4 種百合不同花期花香成分鑒定與關(guān)鍵基因表達研究

張 鵬，郭子雨，馮 緣，吳利雪，梁苡琳，郭金慶，張啟翔，孫 明

(花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，國家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，園林環(huán)境教育部工程研究中心，林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京林業(yè)大學 園林學院，北京 100083)

百合（Liliumspp.）是鮮花市場上最常見的切花種類，其品種眾多，形態(tài)各異，深受消費者的歡迎.在眾多的百合品種中，不乏花色艷麗、花香芬芳的品種[1].花香作為植物最重要的觀賞性狀之一，在百合育種中也經(jīng)常將花香作為重要的育種目標.植物花香是目前研究的熱點，它是由許多低相對分子質(zhì)量的揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compound，VOC）組成，植物花香中的主要成分有萜烯類化合物（terpenoids）、苯丙素類/苯環(huán)類化合物（phenylpropanoids/benzenoids）和脂肪酸衍生物（fatty acid derivatives），還包括一些含氮或硫的化合物[2].Kong 等[3]對來自7 個不同雜種系的35 個百合品種盛花期花朵進行揮發(fā)物成分的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：構(gòu)成百合花香的主要物質(zhì)為萜烯類化合物和苯丙素類/苯環(huán)類化合物，尤其以單萜類化合物含量最多，含量高的有芳樟醇、(E)-β-羅勒烯、1,8-桉樹腦等單萜類化合物，苯甲酸甲酯為百合花香中重要的苯丙素類/苯環(huán)類化合物.

關(guān)于百合花香合成關(guān)鍵基因的研究也非常熱門.張騰旬[4]在‘西伯利亞’百合花瓣中成功克隆出百合單萜合成相關(guān)的關(guān)鍵基因1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）基因，命名為LiDXS.萜烯合酶（terpene synthase，TPS）家族的酶類作為萜烯類合成最后步驟的酶，可分別催化二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）、香葉基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）、法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）和香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）形成不同的半萜、單萜、倍半萜和二萜物質(zhì)[5].Du 等[6]在對幾十個品種的百合進行揮發(fā)物測定的同時，從眾多品種中獲得了TPS基因的cDNA 序列并進行后續(xù)分析.除了萜烯類之外，苯丙素類/苯環(huán)類化合物也是百合花香的主要成分之一，尤其是苯甲酸甲酯，在眾多百合品種中均有存在.王歡[7]成功從百合品種‘黃色風暴’（Lilium‘Yelloween’）中克隆出苯甲酸/水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶（benzoic acid/salicylic acid carboxyl methyltransferase，BSMT）基因，取名為LiBSMT，并驗證了其功能.此外，一些轉(zhuǎn)錄因子也能夠參與花香物質(zhì)的合成，如PAP1能夠增加月季的萜烯類揮發(fā)物與苯丙素類/苯環(huán)類揮發(fā)物含量[8]；在百合品種‘西伯利亞’中，LoMYC2會顯著影響揮發(fā)物的含量[9].

本研究利用頂空固相微萃?。╤eadspace solidphase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合揮發(fā)性代謝組學分析方法，對4 種常見切花百合初花期與盛花期花朵的揮發(fā)物種類和含量變化進行分析.利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)對6 個花香合成相關(guān)的關(guān)鍵基因進行相對表達量的測定，其中PAL、PAL3和BSMT基因與百合苯丙素類/苯環(huán)類揮發(fā)物合成相關(guān)，DXS、DXR和TPS基因與百合單萜類揮發(fā)物合成相關(guān).最后對百合花朵進行中性紅染色（neutral red staining）試驗，來確定不同品種、不同花期百合花瓣揮發(fā)物的釋放區(qū)域.

1 材料與方法

1.1 試驗材料試驗材料為4 個品種的百合切花，品種分別為OT 百合（oriental×trumpet hybrids）‘競爭’（Lilium‘Competition’）、OT 百合‘木門’（Lilium‘Conca d'Or’）、東方百合（oriental hybrids）‘索邦’（Lilium‘Sorbonne’）和東方百合‘西伯利亞’（Lilium‘Siberia’），切花購自北京東風國際花卉市場.購回的切花進行瓶插復水，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度25±1 ℃，相對濕度55%，16 h 光照和8 h 黑暗處理.復水后，采用初花期和盛花期花朵進行試驗，初花期和盛花期的花朵形態(tài)如圖1 所示.

