阿托伐他汀對人胃癌AGS 細(xì)胞增殖、自噬和糖代謝的影響及機(jī)制 Δ

孫祥瑞 ，崔晨玲 ，王 畏 ，汪慶飛 （.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 33000；.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 33000）

胃癌是全世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一。2022年全國最新癌癥報告顯示，胃癌在我國的發(fā)病率僅次于肺癌和結(jié)直腸癌，對我國人民的身心健康造成極大威脅[1]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多因素共同作用的結(jié)果，研究認(rèn)為，抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為是胃癌外科治療的重要基礎(chǔ)[2]。糖酵解是腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)的主要途徑，可為腫瘤細(xì)胞提供增殖所需的能量及必需的氨基酸等合成原料，抑制糖酵解可阻滯胃癌細(xì)胞快速增殖及遷移[3]。自噬是細(xì)胞程序性死亡的一種類型，研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞自噬可有效抑制胃癌的進(jìn)展[4]。因此，尋找有效降低胃癌細(xì)胞糖酵解水平及促進(jìn)胃癌細(xì)胞自噬的手段對抑制胃癌的發(fā)展尤為重要。

阿托伐他汀屬于他汀類藥物。Shen等[5]通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可顯著抑制子宮肌瘤的生長，但對胃癌細(xì)胞的影響尚不明確。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（又稱Akt）信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長、增殖與凋亡等生物學(xué)行為的重要信號通路，已被證實與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制及凋亡促進(jìn)的作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號通路相關(guān)[7]。但是阿托伐他汀是否可通過PI3K/Akt 信號通路來影響胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為尚未可知。本研究探討了阿托伐他汀對人胃癌AGS細(xì)胞增殖、自噬及糖代謝的影響，以及PI3K/Akt 信號通路在其中發(fā)揮的作用，以期為阿托伐他汀在胃癌治療中的作用研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BDS400型倒置熒光顯微鏡（北京賽百奧科技有限公司）、HWO301型CO2培養(yǎng)箱（美國Forma 公司）、MultiskanAscent 型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、OI1000 型凝膠成像系統(tǒng)（廣州光儀生物科技有限公司）、BBS-V500 型超凈工作臺（濟(jì)南卓隆生物技術(shù)有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

阿托伐他汀對照品（批號B09A7R12611）、5-氟尿嘧啶對照品（批號M17GS148678）、PI3K/Akt 信號通路抑制劑LY294002（批號J05GS150604）、激活劑SC79（批號F08J11F115126）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均不低于98%；胎牛血清（FBS）和F-12K 培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；1%青-鏈霉素、4%多聚甲醛、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸-吐溫（TBST）均購自北京索萊寶生物科技公司；CCK-8 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（批號C6205060）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；葡萄糖含量檢測試劑盒（批號012522220602）、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號092321220429）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸含量檢測試劑盒（批號ATVG20031）購自亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購自美國ABW公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白試劑盒（英國Abcam公司）；兔源自噬相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅰ（light chain 3Ⅰ，LC3Ⅰ）、LC3Ⅱ抗體（批號分別為00109445、00109011）及鼠源Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 二抗（批號分別為10022173、10022023、10017175、10010983、10021787、20000374）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞株

人胃癌AGS細(xì)胞購自上海酶研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

AGS細(xì)胞接種于含10% FBS、1%青-鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后生長密度達(dá)到80%時傳代，選取第4代對數(shù)期生長細(xì)胞用于實驗。

