PLUNC基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)位點(diǎn)C-1888T與變應(yīng)性鼻炎易感性*

王瑢, 佘志強(qiáng), 張少杰

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣西南寧 530000); 2廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣西南寧 530000)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)的發(fā)生是一項(xiàng)多階段、多路徑、多機(jī)制的進(jìn)程,多種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子參與其中[1],而腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate、lung、nasal epithelium clone,PLUNC)基因被認(rèn)為是一種在黏膜下腺和呼吸道上皮細(xì)胞表面表達(dá)的固有免疫蛋白,氣道不同炎癥感染狀態(tài)與其表達(dá)水平的改變有密切關(guān)系[2]?；蛞赘行?遺傳傾向是變應(yīng)性鼻炎發(fā)生的一個(gè)重要因素,大量的數(shù)據(jù)證實(shí),不同人群的個(gè)體在對(duì)患某種疾病的敏感性、對(duì)藥物的反應(yīng)等具有差別,這些差異通常來(lái)自相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)[3-4]。我們已在前期的科學(xué)研究中,檢測(cè)出了PLUNC基因中8個(gè)SNPs位點(diǎn),其啟動(dòng)子區(qū)兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)C-1888T和C-2128T,與我國(guó)人鼻咽癌的易感性關(guān)聯(lián)極為緊密(OR=2.8～3.3,P<0.001)[5],但是與變應(yīng)性鼻炎的關(guān)系卻從未見(jiàn)有相關(guān)研報(bào)道。我們選擇其中一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)C-1888T作為研究對(duì)象,采取病例對(duì)照的研究方法,分析其與變應(yīng)性鼻炎易感的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年1月至2022年2月期間于廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院就診治療的225例變應(yīng)性鼻炎患者臨床資料,設(shè)為AR組,其中男115例,女110例,漢族89例,壯族136例,年齡18～65歲,平均(38.07±12.67)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)參考2022年修訂版《中國(guó)變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》,符合變應(yīng)性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];(2)抽血檢測(cè)十種吸入性變應(yīng)原,包括屋塵螨、粉塵螨、狗毛、艾蒿、貓毛、樹(shù)組合(柳樹(shù)/楊樹(shù)/榆樹(shù))、矮豚草、蟑螂、真菌、葎草,至少有一種變應(yīng)原反應(yīng)試驗(yàn)為陽(yáng)性。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并哮喘、濕疹、特應(yīng)性皮炎等變應(yīng)性疾病病史;(2)有慢性鼻-鼻竇炎或鼻息肉病史;(3)合并腫瘤病史;(4)采集標(biāo)本前全身或局部使用激素病史;(5)采集標(biāo)本前有上、下呼吸道感染病史。

另選取同期150例健康體檢人群設(shè)為對(duì)照組,其中男80例,女70例,漢族52例,壯族98例,年齡12～78歲,平均(40.50±19.35)歲。兩組人員的年齡、性別、民族等資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)(KY2022-25)

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 血液DNA及RNA提取試劑盒購(gòu)至常州百代生物,逆錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)PCR均購(gòu)至Servicebio公司,擴(kuò)增儀購(gòu)至北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,電泳儀購(gòu)至Servicebio公司,引物由捷尼斯生物公司合成,凝膠成像儀購(gòu)至上海天能科技有限公司。

1.2.2 DNA提取及基因分型 采集AR組和對(duì)照組外周靜脈血3 mL并分裝備用。根據(jù)血液DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA,分光光度計(jì)定量。PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)體系和條件參考文獻(xiàn)[5],擴(kuò)增PLUNC基因上游啟動(dòng)子區(qū)全長(zhǎng)為192 bp的DNA序列。PCR產(chǎn)物直接送檢測(cè)序,部分經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀觀察目的條帶是否清晰、大小是否正確。