圖1 4 個百合品種在2 個開放時期的花朵形態(tài)Fig.1 The flower morphology of four lily varieties during two blooming periods

1.2 試驗方法

1.2.1 花朵揮發(fā)物的收集與分析 花朵揮發(fā)物的收集采用頂空固相微萃取方法進行.萃取前先將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，在250 ℃下老化10 min（新萃取頭需老化2 h）.將百合花朵稱重后立刻放入2.4 L 玻璃器皿中，隨后在玻璃器皿內(nèi)壁加入5 μL 內(nèi)標溶液后密封（內(nèi)標物質(zhì)為癸酸乙酯，用甲醇配成1∶1 000 內(nèi)標溶液），室溫平衡10 min.然后將萃取針插入瓶中，推出萃取頭，萃取30 min.30 min 過后縮回萃取頭，將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，在250 ℃下解析5 min.之后注入樣品進行GC-MS 分析，4 個品種、2 個花期的花朵揮發(fā)物測定做3 次生物學重復.

化合物定性方法：采用GCMS Postrun Analysis 軟件進行分析，利用NIST 11 質(zhì)譜庫進行檢索，結(jié)合資料分析、文獻查閱，確定化合物種類.

化合物定量方法：根據(jù)化合物峰面積與內(nèi)標物質(zhì)峰面積來計算化合物含量，計算公式如下.

化合物定性和定量工作完成后，要對化合物進行進一步的篩選，去掉與質(zhì)譜庫匹配相似度低的化合物（一般保留相似度大于80%的化合物），同時去掉含量極低的化合物和硅氧烷類化合物（硅氧烷類化合物一般為萃取頭的主要成分，不是花香的主要成分），其余數(shù)據(jù)用作后續(xù)分析[10].

1.2.2 不同花期6 個花香合成關(guān)鍵基因相對表達量測定 以初花期和盛花期百合內(nèi)輪花瓣為材料，分別對3 個苯丙素類/苯環(huán)類花香物質(zhì)合成相關(guān)的關(guān)鍵基因PAL、PAL3、BSMT和單萜合成相關(guān)的關(guān)鍵基因DXS、DXR、TPS進行qRT-PCR 驗證.苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是苯丙烷類物質(zhì)代謝途徑中最重要的限速酶，是進入苯丙烷類代謝途徑的第1 種酶[11-13]，有研究表明PAL基因的表達會顯著影響苯甲酸甲酯的生物生成[14-15].苯甲酸/水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶（BSMT）可以催化苯甲酸和水楊酸生成苯甲酸甲酯和水楊酸甲酯[16-17]，該酶在百合品種‘黃色風暴’和岷江百合（Lilium regale）中得到鑒定[7,18].1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）作為2 種潛在的萜烯類合成途徑限速酶，在百合品種‘西伯利亞’中的表達量與萜烯類揮發(fā)物趨勢是一致的[19].TPS是單萜類化合物合成的關(guān)鍵基因，在百合品種‘西伯利亞’中也得到了鑒定[20].該部分試驗中用到的基因均從百合中得到驗證.

采用OMEGA 總RNA 提取試劑盒按照說明書提取百合內(nèi)輪花瓣的總RNA，提取后的總RNA 用瓊脂糖凝膠進行電泳分析，并進行反轉(zhuǎn)錄.利用DNAMAN 軟件進行qRT-PCR 引物設(shè)計，引物序列見表1，Actin為內(nèi)參基因.qRT-PCR 的過程在PikoReal 96 孔熒光定量儀中運行，相對表達量用2-△△Ct法進行計算，設(shè)定每個品種、每個基因的qRT-PCR 結(jié)果均以初花期為對照，即初花期表達量為1.

表1 實時熒光定量PCR 所用到的引物序列Tab.1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.2.3 百合花瓣的中性紅染色試驗 氣味腺（osmophore）是能夠產(chǎn)生和釋放花朵揮發(fā)物的特殊腺體結(jié)構(gòu)，其存在于花器官的特定區(qū)域.利用中性紅染料可將花瓣內(nèi)部的氣味腺染色，因此中性紅染色能夠大致確定花瓣可能釋放揮發(fā)物的部位[21].為觀察初花期與盛花期百合花朵的中性紅溶液染色情況，本次對百合花瓣進行中性紅染色參考胡荻的方法[22]：配制0.01%的中性紅自來水溶液，將百合品種‘木門’‘索邦’和‘西伯利亞’初花期和盛花期花朵的花柄進行蠟封后浸入0.01%的中性紅自來水溶液中，黑暗環(huán)境下染色24 h.由于初花期的花朵并沒有完全開放，因此在染色前對初花期花朵的6 片花瓣小心地分離，避免傷到花瓣，之后再進行染色.染色之后用自來水沖洗掉多余的染料，晾干后對染色后的花朵進行拍照觀察.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析及繪圖所用到的軟件 利用邁維代謝云平臺（https://cloud.metware.cn）進行維恩圖、PCA 分析（principal components analysis）圖、聚類熱圖的繪制和差異揮發(fā)物的篩選.利用GraphPad Prism 8 軟件進行qRT-PCR 柱狀圖結(jié)果的繪制.利用IBM SPSS Statistics 22 軟件進行揮發(fā)物分類餅圖的制作；利用Adobe Photoshop CS6 軟件對植物材料圖片和其它結(jié)果圖片進行編輯.

