尖孢鐮刀菌cox1 基因的克隆與生物信息學(xué)分析

田雨純 趙 丹

（晉中信息學(xué)院，山西太谷 030800）

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為白色氣生菌絲，是植物枯萎病菌的病原菌，是一種土傳病原性真菌，具有致病力強(qiáng)、致病范圍廣等特點(diǎn)[1]。從初發(fā)到大面積泛濫只需2～3年，發(fā)病率通常為10%～30%，病情嚴(yán)重的年份發(fā)病率可達(dá)50%，嚴(yán)重影響植株果實(shí)產(chǎn)量，甚至還會導(dǎo)致絕收[2]。研究尖孢鐮刀菌內(nèi)部主要成分，并針對性地研制相關(guān)藥物抑制病菌生長成為了刻不容緩的任務(wù)。cox1（細(xì)胞色素c 氧化酶第I 亞基）是呼吸復(fù)合物IV 的3 個(gè)線粒體DNA（mtDNA）編碼的亞基（MTCO1，MTCO2，MTCO3）中的1 個(gè)，它從還原的細(xì)胞色素c中收集電子，并將電子轉(zhuǎn)移到氧氣中以產(chǎn)生水，釋放的能量用于跨線粒體內(nèi)膜傳輸質(zhì)。

生物信息學(xué)（Bioinformatics）是一門新興的交叉學(xué)科，綜合運(yùn)用了生物學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和工程學(xué)。它可以應(yīng)用各種數(shù)據(jù)庫解釋生命科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的海量數(shù)據(jù)，所以被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)中的各個(gè)領(lǐng)域[9]。生物信息學(xué)以互聯(lián)網(wǎng)為媒介、數(shù)據(jù)庫為載體，利用數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)對生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲、檢索和處理分析，并進(jìn)一步挖掘和解讀生物學(xué)數(shù)據(jù)，是一門理論概念與實(shí)踐應(yīng)用并重的學(xué)科[10]。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)相關(guān)知識，對尖孢鐮刀菌cox1基因及蛋白的理化性質(zhì)、信號肽、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行預(yù)測和分析，以期為植物保護(hù)病菌抑制領(lǐng)域提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 序列檢索

在NCBI 中進(jìn)行BLAST 分析，檢索尖孢鐮刀菌cox1基因序列及其編碼蛋白序列。茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮刀菌（Fusarium culmrum）、輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillium）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、古巴假霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis）及稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae）cox1基因及蛋白序列從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中獲得。

1.2 生物信息分析方法

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析（https：//web.expasy.org/protparam）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析（https：//prosite.expasy.org）、蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測（https：//web.expasy.org/protscale）、蛋白質(zhì)跨膜預(yù)測（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）、蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1）、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（https：//predictprotein.org）以及蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（https：//swissmodel.expasy.org）。

預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)利用TMHMM 軟件，信號肽預(yù)測工具利用Signal P 軟件，蛋白同源性比對利用NCBI 中的BLAST X 程序，蛋白序列比對分析利用DNA MAN軟件，蛋白進(jìn)化樹繪制MEGA7軟件，蛋白理化性質(zhì)分析利用Protparam工具。

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

尖孢鐮刀菌總RNA 經(jīng)傳統(tǒng)Trizol 法提取，照Takara Reverse Transcription System 說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物用ddH2O 稀釋10 倍，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 尖孢鐮刀菌cox1基因CDS區(qū)克隆

采用PCR的方法克隆尖孢鐮刀菌cox1基因CDS區(qū)，引物序列得F：GCATAATGGGTCACCAAGTT R：CGCTCTGTTACGAGGTCAT，片段總長度為15 593 bp，退火溫度為51.9 ℃。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：PCR MasterMix 10 μL，F(xiàn)orward/ReversePrimer（10 pmol/μL）各0.5 μL，Template cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃3 min，94 ℃30 s，51.9 ℃30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1.5 min，4 ℃保存[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌cox1基因克隆

BLSAT檢索出尖孢鐮刀菌cox1基因長1 590 bp，共編碼530個(gè)氨基酸。尖孢鐮刀菌cox1基因CDS區(qū)克隆結(jié)果如圖1所示，符合預(yù)期。

圖1 尖孢鐮刀菌cox1基因電泳圖

2.2 尖孢鐮刀菌cox1蛋白質(zhì)的理化分析

利用生物信息分析軟件Protparam 對尖孢鐮刀菌cox1蛋白進(jìn)行理化分析，結(jié)果如表1所示。cox1蛋白的氨基酸數(shù)量為530個(gè)，其分子量為58 390.82 D、分子式為C2767H4174N648O698S22，cox1 蛋白的理論等電點(diǎn)PI為8.46。亮氨酸（Leu）含量最高，含有70個(gè)，占總氨基酸數(shù)的9.2%，甘氨酸（Gly）含有50個(gè)，占總氨基酸數(shù)的9.4%，異亮氨酸含有46 個(gè)，占總氨基酸數(shù)的8.7%，半胱氨酸（Cys）含量最低，僅含有1 個(gè)，占總氨基酸數(shù)的0.2%。

