肝泰舒膠囊的成分鑒別及指標(biāo)成分含量測(cè)定方法建立 Δ

王曉麗，朱 平，周燕妮，鮑蕾蕾 （海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，上海 200438）

肝泰舒膠囊是根據(jù)藏醫(yī)藥名著《四部醫(yī)典》《晶珠本草》及相關(guān)藏醫(yī)藥傳統(tǒng)名方研發(fā)而成[1]。該藥由獐牙菜、唐古特烏頭、山苦荬、小檗皮、節(jié)裂角茴香、木香、黃芪、甘草8味藏藥材組成。方中獐牙菜為君藥，具有清熱利濕解毒的功效，芒果苷和齊墩果酸為其主要成分，具有改善脂肪肝、抑制肝纖維化和減輕急性肝損傷等作用[2—5]。唐古特烏頭、山苦荬、小檗皮、節(jié)裂角茴香同為臣藥，具有清熱利濕解毒和祛瘀通絡(luò)的功效，其中山苦荬的有效成分木犀草苷、小檗皮的有效成分小檗堿還對(duì)非酒精性脂肪肝具有較好的保護(hù)作用，可有效減輕肝纖維化、抗肝癌[6—8]。木香、黃芪為佐藥，具有甘溫益氣的功效，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，其中木香的有效成分木香烴內(nèi)酯可抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷與脂肪變性、抑制急性肝損傷[9—10]。甘草調(diào)和諸藥，兼以補(bǔ)中扶土為使藥，其有效成分甘草酸具有顯著的保肝、抗肝癌、治療丙型病毒性肝炎等作用[11]。諸藥共奏清熱解毒、疏肝利膽的功效[12—14]。臨床研究表明，肝泰舒膠囊可誘生內(nèi)源性干擾素，抑制乙型病毒性肝炎病毒復(fù)制，增加膽汁分泌，消除膽道炎癥，減輕肝纖維化，修復(fù)受損肝細(xì)胞，對(duì)乙型病毒性肝炎、急性肝炎、早中期肝硬化、膽囊炎等肝膽疾病有顯著療效[13—16]。

肝泰舒膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10133（ZD-0133）-2002-2012Z。該標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)獐牙菜、節(jié)裂角茴香、小檗皮和木香進(jìn)行了薄層鑒別，也僅采用薄層掃描法對(duì)獐牙菜進(jìn)行含量測(cè)定（以齊墩果酸計(jì)）。雖然，郭珊珊等[17]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定了肝泰舒膠囊中獐牙菜苦苷的含量；楊鳳梅等[18]對(duì)肝泰舒膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，但這些研究的指標(biāo)成分單一且方法專屬性和靈敏度不高。由于中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，藥效往往是多種成分相互作用的結(jié)果，單一成分難以全面反映制劑的質(zhì)量，加之目前關(guān)于肝泰舒膠囊物質(zhì)基礎(chǔ)的研究較少，因此，明確肝泰舒膠囊的化學(xué)成分并進(jìn)行質(zhì)量控制對(duì)確保臨床用藥的安全性和有效性具有重要意義?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合?飛行時(shí)間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry，HPLC-TOF/MS）技術(shù)鑒別了肝泰舒膠囊中的化學(xué)成分，并采用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)測(cè)定了肝泰舒膠囊中甘草酸、芒果苷、木犀草苷、木香烴內(nèi)酯、齊墩果酸、小檗堿6種指標(biāo)成分的含量，旨在為肝泰舒膠囊的質(zhì)量控制及體內(nèi)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Agilent 1100 型HPLC儀、Agilent 1290 型UPLC 儀、Agilent 6220 型高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、Agilent 6470型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司），125D-1CN 型十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司），ST-40R 型低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Vortex-5 型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），PW-UV/VF型超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），SB3200-T型超聲機(jī)[必能信超聲（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