2 結(jié)果與分析

2.1 百合花朵揮發(fā)物成分與含量統(tǒng)計4 個百合品種初花期與盛花期花朵的揮發(fā)物成分與含量統(tǒng)計結(jié)果如表2 所示，共檢測到61 種揮發(fā)性化合物.61 種揮發(fā)性化合物在4 個品種不同花期的含量熱圖如圖2 所示.4 個品種無論是初花期還是盛花期，花朵中的萜烯類揮發(fā)物質(zhì)含量均很高，尤其在盛花期，萜烯類揮發(fā)物質(zhì)的含量比初花期更多.在初花期與盛花期花朵中，含量較高的成分有芳樟醇、(Z)-β-羅勒烯、桉樹腦、(+)-檸檬烯、月桂烯等單萜類揮發(fā)物，以及苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯、(E)-異丁子香酚等苯丙素類/苯環(huán)類化合物，尤其以芳樟醇和(Z)-β-羅勒烯的含量最為豐富，水楊酸甲酯在百合品種‘木門’中含量較為豐富，而(Z)-β-羅勒烯、苯甲酸甲酯、(+)-檸檬烯、月桂烯和惕各酸甲酯這些物質(zhì)在4 個品種初花期與盛花期花朵中均能檢測到.

表2 4 個百合品種初花期和盛花期揮發(fā)性物質(zhì)成分及含量Tab.2 Components and contents of volatiles in early flowering stage and full blooming stage of 4 lily cultivars (ng·g-1·h-1)

圖2 4 個品種初花期與盛花期揮發(fā)物含量熱圖Fig.2 Heat map of volatile contents in early flowering stage and full blooming stage of 4 cultivars

根據(jù)4 個百合品種初花期與盛花期花朵揮發(fā)物成分與含量統(tǒng)計結(jié)果繪制維恩圖，如圖3 所示.初花期與盛花期花朵共檢測到61 種化合物，從初花期花朵中共檢測到45 種化合物，從盛花期花朵中共檢測到51 種化合物，初花期與盛花期花朵同時檢測到的化合物有35 種.4 個品種初花期花朵同時檢測到的化合物有6 種，4 個品種盛花期花朵同時檢測到的化合物有7 種.

圖3 百合花朵初花期與盛花期揮發(fā)物數(shù)量維恩圖Fig.3 Venn diagram of the amount of volatiles in early flowering stage and full blooming stage of lily flowers

2.2 百合花朵揮發(fā)物含量的PCA 分析利用4個百合品種初花期與盛花期花朵揮發(fā)物含量進行PCA 分析，結(jié)果如圖4 所示.每個品種不同花期的結(jié)果重復性良好，其中4 個品種的初花期結(jié)果較為緊湊地靠在一起，可能是初花期花朵在每個品種中的揮發(fā)物種類與含量都是較低的，而且有些種類的揮發(fā)物可能是4 個品種在初花期共有的.與初花期揮發(fā)物不同的是，4 個品種的盛花期結(jié)果差異較大，東方百合品種‘索邦’和‘西伯利亞’與OT 百合品種‘競爭’和‘木門’在盛花期的揮發(fā)物含量上存在明顯差異.4 個品種初花期揮發(fā)物含量與4 個品種盛花期揮發(fā)物含量也有明顯差異.

圖4 4 個品種初花期與盛花期揮發(fā)物含量的PCA 分析Fig.4 PCA analysis of volatile contents in early flowering stage and full blooming stage of 4 cultivars

2.3 百合花朵差異揮發(fā)物的篩選正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）是一種有監(jiān)督模式識別的多元統(tǒng)計分析方法，該方法可最大程度找出數(shù)據(jù)集內(nèi)部不同組別之間的差異，結(jié)合代謝物的信息，從而篩選出差異顯著的代謝物[23].OPLS-DA 分析中的變量重要性投影（variable importancein projection，VIP）經(jīng)常用于篩選差異代謝物[24].本文中，利用VIP 值和P值（pvalue）共同篩選差異揮發(fā)物，僅在同一品種的初花期和盛花期進行篩選，篩選條件為VIP 值大于1 且P值小于0.05，分別從‘競爭’‘木門’‘索邦’和‘西伯利亞’的初花期和盛花期花朵揮發(fā)物中篩選出22、14、18、11 種差異揮發(fā)物.共篩選出44 種差異揮發(fā)物，差異揮發(fā)物情況如表2所示.

