田雨純 趙 丹
(晉中信息學院,山西太谷 030800)
尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)為白色氣生菌絲,是植物枯萎病菌的病原菌,是一種土傳病原性真菌,具有致病力強、致病范圍廣等特點[1]。從初發(fā)到大面積泛濫只需2~3年,發(fā)病率通常為10%~30%,病情嚴重的年份發(fā)病率可達50%,嚴重影響植株果實產量,甚至還會導致絕收[2]。研究尖孢鐮刀菌內部主要成分,并針對性地研制相關藥物抑制病菌生長成為了刻不容緩的任務。cox1(細胞色素c 氧化酶第I 亞基)是呼吸復合物IV 的3 個線粒體DNA(mtDNA)編碼的亞基(MTCO1,MTCO2,MTCO3)中的1 個,它從還原的細胞色素c中收集電子,并將電子轉移到氧氣中以產生水,釋放的能量用于跨線粒體內膜傳輸質。
生物信息學(Bioinformatics)是一門新興的交叉學科,綜合運用了生物學、數(shù)學、計算機科學和工程學。它可以應用各種數(shù)據(jù)庫解釋生命科學研究中發(fā)現(xiàn)的海量數(shù)據(jù),所以被廣泛應用于生命科學中的各個領域[9]。生物信息學以互聯(lián)網(wǎng)為媒介、數(shù)據(jù)庫為載體,利用數(shù)學和計算機科學對生物學數(shù)據(jù)進行存儲、檢索和處理分析,并進一步挖掘和解讀生物學數(shù)據(jù),是一門理論概念與實踐應用并重的學科[10]。
本研究應用生物信息學相關知識,對尖孢鐮刀菌cox1基因及蛋白的理化性質、信號肽、親/疏水性、跨膜結構、蛋白質二級結構、蛋白質三級結構等方面進行預測和分析,以期為植物保護病菌抑制領域提供一定參考。
在NCBI 中進行BLAST 分析,檢索尖孢鐮刀菌cox1基因序列及其編碼蛋白序列。茄病鐮刀菌(Fusarium solani)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、黃色鐮刀菌(Fusarium culmrum)、輪枝鐮刀菌(Fusarium verticillium)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)及稻平臍蠕孢(Bipolaris oryzae)cox1基因及蛋白序列從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中獲得。
蛋白質理化性質分析(https://web.expasy.org/protparam)、蛋白質結構域分析(https://prosite.expasy.org)、蛋白質疏水性預測(https://web.expasy.org/protscale)、蛋白質跨膜預測(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)、蛋白質信號肽預測(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1)、蛋白質二級結構預測(https://predictprotein.org)以及蛋白質三級結構預測(https://swissmodel.expasy.org)。
預測蛋白跨膜結構利用TMHMM 軟件,信號肽預測工具利用Signal P 軟件,蛋白同源性比對利用NCBI 中的BLAST X 程序,蛋白序列比對分析利用DNA MAN軟件,蛋白進化樹繪制MEGA7軟件,蛋白理化性質分析利用Protparam工具。
尖孢鐮刀菌總RNA 經(jīng)傳統(tǒng)Trizol 法提取,照Takara Reverse Transcription System 說明書進行反轉錄。將反轉錄后的產物用ddH2O 稀釋10 倍,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
采用PCR的方法克隆尖孢鐮刀菌cox1基因CDS區(qū),引物序列得F:GCATAATGGGTCACCAAGTT R:CGCTCTGTTACGAGGTCAT,片段總長度為15 593 bp,退火溫度為51.9 ℃。PCR 反應體系共20 μL:PCR MasterMix 10 μL,F(xiàn)orward/ReversePrimer(10 pmol/μL)各0.5 μL,Template cDNA 1 μL,ddH2O 8 μL;PCR擴增條件:94 ℃3 min,94 ℃30 s,51.9 ℃30 s,72 ℃1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸1.5 min,4 ℃保存[3]。
BLSAT檢索出尖孢鐮刀菌cox1基因長1 590 bp,共編碼530個氨基酸。尖孢鐮刀菌cox1基因CDS區(qū)克隆結果如圖1所示,符合預期。
圖1 尖孢鐮刀菌cox1基因電泳圖