2.2 分組與給藥

選取第4 代對數(shù)期生長的AGS 細(xì)胞，調(diào)整密度至2×105個/mL，接種到96 孔板中，每孔100 μL。實驗分為預(yù)實驗和正式實驗。預(yù)實驗分為對照組和低、中、高濃度實驗組；對照組不做干預(yù)，低、中、高濃度實驗組分別加入12.5、25、50 μmol/L 阿托伐他汀[8]，干預(yù)24 h。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，為避免細(xì)胞死亡過多影響實驗，選擇有顯著抑制作用的25 μmol/L 阿托伐他汀（結(jié)果詳見“3.1”）進(jìn)行正式實驗。正式實驗分為對照組、阿托伐他汀組、陽性對照組、抑制劑組和激活劑組；對照組不做干預(yù)，阿托伐他汀組加入25 μmol/L阿托伐他汀，陽性對照組加入50 mg/L 5-氟尿嘧啶[9]，抑制劑組加入25 μmol/L阿托伐他汀和10 μmol/L PI3K/Akt 信號通路抑制劑LY294002[10]，激活劑組加入25 μmol/L 阿托伐他汀和10 μmol/L PI3K/Akt 信號通路激活劑SC79[11]，干預(yù)24 h，每組設(shè)3個復(fù)孔。

2.3 測定指標(biāo)

2.3.1 細(xì)胞活力檢測

按“2.2”項下預(yù)實驗分組、給藥，另設(shè)只含生長培養(yǎng)基不含細(xì)胞的空白組，藥物干預(yù)24 h 后，加入10 μL CCK-8溶液，2 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各組的光密度（optical density，OD），每組檢測3次，計算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力＝（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

2.3.2 AGS細(xì)胞中糖代謝的檢測

按“2.2”項下正式實驗分組、給藥，干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融進(jìn)行裂解，取裂解液于4 ℃下12 000×g離心10 min，收集上清液，分別按照葡萄糖和乳酸含量試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定細(xì)胞中葡萄糖和乳酸的含量。

2.3.3 AGS細(xì)胞的增殖能力檢測

采用EdU 法進(jìn)行檢測。按“2.2”項下正式實驗分組、給藥，干預(yù)24 h 后，收集細(xì)胞，按照EdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書用EdU 標(biāo)記細(xì)胞后，棄培養(yǎng)液，用甲醛固定15 min，用含3% BSA的磷酸鹽緩沖液（下同）洗滌3次；用Triton X-100 通透10 min，再洗滌3 次；加入200 μL Click 反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min，再洗滌3 次；每孔加入0.5 mL Hoechst，反應(yīng)10 min，再洗滌3 次，裝片。用熒光顯微鏡觀察并拍照，使用Image J 1.8.1 軟件處理圖片，以EdU陽性染色細(xì)胞占總細(xì)胞的比例表示細(xì)胞增殖率。

2.3.4 AGS 細(xì)胞自噬及PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測

采用蛋白免疫印跡法進(jìn)行檢測。按“2.2”項下正式實驗分組、給藥，干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解，離心；取上清液，提取蛋白，定量后上樣，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜；加入5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入一抗（LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、β-actin 稀釋比例分別為1∶ 2 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶5 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000），4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌3次后，加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），孵育2 h后棄液，用TBST洗滌3次，加顯影液，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。用Image J 1.8.1 軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（β-actin）的灰度值比值為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，并以p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值評價PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平。試驗重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 阿托伐他汀對AGS細(xì)胞活力的影響

對照組和低、中、高濃度實驗組細(xì)胞活力分別為（100.00±4.91）%、（89.66±5.01）%、（50.16±4.82）%、（36.41±5.35）%（n＝3）。與對照組相比，低濃度實驗組細(xì)胞活力無明顯變化，中、高濃度實驗組細(xì)胞活力均顯著降低（P＜0.05）。

3.2 阿托伐他汀對AGS細(xì)胞糖代謝的影響

與對照組相比，阿托伐他汀組與陽性對照組細(xì)胞中葡萄糖和乳酸含量均顯著降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀組相比，抑制劑組細(xì)胞中葡萄糖和乳酸含量均顯著降低（P＜0.05），激活劑組細(xì)胞中葡萄糖和乳酸含量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 阿托伐他汀對AGS細(xì)胞糖代謝的影響（n＝3）

