 個材料的根長、根系鮮重均不同程度低于未接種材料，其中QG50（S）、B02（HS）經(jīng)過接種的幼苗根長明顯低于未接種幼苗，并且差異可達到極顯著水平（P＜0.01），QG70（R）、QG50（S）和B02（HS）經(jīng)接種處理的幼苗根系鮮重顯著低于未接種幼苗；接種的QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、QG50（S）的根系活力均高于未接種幼苗，B02（HS）的根系活力低于未接種幼苗，其中QK2502（HR）經(jīng)過接種的幼苗根系活力增加率為21.04%，與未接種幼苗差異達到極顯著水平（P＜0.01），LQ66（MR）經(jīng)過接種的幼苗根系活力顯著高于未接種幼苗，增加率為15.27%。

表1 接種黑腐病菌對甘藍幼苗根系的影響

比較5 個甘藍材料可知，在第7 天，接種比未接種增加率表現(xiàn)為：根長增加率由低到高依次為B02（HS）、QG50（S）、QK2502（HR）、LQ66（MR）、QG70（R）；根系鮮重增加率由低到高依次為B02（HS）、QG50（S）、QG70（R）、LQ66（MR）、QK2502（HR）；根系活力增加率由低到高為B02（HS）、QG50（S）、QG70（R）、LQ66（MR）、QK2502（HR），其中B02（HS）根系活力增加率為負值。圖1 為5 個甘藍材料接種黑腐病菌和未接種幼苗第1 天和第7 天根系形態(tài)對比情況。

圖1 黑腐病菌對甘藍幼苗根系的影響（第1天和第7天）

2.2 接種黑腐病菌對不同抗性甘藍材料葉片POD活性的影響

由表2 可知，接種黑腐病菌后，5 個材料幼苗葉片POD 活性均不同程度增加，增加率表現(xiàn)出先升高（第1、3、5 天）后降低（第7 天）的趨勢。QK2502（HR）在接種后1、3、5、7 d 葉片POD 活性均高于未接種幼苗，且達到極顯著水平（P＜0.01），增加率分別為29.77%、35.80%、38.83%、33.79%。QG70（R）在接種后1、5、7 d 葉片POD 活性均高于未接種幼苗，且達到極顯著水平（P＜0.01）；在接種后3 d 葉片POD 活性顯著高于未接種幼苗，未達到極顯著水平（P＜0.01）。LQ66（MR）在接種后1 d 葉片POD 活性雖高于對照，但未達到顯著水平（P＜0.05）；在接種后3、5、7 d 葉片POD 活性均極顯著高于未接種幼苗，增加率分別為17.70%、21.06%、16.21%。QG50（S）在接種后5 d 葉片POD 活性極顯著高于未接種幼苗，增加率達18.65%。B02（HS）在接種后5、7 d 葉片POD 活性極顯著高于未接種幼苗，增加率分別為15.35%、7.71%。

表2 接種黑腐病菌對葉片過氧化物酶（POD）活性的影響

比較5 個甘藍材料可知，接種比未接種幼苗葉片POD 活性增加率表現(xiàn)為：第1 天增加率由高到低依次為QK2502（HR）、QG70（R）、QG50（S）、LQ66（MR）、B02（HS）；第3、5、7 天增加率由高到低為QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、QG50（S）、B02（HS）。

2.3 接種黑腐病菌對不同抗性甘藍材料葉片SOD活性的影響

由表3 可知，QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、B02（HS）在接種后幼苗葉片SOD 活性增加率表現(xiàn)出先升高（1、3 d）后降低（5 d）再升高（7 d）的趨勢，QG50（S）表現(xiàn)出先升高（1 d）后降低（3、5、7 d）的趨勢。QK2502（HR）接種后1、3、7 d 葉片SOD 活性均高于未接種幼苗，且達到極顯著水平（P＜0.01），增加率分別為4.43%、4.48%、10.51%。QG70（R）接種后3、7 d 葉片SOD 活性均極顯著高于未接種幼苗，增加率分別為4.58%、3.09%。LQ66（MR）和B02（HS）接種后幼苗葉片SOD 活性與未接種幼苗相比均有差異，但未達到顯著水平（P＜0.05）。QG50（S）接種后3、5、7 d 葉片SOD 活性均顯著低于未接種幼苗，增加率分別為－5.14%、－10.99%、－12.58%。

表3 接種黑腐病菌對葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

比較5 個甘藍材料可知，接種比未接種幼苗葉片SOD 活性增加率表現(xiàn)為：第1 天增加率由高到低依次為B02（HS）、QK2502（HR）、QG50（S）、LQ66（MR）、QG70（R）；第3 天增加率由高到低依次為QG70（R）、QK2502（HR）、LQ66（MR）、B02（HS）、QG50（S）；第5 天增加率由高到低依次為QK2502（HR）、QG70（R）、B02（HS）、LQ66（MR）、QG50（S）；第7 天增加率由高到低依次為QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、B02（HS）、QG50（S）。

2.4 接種黑腐病菌對不同抗性甘藍材料葉片PAL活性的影響

由表4 可知，接種黑腐病菌后，5 個材料幼苗葉片PAL 活性表現(xiàn)出不同變化，增加率表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。QK2502（HR）在接種后1、3、5、7 d 葉片PAL 活性均高于未接種幼苗，且達到極顯著水平（P＜0.01），增加率分別為12.48%、12.09%、9.43%、6.12%。QG70（R）在接種后1、3 d 葉片PAL 活性均極顯著高于未接種幼苗，增加率分別為9.40%、6.11%；接種后5、7 d 葉片PAL 活性均高于未接種幼苗，但未達到顯著水平（P＜0.05）。LQ66（MR）在接種后1、3 d 葉片PAL 活性均高于未接種幼苗，且達到極顯著水平（P＜0.01），增加率分別為6.06%、4.38%；接種后7 d 葉片PAL 活性顯著低于未接種幼苗，增加率為－4.50%。QG50（S）在接種后1 d 葉片PAL 活性極顯著高于未接種幼苗；接種后3、7 d葉片PAL 活性均低于未接種幼苗，且達到極顯著水平（P＜0.01）。B02（HS）在接種后1 d 葉片PAL 活性高于未接種幼苗，但差異不顯著（P＜0.05）；接種后3、5、7 d 葉片PAL 活性均顯著低于未接種幼苗，且第3、7 天差異均達到極顯著水平（P＜0.01）。