甘草酸對(duì)照品（批號(hào)Y02J11L113432）、芒果苷對(duì)照品（批號(hào)C21M9Y61363）、木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)A22GB141264）、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)J22GB152180）、齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)J24HB174960）、小檗堿對(duì)照品（批號(hào)S01A10K94340）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98.0%；甲苯磺丁脲（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)I1820190，純度＞99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肝泰舒膠囊（批號(hào)01211202、01220701、01220704，規(guī)格為每粒裝0.4 g）購自青海晶珠藏藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)股份有限公司；乙腈、甲酸均為質(zhì)譜純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取甘草酸、芒果苷、木犀草苷、木香烴內(nèi)酯、齊墩果酸、小檗堿對(duì)照品各2.0 mg，分別置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶解混勻，制成上述成分質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL 的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取上述各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇制成各成分質(zhì)量濃度均為10 000 ng/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇按1、2.5、5、10、25、50 倍稀釋，得質(zhì)量濃度分別為10 000 、4 000、2 000、1 000、400、200 ng/mL的系列混合對(duì)照品溶液。同法制備質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.2 供試品溶液

精密稱取肝泰舒膠囊粉末1 g（過40 目篩），置于100 mL 燒瓶中，加50%甲醇50 mL，超聲（功率2.0 kW，頻率50 kHz）處理30 min，放至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜，濾過，取續(xù)濾液，加甲醇稀釋20倍，即得供試品溶液。

2.2 試驗(yàn)條件

2.2.1 色譜條件

以Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）為色譜柱，乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（成分鑒別：0～5 min，5%A→15%A；5～15 min，15%A→35%A；15～25 min，35%A→70%A；25～35 min，70%A。含量測(cè)定：0～3.5 min，10%A→90%A；3.5～5 min，90%A）；流速為0.5 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為3 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件

（1）成分鑒別的質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）以正負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓為4 000 V（+）/3 500 V（-）；干燥氣溫度為350 ℃；干燥氣流速為10 L/min；霧化器壓力為40 psi；碎片電壓為180 V；掃描范圍為m/z100～1 100。

（2）含量測(cè)定的質(zhì)譜條件為：采用噴射流技術(shù)的電噴霧離子源（electrospray ionization with Agilent jet stream technology，AJST-ESI）以正負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓為4 000 V（+）/3 500 V（-）；干燥氣溫度為350 ℃；干燥氣流速為10 L/min；霧化器壓力為40 psi；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流速為11 L/min。在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）正離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)為：甘草酸m/z823.0→453.0，碎片電壓為166 V，碰撞能量為25 eV；芒果苷m/z423.0→273.0，碎片電壓為123 V，碰撞能量為25 eV；木犀草苷m/z449.0→287.0，碎片電壓為123 V，碰撞能量為25 eV；木香烴內(nèi)酯m/z233.0→187.0，碎片電壓為118 V，碰撞能量為13 eV；小檗堿m/z337.0→321.0，碎片電壓為146 V，碰撞能量為33 eV；內(nèi)標(biāo)m/z271.0→91.0，碎片電壓為90 V，碰撞能量為37 eV。在MRM負(fù)離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)為：齊墩果酸m/z455.4→407.3，碎片電壓為100 V，碰撞能量為60 eV；內(nèi)標(biāo)m/z269.0→169.0，碎片電壓為108 V，碰撞能量為17 eV。

2.3 化學(xué)成分鑒別分析

2.3.1 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

參考TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、ChemSpider（http：//www.chemspider.com）數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，共收集到181 種肝泰舒膠囊的核心化學(xué)成分。采用Agilent “formula-database generator”軟件建立化學(xué)成分鑒別數(shù)據(jù)庫，信息包括化合物名稱、化合物類別、分子式、分子量、準(zhǔn)分子離子峰等。