表1 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

2.3 尖孢鐮刀菌cox1蛋白信號肽分析

信號肽主要由三部分組成：n 區(qū)（n-region）為正電荷的氨基酸；疏水區(qū)（h-region）由9個(gè)及以上的中性氨基酸組成；加工區(qū)（c-region）是信號肽酶切割信號肽的部位[4]。使用在線網(wǎng)站SignalP4.1 Server預(yù)測cox1蛋白信號肽情況，具體結(jié)果如圖2所示，綜合評估推測cox1蛋白不存在信號肽，也不跨膜，在細(xì)胞質(zhì)中合成后，不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，直接在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中與代謝底物相作用，屬于非分泌型蛋白質(zhì)[5]。

圖2 尖孢鐮刀菌cox1蛋白質(zhì)信號肽

2.4 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的親疏水性分析

不同的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)極性不同，導(dǎo)致其組成的蛋白質(zhì)有一定的親/疏水性。通過在線分析網(wǎng)站對cox1 蛋白的疏水性進(jìn)行研究，如圖3 所示。橫軸表示的是氨基酸的位置，縱軸代表的是氨基酸平均疏水指標(biāo)，并且圖中的正值和負(fù)值分別表示的是疏水性和親水性，正值越大，表明疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越大，表明親水性越強(qiáng)[6]。結(jié)果表明，cox1蛋白的最大疏水值（即最小親水值）出現(xiàn)在第195位氨基酸，最小疏水值（即最大親水值）出現(xiàn)在第443位氨基酸，由親水性氨基酸和疏水性氨基酸的分布可知，肽鏈中疏水性氨基酸殘基數(shù)量明顯多于親水性氨基酸殘基，因此可以推測cox1 蛋白為疏水性蛋白。

圖3 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的疏水性分析

2.5 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測

通過在線網(wǎng)站預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，對尖孢鐮刀菌cox1蛋白進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖4）。橫軸表示的是氨基酸的位置，縱軸代表的是跨膜結(jié)構(gòu)的可能性[7]，圖4結(jié)果顯示，尖孢鐮刀菌cox1蛋白存在12個(gè)跨膜區(qū)域，因此可推測cox1蛋白為12層跨膜結(jié)構(gòu)蛋白。

圖4 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 尖孢鐮刀菌cox1蛋白序列比對與進(jìn)化分析

通過NCBI 查找發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌cox1 蛋白有530個(gè)氨基酸，用DNA MAN軟件把其氨基酸的序列與茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、稻瘟病菌、立枯絲核菌和稻平臍蠕孢cox1蛋白序列進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，不同生物物種cox1蛋白序列存在一定的序列一致性。圖5 所示是9 個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

圖5 9個(gè)物種cox1氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.7 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)作為一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的紐帶，對其預(yù)測可以為三級結(jié)構(gòu)和功能提供大量信息，如設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)突變體或確定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及功能[8]。

利用二級結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站得α-螺旋占比較多為55.66%，片狀結(jié)構(gòu)（β-折疊和β-轉(zhuǎn)角）為5.28%，無規(guī)則卷曲為39.06%，由此推斷，cox1 蛋白二級結(jié)構(gòu)中最主要結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋，此外無規(guī)則卷曲和片狀結(jié)構(gòu)分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中，且N-末端存在無規(guī)則卷曲形式，C-末端也存在無規(guī)則卷曲。

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是由多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上經(jīng)過進(jìn)一步盤繞、折疊形成的復(fù)雜三維構(gòu)象，這些二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，它們之間通過側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用借助次級鍵形成三級結(jié)構(gòu)。cox1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測通過網(wǎng)站建模得圖6，由圖可看出α-螺旋占主要結(jié)構(gòu)部分，無規(guī)則卷曲和片狀結(jié)構(gòu)分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖6 尖孢鐮刀菌cox1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 結(jié)論與討論

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對尖孢鐮刀菌cox1基因進(jìn)行克隆，并對cox1蛋白從理化性質(zhì)、信號肽、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行預(yù)測和分析。結(jié)果表明尖孢鐮刀菌cox1基因CDS 序列1 590 bp，編碼530 個(gè)氨基酸，cox1蛋白為堿性氨基酸，不存在信號肽，合成后就在核糖體處發(fā)揮作用，不存在運(yùn)輸，屬于非分泌型蛋白質(zhì)，疏水性較強(qiáng)，較穩(wěn)定，有明顯的跨膜現(xiàn)象。cox1蛋白二級結(jié)構(gòu)中α—螺旋占主要結(jié)構(gòu)部分，此外無規(guī)則卷曲和片狀結(jié)構(gòu)分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中，cox1 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果同樣證實(shí)了二級結(jié)構(gòu)成分含量的準(zhǔn)確性，與二級結(jié)構(gòu)結(jié)論相一致。cox1 蛋白在不同物種之間同源性較高，序列比對一致性較高，證明了該蛋白在同系同物種進(jìn)化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究結(jié)果為探究cox1蛋白的未知生物學(xué)功能提供了新思路，也為當(dāng)下植物保護(hù)領(lǐng)域、植物真菌病害的防治打下了一定理論基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)可研制更高效、低成本、對環(huán)境友好的綠色殺菌劑。