1.2.3 Quantitative real-time PCR(QPCR)檢測(cè)不同組別、不同基因型中PLUNC基因的相對(duì)表達(dá)水平 根據(jù)血液RNA提取試劑盒操作步驟,提取各組外周血中總RNA,異丙醇沉淀,分光光度計(jì)定量。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以β-actin為內(nèi)參,每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔,使用熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增,各自引物序列見(jiàn)表1。QPCR反應(yīng)條件為95℃,10 min,1cycle;95℃,15 s、60℃,30 s,40cycle。反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)計(jì)算出Ct值,用2-ΔΔCt表示PLUNC基因在不同組別中及不同基因型中的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 QPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件處理分析數(shù)據(jù),檢驗(yàn)研究對(duì)象的Hardy-Weinberg平衡。不同基因型和等位基因頻率采用頻率計(jì)數(shù)法計(jì)算;不同基因型和等位基因之間頻率比較采用2檢驗(yàn);AR組與對(duì)照組間PLUNC基因的相對(duì)表達(dá)量比較采取t檢驗(yàn);不同基因型與對(duì)照組之間PLUNC基因的相對(duì)表達(dá)量差異采用方差分析。P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證 PLUNC基因的C-1888T位點(diǎn)基因型分布,實(shí)際值與預(yù)測(cè)值比較無(wú)明顯差異,且各基因型頻率穩(wěn)定,符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,見(jiàn)表2。

表2 PLUNC基因C-1888T位點(diǎn)基因型頻率Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)

2.2 C-1888T位點(diǎn)3種基因型鑒定 PCR電泳圖見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為192 bp,條帶清晰(圖1)。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序鑒定出C-1888T位點(diǎn)3種基因型,即TT型、CC型、CT型(圖2)。

圖1 部分樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

A:CT型;B:TT型;C:CC型

2.3 C-1888T位點(diǎn)基因型和等位基因頻率對(duì)比 AR組CC基因型30例(13.33%),CT基因型60例(26.67%),TT基因型135例(60.00%);C等位基因頻率為26.67%,T等位基因頻率為73.33%。對(duì)照組CC基因型、CT基因型、TT基因型分別為50例(33.33%)、76例(50.67%)、24例(16.00%);C等位基因頻率為58.67%,T等位基因頻率為41.33%。AR組與對(duì)照組相比,TT基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。相對(duì)于等位基因C,等位基因T可能增加變應(yīng)性鼻炎發(fā)生的危險(xiǎn)性(OR=3.903,P=0.000)。TT基因型較CC基因型,使變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=9.375,P=0.000)。見(jiàn)表3。

表3 C-1888T位點(diǎn)等位基因與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病危險(xiǎn)性

2.4 PLUNC基因在對(duì)照組和AR組中的相對(duì)表達(dá)量比較 PLUNC基因在AR組的相對(duì)表達(dá)量為1.449±0.898,在對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量為2.345±0.668,兩組方差齊,PLUNC基因在AR組中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P=0.000)。

2.5 PLUNC基因在對(duì)照組和AR組不同基因型中的相對(duì)表達(dá)量比較 PLUNC基因在對(duì)照組和不同基因型中的相對(duì)表達(dá)水平見(jiàn)表4,Levene檢驗(yàn)方差不齊,總體均數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。進(jìn)一步Dunnett′s法多重比較發(fā)現(xiàn),TT型與對(duì)照組相比,PLUNC基因表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);而CT型、CC型與對(duì)照組相比,相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.189和P=0.695)。

表4 PLUNC基因在對(duì)照組和不同基因型中的相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

PLUNC基因表達(dá)具有相對(duì)的組織特異性[7],最初的研究主要集中在與鼻咽癌的相關(guān)性方面[8],但隨著研究的推進(jìn),發(fā)現(xiàn)PLUNC同時(shí)還是一種新的上呼吸道分泌性蛋白質(zhì),屬抗炎因子,能抑制炎癥反應(yīng)[9-10],在多種氣道變應(yīng)性疾病中發(fā)揮了免疫應(yīng)答作用[11]。變應(yīng)性鼻炎是機(jī)體接觸變應(yīng)原后主要由 IgE 介導(dǎo)的介質(zhì)釋放、并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的鼻黏膜非感染性炎癥性疾病,Ghafouri等[12]、Irander等[13]學(xué)者通過(guò)收集變應(yīng)性鼻炎及健康人群的鼻腔灌洗液分析差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)PLUNC基因在變應(yīng)鼻炎患者中表達(dá)下調(diào)。而本研究中首次采取收集變應(yīng)性鼻炎及健康人群血液標(biāo)本,從全血中提取RNA,通過(guò)QPCR得出PLUNC基因在變應(yīng)性鼻炎患者中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照組(P=0.000),與前期學(xué)者報(bào)道結(jié)果相符。且血標(biāo)本可在進(jìn)行專(zhuān)項(xiàng)變應(yīng)原篩查時(shí)一并抽取,臨床上比收集鼻腔灌洗液方便,執(zhí)行性強(qiáng),有利于今后的進(jìn)一步推廣。