2.3.2 肝泰舒膠囊的總離子流圖

取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)01211202），按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，得樣品溶液的總離子流圖（圖1）。根據(jù)飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)得精確分子量和各成分峰的離子信息，與“2.3.1”項(xiàng)下所建數(shù)據(jù)庫對(duì)比后，再應(yīng)用Qualitative Analysis 質(zhì)譜分析軟件計(jì)算分子組成及同位素分布，將理論值與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比對(duì)，選取誤差小于5 ppm的化合物。結(jié)果顯示，肝泰舒膠囊中初步鑒別出41種化學(xué)成分，正離子模式下鑒別出37種化學(xué)成分，負(fù)離子模式下鑒別出23種化學(xué)成分，主要包括芒果苷、漢黃芩素、木犀草苷等黃酮類成分，小檗堿、阿替新、直立角茴香堿等生物堿類和其他成分。結(jié)果見表1。

圖1 肝泰舒膠囊的總離子流圖

2.3.3 化合物鑒別

以保留時(shí)間為11.54 min 的化合物16 為例，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為285.076 4[M+H]+，負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為283.063 1[M-H]-，利用Qualitative Analysis 質(zhì)譜分析軟件計(jì)算精確分子量的可能元素組成（誤差＜5 ppm），推算分子式為C16H12O5，經(jīng)與“2.3.1”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫中已知化合物對(duì)比，確定該化合物為漢黃芩素。結(jié)果見圖2。

圖2 漢黃芩素的精確質(zhì)量棒狀圖

2.3.4 化合物的同位素分布驗(yàn)證

以保留時(shí)間為11.54 min的漢黃芩素為例，其分子式為C16H12O5，利用Qualitative Analysis 質(zhì)譜分析軟件計(jì)算正負(fù)離子模式下的同位素分布情況，并與實(shí)際分子量進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，漢黃芩素的同位素分布理論值（方框所示）與實(shí)際值（方框內(nèi)峰所示）吻合良好，確定16號(hào)峰為漢黃芩素。結(jié)果見圖3。

圖3 漢黃芩素的同位素分布圖

2.4 甘草酸等6種指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.4.1 專屬性考察

取空白溶液（甲醇）、“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL）、“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，甘草酸、芒果苷、木犀草苷、木香烴內(nèi)酯、齊墩果酸、小檗堿和內(nèi)標(biāo)（負(fù)離子模式）、內(nèi)標(biāo)（正離子模式）的保留時(shí)間分別為2.1、1.2、1.5、3.4、4.5、2.0、2.6、2.6 min，無雜峰干擾，理論板數(shù)均大于8 000，相鄰峰的分離度均大于1.5，脫尾因子為0.95～1.05。結(jié)果見圖4。

圖4 混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液的UPLCMS/MS圖

2.4.2 線性關(guān)系考察

取“2.1.1”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 甘草酸等6種指標(biāo)成分的回歸方程和線性范圍

2.4.3 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度200 ng/mL），用甲醇逐級(jí)稀釋，以信噪比10∶1 計(jì)算定量限，信噪比3∶1計(jì)算檢測(cè)限。結(jié)果顯示，甘草酸、芒果苷、木犀草苷、木香烴內(nèi)酯、齊墩果酸、小檗堿的定量限分別為200、20、10、1、10、0.5 ng/mL，檢測(cè)限分別為100、10、5、0.5、5、0.25 ng/mL。