2.4 百合花朵揮發(fā)物種類分類對61 種揮發(fā)性化合物進行分類，共分為9 類，即萜烯類、芳香族化合物、脂肪烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、含氮化合物和其它.各類揮發(fā)物在不同品種初花期與盛花期的占比如圖5 和表3 所示.由結(jié)果可以得出：4 個品種初花期主要成分為萜烯類和酯類物質(zhì)，其中品種‘競爭’和‘索邦’初花期花朵中的萜烯類物質(zhì)占比最大；品種‘木門’和‘西伯利亞’中的酯類物質(zhì)占比最大；‘西伯利亞’初花期花朵的萜烯類與酯類含量相近.4 個品種的盛花期花朵全部都是萜烯類物質(zhì)最多，其次為酯類、芳香族化合物等.

表3 4 種百合初花期與盛花期揮發(fā)物分類及含量統(tǒng)計Tab.3 Classification and content statistics of volatiles from early flowering stage and full blooming stage of 4 lily cultivars（ng·g-1·h-1）

圖5 4 個品種初花期與盛花期花朵揮發(fā)物分類Fig.5 Classification of volatile compounds in the flowers of four varieties during the early flowering stage and full blooming stage

2.5 百合花香合成關(guān)鍵基因的qRT-PCR 結(jié)果為了驗證不同花期百合花香物質(zhì)合成關(guān)鍵基因的相對表達量，對4 個品種初花期與盛花期花朵的6個花香物質(zhì)合成關(guān)鍵基因進行qRT-PCR 驗證.結(jié)果如圖6 所示，根據(jù)qRT-PCR 結(jié)果可以看出：PAL、PAL3、DXS和TPS這4 個基因盛花期的表達量在4 個品種中均高于初花期，這與對應(yīng)時期的單萜類和苯丙素類/苯環(huán)類化合物釋放量趨勢一致；而BSMT基因在盛花期‘西伯利亞’百合中的表達量卻遠遠低于初花期；DXR基因在盛花期‘競爭’和‘木門’中的表達量也低于初花期.實際上，4 個百合品種盛花期的苯甲酸甲酯和單萜類化合物的釋放量都要遠高于初花期.

圖6 6 個花香合成關(guān)鍵基因的qRT-PCR 結(jié)果Fig.6 qRT-PCR results of 6 key genes for floral synthesis

2.6 百合花瓣中性紅染色試驗結(jié)果對百合品種‘木門’‘索邦’和‘西伯利亞’初花期和盛花期花朵進行中性紅溶液染色，并將內(nèi)輪花瓣摘下進行拍照，觀察染色情況，結(jié)果如圖7 所示.結(jié)果表明3 個品種初花期與盛花期花瓣上均有不同程度的染色，且盛花期花瓣染色深度深于初花期.初花期花朵染色區(qū)域較小，盛花期花朵染色區(qū)域較大，兩個時期的花瓣均在上半部反卷處染色較深，而百合品種‘索邦’的花瓣在上半部反卷處的染色深度與其它位置相差不明顯，可能是因為‘索邦’花朵本身的粉色導致的結(jié)果.

3 討論

3.1 百合花朵揮發(fā)物定性與定量結(jié)果分析通過對4 個百合品種初花期與盛花期花朵揮發(fā)物定性與定量分析，結(jié)合眾多文獻對百合花朵揮發(fā)物進行測定，認為4 種百合主要花香成分為單萜和苯丙素類/苯環(huán)類揮發(fā)物質(zhì)，且盛花期揮發(fā)物的總含量要高于初花期.從百合花朵的成分分類來看，無論是初花期還是盛花期，萜烯類揮發(fā)物都是主要成分.在初花期，除了萜烯類物質(zhì)，‘木門’和‘西伯利亞’品種還含有較多的酯類物質(zhì)，其中相當一部分屬于苯丙素類，例如苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯等.而到了盛花期，單萜類揮發(fā)物的含量占比最高，其次是酯類和芳香族化合物，這些花香成分成為百合盛花期的主要成分.由于每個品種2 個花期的花朵揮發(fā)物測定僅做了3 次生物學重復，導致有些揮發(fā)物成分在某些重復樣品中并未檢測到，此時應(yīng)該增加生物學重復的次數(shù).