3.3 阿托伐他汀對AGS細(xì)胞增殖能力的影響

與對照組相比，阿托伐他汀組與陽性對照組細(xì)胞增殖率均顯著降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀組相比，抑制劑組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），激活劑組細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 阿托伐他汀對AGS細(xì)胞增殖能力影響的顯微圖（×10）

圖3 阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞增殖能力的影響（n＝3）

3.4 阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，阿托伐他汀組和陽性對照組細(xì)胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與阿托伐他汀組相比，抑制劑組細(xì)胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），激活劑組細(xì)胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

3.5 阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞中PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，阿托伐他汀組和陽性對照組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值均顯著降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀組相比，抑制劑組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值均顯著降低（P＜0.05），激活劑組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖5。

圖5 阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞中PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討論

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，國內(nèi)外治療胃癌的手段主要以手術(shù)為主，放化療為輔，但多數(shù)胃癌患者就診時已處于中晚期，無法接受根治性手術(shù)，而放化療在治療的同時也會對人體其他器官造成較大危害。因此，探尋有效的治療藥物一直是醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點。阿托伐他汀是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的他汀類降脂藥之一，其療效穩(wěn)定，臨床證據(jù)充分[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞的增殖[7，13]。本研究用不同濃度阿托伐他汀干預(yù)人胃癌AGS細(xì)胞的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入25、50 μmol/L阿托伐他汀后細(xì)胞活力顯著降低，提示25、50 μmol/L阿托伐他汀能有效抑制AGS細(xì)胞的活力，但為了避免細(xì)胞死亡過多而影響實驗，本研究選擇25 μmol/L 阿托伐他汀進(jìn)行后續(xù)實驗。

自噬是一種細(xì)胞自我降解的過程，可通過降解、回收未折疊及老化的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，通常情況下腫瘤細(xì)胞的自噬較正常細(xì)胞降低[14]。有研究顯示，阿托伐他汀可通過誘導(dǎo)抑制宮頸癌細(xì)胞自噬來抑制腫瘤進(jìn)展[13]。本研究進(jìn)一步考察了阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞糖代謝、增殖和自噬的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入25 μmol/L 阿托伐他汀后，AGS 細(xì)胞中葡萄糖和乳酸含量、細(xì)胞增殖率均顯著低于對照組，而LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組，提示阿托伐他汀可抑制AGS細(xì)胞的糖代謝和增殖，促進(jìn)細(xì)胞自噬。

PI3K/Akt信號通路是經(jīng)典的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的重要信號通路，隨著對PI3K/Akt信號通路研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該通路參與并調(diào)控了胃癌的發(fā)展進(jìn)程[15]。崔穎等[7]發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過上調(diào)miR-146a 來阻斷PI3K/Akt信號通路，可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性行為并誘導(dǎo)其凋亡。本研究通過應(yīng)用PI3K/Akt 信號通路抑制劑LY294002 和激動劑SC79 驗證了阿托伐他汀抑制AGS細(xì)胞的糖代謝和增殖，促進(jìn)細(xì)胞自噬與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LY294002能進(jìn)一步加強(qiáng)阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞糖代謝和增殖的抑制作用以及對自噬的促進(jìn)作用，SC79 能逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞糖代謝、增殖及自噬的上述作用，提示阿托伐他汀抑制AGS細(xì)胞的糖代謝和增殖，促進(jìn)細(xì)胞自噬的作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號通路相關(guān)。

綜上所述，阿托伐他汀可抑制人胃癌AGS細(xì)胞的糖代謝和增殖，促進(jìn)細(xì)胞自噬，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號通路相關(guān)。本研究的局限性為：僅在細(xì)胞水平初步探討了阿托伐他汀對AGS 細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，后續(xù)可進(jìn)行體內(nèi)試驗驗證，為胃癌的基礎(chǔ)研究提供新的思路與參考。