2.4.4 精密度試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度1 000 ng/mL），于1 d 內(nèi)按“2.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6 次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d考察日間精密度。結(jié)果顯示，甘草酸等6 種指標(biāo)成分日內(nèi)、日間精密度的RSD 均小于5.0%（n＝6或n＝3），表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)01211202）1 g，共6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，甘草酸等6種指標(biāo)成分含量的RSD均小于5.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)01211202），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，甘草酸等6種指標(biāo)成分峰面積的RSD 均小于5.0%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 耐用性試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)01211202），按“2.2”項(xiàng)下條件分別考察不同流速（0.29、0.3、0.31 mL/min）、流動(dòng)相中乙腈初始比例（9%、10%、11%）、柱溫（23、25、27 ℃）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，甘草酸等6 種指標(biāo)成分峰面積及保留時(shí)間的RSD均小于10.0%，分離度和拖尾因子等均符合方法學(xué)要求[19]，表明本方法耐用性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)01211202）0.5 g，共6份，分別加入一定量的對(duì)照品溶液（樣品中各成分含量的100%），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，甘草酸、芒果苷、木犀草苷、木香烴內(nèi)酯、齊墩果酸和小檗堿的平均加樣回收率分別為100.32%、100.00%、100.64%、100.17%、99.05%、101.08%，RSD 均小于2.0%（n＝6），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.9 樣品的含量測(cè)定

取3批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，每樣品測(cè)定3次。結(jié)果見表3。

表3 甘草酸等6 種指標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3，mg/g）

表3 甘草酸等6 種指標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3，mg/g）

批號(hào)01211202 01220701 01220704甘草酸2.42±0.05 2.66±0.03 2.64±0.03芒果苷0.85±0.01 1.16±0.01 1.08±0.01木犀草苷0.35±0.01 0.46±0.01 0.42±0.02木香烴內(nèi)酯6.18±0.06 6.41±0.06 6.46±0.08齊墩果酸0.99±0.03 1.29±0.02 1.22±0.02小檗堿5.22±0.03 5.51±0.05 5.56±0.03

3 討論

3.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

本課題組前期對(duì)不同提取溶劑（水、甲醇、乙醇）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，以50%甲醇為提取溶劑時(shí)，各成分的提取率較高。同時(shí)，筆者對(duì)不同溶劑體積（30、40、50 mL）、提取時(shí)間（15、30、45 min）、提取次數(shù)（1、2、3次）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，以50%甲醇 50 mL，超聲提取30 min，提取1次時(shí)，所得色譜峰信息較多，提取充分且操作簡單。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本課題組前期對(duì)不同流動(dòng)相（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，加入0.1%甲酸溶液可以顯著改善各色譜峰峰形和拖尾現(xiàn)象，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，各成分分離良好，響應(yīng)較高，且峰形最佳，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相。本研究采用了Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）色譜柱，該色譜柱的內(nèi)徑更窄、粒徑更小，同時(shí)對(duì)不同流速（0.4、0.5、0.6 mL/min）考察后，結(jié)果顯示，流速為0.5 mL/min時(shí)的柱壓相對(duì)較低，分離度良好，故選擇流速為0.5 mL/min。

3.3 化學(xué)成分鑒別結(jié)果分析

本研究采用HPLC-TOF/MS技術(shù)從肝泰舒膠囊中共鑒別出41種化學(xué)成分，較已有研究，除齊墩果酸、獐牙菜苦苷、小檗堿和芒果苷4種成分有報(bào)道外，木犀草苷、甘草苷、直立角茴香堿等37種成分均為首次鑒別。該結(jié)果為肝泰舒膠囊的藥理作用研究奠定了基礎(chǔ)。

3.4 含量結(jié)果分析

不同批次肝泰舒膠囊中各成分含量存在差異，批號(hào)01211202 樣品中各成分含量均低于其他2 批次樣品；3批樣品中均以木香烴內(nèi)酯和小檗堿含量較高，木犀草苷含量最低。究其原因可能為中藥材來源復(fù)雜、生產(chǎn)工藝不同、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善等。這提示，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)中藥制劑的基礎(chǔ)性研究，完善質(zhì)量控制評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，逐步實(shí)現(xiàn)中藥制劑質(zhì)量均一穩(wěn)定，保證臨床用藥的安全性和有效性。

綜上所述，本研究所建立的鑒別和含量測(cè)定方法快速、簡便，可用于肝泰舒膠囊化學(xué)成分的鑒別和指標(biāo)成分的含量測(cè)定。