肝細(xì)胞癌患者中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1的表達(dá)及意義*

方麗, 牛廣旭, 吳士茜, 王靜

邯鄲市中心醫(yī)院病理科(河北邯鄲 056000)

全球范圍內(nèi),肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)每年死亡例數(shù)達(dá)35.81萬(wàn)人,是全球第五大常見(jiàn)惡性腫瘤和第四大腫瘤相關(guān)死亡原因[1]。隨著HCC早期診斷及介入治療等技術(shù)的發(fā)展,可延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間,但部分患者即使經(jīng)積極治療后,仍會(huì)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致不良預(yù)后[2]。深入探究HCC的發(fā)生機(jī)制,對(duì)于尋找提示HCC患者預(yù)后的分子標(biāo)志物,具有重要意義。細(xì)胞周期進(jìn)程受到細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的嚴(yán)格控制,HCC的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂關(guān)系密切[3]。因此,檢測(cè)癌組織中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況有助于預(yù)測(cè)HCC患者的生存預(yù)后,指導(dǎo)臨床診治及隨訪。CDK2相關(guān)性Culin結(jié)構(gòu)域1(CDK2-associated cullin1,CAC1)是一個(gè)含有Cullin結(jié)構(gòu)域的369個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),以依賴細(xì)胞周期的方式表達(dá),在G1晚期至S期表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn),CAC1與CDK2相互作用并促進(jìn)CDK2蛋白的激酶活性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[4]。細(xì)胞周期蛋白B2(CCNB2)、細(xì)胞周期蛋白Y(Cyclin Y)、細(xì)胞周期蛋白E1(Cyclin E1)均屬于細(xì)胞周期蛋白家族成員。CCNB2定位于高爾基體,其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βRⅡ結(jié)合,促進(jìn)腫瘤中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo),促進(jìn)腫瘤增殖[5]。Cyclin Y是Rb通路的潛在調(diào)節(jié)因子,參與調(diào)節(jié)人HCC細(xì)胞系的G1/S期轉(zhuǎn)變,可以通過(guò)結(jié)合促進(jìn)CDK4的T172位點(diǎn)磷酸化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[6]。Cyclin E1作為一種細(xì)胞周期蛋白,能與CDK2的調(diào)節(jié)亞基形成復(fù)合物并發(fā)揮其作用,其活性是促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換。腫瘤中Cyclin E1的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展[7]。本研究通過(guò)分析HCC中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1的表達(dá),探討其臨床預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以自2015年1月至2016年1月期間于我院診治的84例HCC患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均接受HCC切除術(shù),術(shù)后病理診斷明確為HCC。(2)術(shù)前無(wú)放化療、TACE及消融治療史。(3)臨床資料完整。(4)患者對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并肝膿腫、肺炎等感染性疾病。(2)合并其他惡性腫瘤。(3)合并肝腎等器官功能衰竭?；颊吣挲g33～77歲,平均(62.32±6.39)歲;男50例,女34例;腫瘤大小:≤2 cm者43例,>2 cm者41例;采用第六版美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)腫瘤TNM分期:Ⅰ期53例,Ⅱ～Ⅲa期31例。病理分級(jí):高中分化58例,低分化26例;甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平:<400 ng/mL 62例,≥400 ng/mL 22例;腫瘤數(shù)目:單發(fā)61例,多發(fā)23例;肝硬化:有62例,無(wú)22例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并通過(guò)。

1.2 免疫組化檢測(cè) 將癌和癌旁組織(距癌組織邊緣2 cm以上)放入10%甲醛固定過(guò)夜,置入包埋機(jī)石蠟包埋,切片機(jī)4 μm切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中微波爐煮沸抗原熱修復(fù)5 min,滴加3%雙氧水15 min,一抗4℃過(guò)夜(CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1抗體購(gòu)自Abcam公司,貨號(hào)ab251041、ab185622、ab237677、ab33911);滴加二抗孵育30 min;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記三抗孵育30 min,顯色液顯色30 s;蘇木素染核5 min,梯度酒精脫水,樹(shù)脂封片。200倍顯微鏡下(日本OLYMBUS,BX53)觀察陽(yáng)性表達(dá)情況,染色評(píng)分根據(jù)染色強(qiáng)度(0分:無(wú)染色;1分:棕黃色染色;2分:棕褐色染色)乘以染色面積(0分:≤25%;1分:26%～49%;2分:≥50%)。評(píng)分<2分為陰性表達(dá),≥2分為陽(yáng)性表達(dá)[8]。