利用生物信息分析軟件Protparam 對尖孢鐮刀菌cox1蛋白進行理化分析,結果如表1所示。cox1蛋白的氨基酸數(shù)量為530個,其分子量為58 390.82 D、分子式為C2767H4174N648O698S22,cox1 蛋白的理論等電點PI為8.46。亮氨酸(Leu)含量最高,含有70個,占總氨基酸數(shù)的9.2%,甘氨酸(Gly)含有50個,占總氨基酸數(shù)的9.4%,異亮氨酸含有46 個,占總氨基酸數(shù)的8.7%,半胱氨酸(Cys)含量最低,僅含有1 個,占總氨基酸數(shù)的0.2%。
表1 蛋白質的理化性質分析
信號肽主要由三部分組成:n 區(qū)(n-region)為正電荷的氨基酸;疏水區(qū)(h-region)由9個及以上的中性氨基酸組成;加工區(qū)(c-region)是信號肽酶切割信號肽的部位[4]。使用在線網(wǎng)站SignalP4.1 Server預測cox1蛋白信號肽情況,具體結果如圖2所示,綜合評估推測cox1蛋白不存在信號肽,也不跨膜,在細胞質中合成后,不進行蛋白轉運,直接在細胞質基質中與代謝底物相作用,屬于非分泌型蛋白質[5]。
圖2 尖孢鐮刀菌cox1蛋白質信號肽
不同的氨基酸側鏈基團極性不同,導致其組成的蛋白質有一定的親/疏水性。通過在線分析網(wǎng)站對cox1 蛋白的疏水性進行研究,如圖3 所示。橫軸表示的是氨基酸的位置,縱軸代表的是氨基酸平均疏水指標,并且圖中的正值和負值分別表示的是疏水性和親水性,正值越大,表明疏水性越強,負值越大,表明親水性越強[6]。結果表明,cox1蛋白的最大疏水值(即最小親水值)出現(xiàn)在第195位氨基酸,最小疏水值(即最大親水值)出現(xiàn)在第443位氨基酸,由親水性氨基酸和疏水性氨基酸的分布可知,肽鏈中疏水性氨基酸殘基數(shù)量明顯多于親水性氨基酸殘基,因此可以推測cox1 蛋白為疏水性蛋白。
圖3 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的疏水性分析
通過在線網(wǎng)站預測蛋白跨膜結構,對尖孢鐮刀菌cox1蛋白進行蛋白跨膜結構預測(圖4)。橫軸表示的是氨基酸的位置,縱軸代表的是跨膜結構的可能性[7],圖4結果顯示,尖孢鐮刀菌cox1蛋白存在12個跨膜區(qū)域,因此可推測cox1蛋白為12層跨膜結構蛋白。
圖4 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的跨膜結構預測
通過NCBI 查找發(fā)現(xiàn),尖孢鐮刀菌cox1 蛋白有530個氨基酸,用DNA MAN軟件把其氨基酸的序列與茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、稻瘟病菌、立枯絲核菌和稻平臍蠕孢cox1蛋白序列進行對比,結果顯示,不同生物物種cox1蛋白序列存在一定的序列一致性。圖5 所示是9 個物種的系統(tǒng)進化樹。
圖5 9個物種cox1氨基酸序列系統(tǒng)進化樹
蛋白質二級結構作為一級結構和三級結構的紐帶,對其預測可以為三級結構和功能提供大量信息,如設計蛋白質突變體或確定蛋白質空間結構及功能[8]。
利用二級結構預測網(wǎng)站得α-螺旋占比較多為55.66%,片狀結構(β-折疊和β-轉角)為5.28%,無規(guī)則卷曲為39.06%,由此推斷,cox1 蛋白二級結構中最主要結構元件是α-螺旋,此外無規(guī)則卷曲和片狀結構分散于整個蛋白質中,且N-末端存在無規(guī)則卷曲形式,C-末端也存在無規(guī)則卷曲。
蛋白質的三級結構是由多肽鏈在二級結構的基礎上經(jīng)過進一步盤繞、折疊形成的復雜三維構象,這些二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲,它們之間通過側鏈基團的相互作用借助次級鍵形成三級結構。cox1蛋白三級結構預測通過網(wǎng)站建模得圖6,由圖可看出α-螺旋占主要結構部分,無規(guī)則卷曲和片狀結構分散于整個蛋白質中。
圖6 尖孢鐮刀菌cox1蛋白質三級結構預測
本研究運用生物信息學軟件對尖孢鐮刀菌cox1基因進行克隆,并對cox1蛋白從理化性質、信號肽、親/疏水性、跨膜結構、蛋白質二級結構、蛋白質三級結構等方面進行預測和分析。結果表明尖孢鐮刀菌cox1基因CDS 序列1 590 bp,編碼530 個氨基酸,cox1蛋白為堿性氨基酸,不存在信號肽,合成后就在核糖體處發(fā)揮作用,不存在運輸,屬于非分泌型蛋白質,疏水性較強,較穩(wěn)定,有明顯的跨膜現(xiàn)象。cox1蛋白二級結構中α—螺旋占主要結構部分,此外無規(guī)則卷曲和片狀結構分散于整個蛋白質中,cox1 蛋白三級結構預測結果同樣證實了二級結構成分含量的準確性,與二級結構結論相一致。cox1 蛋白在不同物種之間同源性較高,序列比對一致性較高,證明了該蛋白在同系同物種進化過程中發(fā)揮著至關重要的作用。研究結果為探究cox1蛋白的未知生物學功能提供了新思路,也為當下植物保護領域、植物真菌病害的防治打下了一定理論基礎,結合生物信息學可研制更高效、低成本、對環(huán)境友好的綠色殺菌劑。