變應(yīng)性鼻炎的發(fā)展過(guò)程受遺傳和環(huán)境因素共同影響,而基因多態(tài)性則可以上調(diào)或者下調(diào)變應(yīng)性鼻炎的易感性,這也造成了不同個(gè)體在臨床癥狀和治療效果、轉(zhuǎn)歸之間存在多樣化、差異性[14]。我們的前期研究顯示,在PLUNC基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)C-1888T可以影響該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能,進(jìn)而引起對(duì)鼻咽癌易感性/風(fēng)險(xiǎn)上升[15],而此項(xiàng)研究首次表明該多態(tài)位點(diǎn)也和變應(yīng)性鼻炎的易感性顯著相關(guān)。在健康對(duì)照組中,多態(tài)位點(diǎn)C-1888T基因型以CT型居多,但在變應(yīng)性鼻炎組中TT型比率卻顯著上升,兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。QPCR結(jié)果提示,在變應(yīng)性鼻炎患者該位點(diǎn)的3種基因型中,TT型PLUNC基因相對(duì)表達(dá)量明顯下降,較健康對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而CT型和CC型相對(duì)表達(dá)量與健康對(duì)照無(wú)明顯差異。基因型和等位基因頻率資料表明,TT基因型和T等位基因分別使變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生率提高了9.375倍和3.903倍,這些結(jié)果提示T等位基因增加了變應(yīng)性鼻炎的易感性。

我們注意到,Irander等[13]發(fā)現(xiàn)PLUNC基因在持續(xù)性鼻炎患者鼻腔灌洗液中表達(dá)水平低于健康人群,可對(duì)于目前未暴露于變應(yīng)原下的間歇性變應(yīng)性鼻炎患者,PLUNC基因表達(dá)水平與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但如果加入吸煙這個(gè)變量因素,不論是持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎還是間歇性鼻炎,吸煙者PLUNC基因表達(dá)水平均低于不吸煙者。所以PLUNC表達(dá)水平可受變應(yīng)性鼻炎不同時(shí)期狀態(tài)、是否暴露于致敏和理化刺激因素等影響,這種表達(dá)變化是否會(huì)影響疾病的易感性?目前并無(wú)相關(guān)研究,且其他變態(tài)反應(yīng)性疾患中亦無(wú)經(jīng)驗(yàn)可循。其次,本次研究對(duì)象來(lái)源與廣西地區(qū),廣西民族以壯族人群為主,雖實(shí)驗(yàn)前已驗(yàn)證PLUNC基因的C-1888T位點(diǎn)基因型在研究人群中分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,試驗(yàn)組和對(duì)照組民族資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但我們此次研究并沒(méi)有進(jìn)一步深入對(duì)比該基因位點(diǎn)在不同民族中的表型差異。這些都是作為我們下一個(gè)課題研究的重要方向,將各種參雜因素細(xì)化、深入的分類(lèi)剖析,增大樣本量,進(jìn)行多族群、多種族、多地域群體的檢測(cè),有助于更加全面的闡述PLUNC基因多態(tài)性、易感性與變應(yīng)性鼻炎的相關(guān)性。

綜上所述,由于PLUNC基因在變應(yīng)性鼻炎患者中表達(dá)下調(diào), C-1888T位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性也和變應(yīng)性鼻炎存在著明顯相關(guān)性,TT基因型和T等位基因?yàn)橐赘行砸蛩?。針?duì)該位點(diǎn)的生物學(xué)功能,推測(cè)可能機(jī)理為通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),從而改變蛋白產(chǎn)物,引起信號(hào)通路異常,最終引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。關(guān)于PLUNC基因C-1888T位點(diǎn)與變應(yīng)性疾病易感性關(guān)聯(lián)的研究,開(kāi)辟了探索變應(yīng)性疾病分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制的新途徑。

利益相關(guān)聲明:本研究不存在研究者與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:王瑢負(fù)責(zé)提出研究選題、設(shè)計(jì)研究方案、實(shí)施研究過(guò)程和分析數(shù)據(jù);王瑢、張少杰負(fù)責(zé)起草論文、修訂論文;佘志強(qiáng)負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)、采集整理數(shù)據(jù)。