表4 接種黑腐病菌對葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

比較5 個甘藍材料可知，在接種后1、3、5、7 d，接種比未接種幼苗葉片PAL 活性增加率由高到低為QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、QG50（S）、B02（HS）。

3 討論與結(jié)論

根系生長狀況對植物生長起直接作用，關于抗病性和根系生理生化情況變化之間的關系已有學者作了大量研究。邵金旺等（2001）［19］研究甜菜叢根病不同抗性品種根系活力發(fā)現(xiàn)，抗病品種的根系活力明顯高于感病品種。吳曉麗等（2011）對接種黑腐病菌后花椰菜根系的形態(tài)和生理變化進行研究發(fā)現(xiàn)，接種處理的植株根長、根干重明顯比未接種的植株（CK）低，但是接種幼苗的根系活力比未接種幼苗的根系活力高。本試驗結(jié)果表明，接種黑腐病菌的幼苗根長和根系鮮重明顯低于未接種幼苗，且抗病品種的根長和根系鮮重降低率低于感病品種；而根系活力則相反，經(jīng)過接種的幼苗根系活力高于未接種幼苗，且抗病品種的根系活力增加率高于感病品種。這可能是由于黑腐病菌侵染植株，根系生長受到抑制，導致根長和根系鮮重小于未接種植株，抗病品種的防御能力較感病品種強，故抗病品種的根長和根系鮮重降幅小于感病品種；病原菌侵染，植物會啟動防御機制，根系也會發(fā)生一系列保護性反應，植株根系對于病原菌的防御能力增強，從而出現(xiàn)根系活力升高，且抗病品種根系活力升高幅度高于感病品種的現(xiàn)象。在第7 天，B02（HS）根系活力低于未接種植株，可能是由于此時植株的保護機制已經(jīng)被破壞。

過氧化物酶（POD）雖無直接的抗菌活性，但其可以通過影響植物體內(nèi)的多種代謝途徑而在抗病性中起到間接作用。當植物受到病原菌侵染時，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，SOD 是清除活性氧的主要酶之一。苯丙烷類代謝途徑是植物在抗病反應體系中的一個重要途徑，而苯丙氨酸解氨酶是該途徑的關鍵酶和限速酶［20］。已有學者對抗病性與POD活性、SOD 活性、PAL 活性的關系進行了研究。吳應海等（2022）［21］研究發(fā)現(xiàn)，為百香果接種莖基腐病后，植物體內(nèi)POD 活性、SOD 活性、PAL 活性均有升高，且抗病性越強酶活性越高。黃志磊等（2019）［22］研究表明，不同抗性大麥品種在受到葉斑病菌侵害時POD 活性、SOD 活性、PAL 活性均升高并且隨著時間延長增幅逐漸增加，且抗病品種蒙啤麥3 號升高幅度均大于感病品種蒙啤麥1 號。本研究對QK2502、QG70、LQ66、QG50、B02 這5 個抗性不同的甘藍品種接種黑腐病菌后，葉片POD 活性均不同程度增加，其中從第3 天開始抗病品種的增加率均高于感病品種，由高到低依次為QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、QG50（S）、B02（HS）；SOD 活性增加率表現(xiàn)出先升高（1、3 d）后降低（5 d）再升高（7 d）的趨勢，QG50（S）表現(xiàn)出先升高（1 d）后降低（3、5、7 d）的趨勢。接種初期，抗病性與SOD 活性變化率之間沒有表現(xiàn)出較強的相關性，但隨著時間推移，抗病品種的SOD 活性增加率普遍高于感病品種，與其他學者的研究相吻合。葉片POD 活性、SOD 活性增加可能是植株為了抵抗黑腐病菌侵害產(chǎn)生的保護性反應，從而增加植株對黑腐病菌的抵抗能力，抗病品種的抵抗力較感病品種強，體現(xiàn)在POD 活性、SOD 活性增加率上則為抗病品種高于感病品種。PAL 活性表現(xiàn)為抗病品種普遍高于感病品種，與其他學者研究一致。接種后第1 天，無論是抗病還是感病品種，PAL活性增加率均達到峰值，之后開始下降，PAL 活性增加率與抗病性呈明顯正相關，但3、5、7 d 的QG50、B02 以及7 d 的LQ66 葉片PAL 活性低于對照，這可能是由于植株自身的防御系統(tǒng)被病原菌破壞所導致。

綜上，接種黑腐病菌后導致甘藍幼苗根系生長緩慢，根長和根系鮮重增加較慢，均低于未接種植株，且抗病品種受病原菌侵染的影響小于感病品種；根系活力相反，病原菌侵染會使根系活力提高，且抗病品種根系活力增加率高于感病品種。接種黑腐病菌后，植株的防御機制啟動，POD 活性、SOD活性和PAL 活性升高，且抗病品種酶活性增加率普遍高于感病品種。因此，根長、根系鮮重、根系活力、葉片POD 活性、葉片SOD 活性、葉片PAL 活性可以作為甘藍抗黑腐病種質(zhì)資源鑒定的輔助指標。