3.2 百合花香合成關(guān)鍵基因的qRT-PCR 結(jié)果分析根據(jù)對PAL、PAL3、BSMT、DXS、DXR、TPS這6 個花香合成關(guān)鍵基因的qRT-PCR 試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些基因大多都在盛花期表達量最高，這也呼應(yīng)了不同時期花朵的揮發(fā)物定量試驗的結(jié)果，即這些基因在盛花期高度表達，從而促進了花香物質(zhì)的合成.另外，在百合品種‘西伯利亞’中，初花期的BSMT基因表達量高于盛花期，這個結(jié)果是與其它3 個品種不同的.根據(jù)初花期與盛花期的苯甲酸甲酯含量來看，苯甲酸甲酯的含量趨勢與相對表達量的趨勢是相反的，原因可能是該BSMT基因并不是‘西伯利亞’生成苯甲酸甲酯的主要基因.BSMT基因能夠催化苯甲酸和水楊酸生成苯甲酸甲酯和水楊酸甲酯，本文中BSMT的qRT-PCR 引物來自于百合品種‘黃色風暴’[7].還有一些酶如苯甲酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶BAMT 和水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶SAMT 可以分別催化苯甲酸和水楊酸生成苯甲酸甲酯和水楊酸甲酯[25-26]，這2 個基因均屬于SABATH 家族的基因[27].也有研究表明：在姜花（Hedychium coronarium）中同時存在HcBSMT1與HcBSMT2基因，可分別催化苯甲酸和水楊酸形成苯甲酸甲酯和水楊酸甲酯[17].另外的原因也可能是苯丙烷類物質(zhì)代謝途徑重要基因PAL在‘西伯利亞’盛花期的高表達（PAL在‘西伯利亞’盛花期表達量約為初花期的200 倍，如圖6 所示），導致其催化生成的產(chǎn)物增多，間接地促進了‘西伯利亞’苯甲酸甲酯的生物合成，因此才會有‘西伯利亞’中盛花期的苯甲酸甲酯含量高于初花期的結(jié)果.另外，DXR基因在百合品種‘競爭’和‘木門’中，盛花期的表達量低于初花期，但萜烯類物質(zhì)的釋放量卻在盛花期最高，這兩個結(jié)論也是矛盾的，原因可能是因為DXR與DXS和TPS相比，并不是萜烯類合成途徑的限速酶.目前很多研究都證明了DXS為萜烯類合成的關(guān)鍵限速酶，對萜烯類的合成至關(guān)重要[28-29].TPS的轉(zhuǎn)錄活性也對萜烯類化合物的產(chǎn)生有重大影響[30].關(guān)于DXR基因，與本文類似的結(jié)論也出現(xiàn)在對寬葉薰衣草（Lavandula latifolia）DXR基因的功能研究中[31].

3.3 百合花瓣的中性紅染色試驗結(jié)果分析由于品種‘競爭’花朵顏色較深，不宜對其進行中性紅染色，因此僅對‘木門’‘索邦’和‘西伯利亞’3 個品種進行中性紅染色試驗.試驗結(jié)果表明，在中性紅染色后，同一品種在不同花期的百合花瓣顯示明顯的染色差異.盛花期的染色程度高于初花期，并且兩者均在花瓣的上半部反卷處呈現(xiàn)最深的染色情況.這說明3 個百合品種在盛花期的氣味腺分布區(qū)域要大于相應(yīng)品種的初花期.此外，不論是初花期還是盛花期，花瓣的上半部反卷處都是氣味腺最為密集的區(qū)域，大量氣味腺集中在該部位，表明這一區(qū)域是主要的揮發(fā)物釋放區(qū)域.大量氣味腺存在該部位可能有利于花香物質(zhì)的散發(fā).以上規(guī)律在中性紅染色結(jié)果中尤其明顯體現(xiàn)在百合品種‘西伯利亞’上.‘西伯利亞’百合花朵呈白色，在從初花期到盛花期的過程中，花瓣的顏色變化很小.因此，可以排除花瓣顏色深淺與花瓣固有顏色等因素對試驗結(jié)果的影響.相比之下，‘索邦’的花瓣主要呈粉紅色，并且隨著開放程度的增加，花瓣的顏色深度也會增強.因此，使用‘索邦’百合進行中性紅染色試驗的結(jié)果會受到自身條件的影響.盡管‘木門’花朵主要呈黃色，但根據(jù)染色試驗結(jié)果，得出的結(jié)論仍然與‘西伯利亞’百合類似.