1.3 隨訪 經(jīng)術(shù)后病理明確診斷為HCC之日開(kāi)始進(jìn)行隨訪,以門診復(fù)查或電話的方式進(jìn)行隨訪,前2年每3個(gè)月隨訪1次,此后每6個(gè)月隨訪1次,隨訪內(nèi)容為患者生存狀態(tài)及疾病復(fù)發(fā)進(jìn)展情況等,隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪時(shí)間結(jié)束,隨訪截止時(shí)間為2021年1月。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC癌與癌旁組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA的表達(dá)顯著高于癌旁組織,經(jīng)Wilcoxon秩檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.420、3.893、3.122、3.517,均P=0.000)。見(jiàn)圖1。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果,進(jìn)一步證實(shí)癌組織中CAC1 mRNA高表達(dá)[HR=1.56(1.10～2.22),P=0.013]、CCNB2 mRNA高表達(dá)[HR=1.45(1.06～1.92),P=0.032]、Cyclin Y mRNA高表達(dá)[HR=1.83(1.28～2.60),P<0.001]及Cyclin E1 mRNA高表達(dá)[HR=1.62(1.14～2.29),P=0.007]HCC患者總體生存預(yù)后較差。

注:*P<0.001

2.2 HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 利用R語(yǔ)言,采用Pearson相關(guān)分析HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性,結(jié)果顯示CAC1、CCNB2、Cyclin Y與Cyclin E1 mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 HCC癌組織中各指標(biāo)mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.3 HCC癌與癌旁組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達(dá) 癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,部分位于細(xì)胞核;Cyclin E1陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核,見(jiàn)圖2。癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.43%(60/84)、77.38%(65/84)、69.05%(58/84)、78.57%(66/84),癌旁組織分別為25.00%(21/84)、27.38%(23/84)、19.05%(16/84)、20.24%(17/84),癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(2=36.261、42.096、42.604、57.175,P=0.000、0.000、0.000、0.000)。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組化檢測(cè)癌組織中CAC1、CCNB2、CyclinY及CyclinE1蛋白表達(dá)(×200)

2.4 HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 HCC患者不同腫瘤TNM分期及腫瘤數(shù)目的癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),不同HCC患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、AFP水平及肝硬化與CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 HCC中CAC1、CCNB2、CyclinY及CyclinE1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.5 HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1蛋白表達(dá)對(duì)患者生存預(yù)后影響 84例患者隨訪2～60個(gè)月,隨訪期間死亡39例,失訪2例,中位總體生存時(shí)間為(35.87±7.91)個(gè)月,5年總體生存率52.44%(43/82)。CAC1陽(yáng)性表達(dá)組的5年總體生存率為41.38%(24/58),明顯低于陰性表達(dá)組患者79.17%(19/24)(Log-rank2=5.430,P=0.020;CCNB2陽(yáng)性表達(dá)組的5年總體生存率為46.03%(29/63),明顯低于陰性表達(dá)組患者73.68%(14/19)(Log-rank2=4.237,P=0.040);Cyclin Y陽(yáng)性表達(dá)組的5年總體生存率為42.86%(24/56),明顯低于陰性表達(dá)組患者73.08%(19/26)(Log-rank2=6.125,P=0.013);Cyclin E1陽(yáng)性表達(dá)組的5年總體生存率為46.88%(30/64),明顯低于陰性表達(dá)組患者72.22%(13/18)(Log-rank2=3.867,P=0.049)。見(jiàn)圖3。

圖3HCC癌組織中CAC1、CCNB2、CyclinY及CyclinE1蛋白表達(dá)對(duì)患者生存預(yù)后影響

3 討論

肝癌是癌癥相關(guān)死亡中第三大死亡原因,預(yù)后較差,嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康。HCC是肝癌最常見(jiàn)的病理類型,HCC的臨床治療包括手術(shù)治療、介入治療、射頻消融及放化療等,但目前仍不能徹底治愈。因此,需深入研究HCC的疾病發(fā)病規(guī)律,探索新的HCC疾病發(fā)生的分子機(jī)制,尋找新的HCC早期診斷及預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物。腫瘤細(xì)胞的失控性增殖是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征,涉及細(xì)胞周期調(diào)控的紊亂。HCC的發(fā)生、發(fā)展是細(xì)胞增殖及異常分化的結(jié)果,其中G1/S期調(diào)控紊亂是HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),涉及Cyclin、CDK及周期素激酶抑制蛋白構(gòu)成的蛋白調(diào)節(jié)系統(tǒng)的功能紊亂[9]。因此,深入研究HCC中Cyclins/CDK的表達(dá)及生物學(xué)功能對(duì)臨床早期診斷及腫瘤的防治具有重大的臨床意義。

CAC1編碼基因位于人類10號(hào)染色體(10q35-36),屬于E3泛素連接酶家族成員。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),在生長(zhǎng)因子、有絲分裂原等因子的刺激下,結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤中CAC1通過(guò)激活CDK2激酶活性,不僅參與促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行,還參與腫瘤耐藥性的形成[3,10]。本研究發(fā)現(xiàn),HCC癌組織中CAC1蛋白表達(dá)明顯升高,提示CAC1可能參與HCC的腫瘤發(fā)生。HCC中CAC1表達(dá)升高的機(jī)制可能與微小RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。研究表明,微小RNA-199能夠結(jié)合到CAC1 mRNA的3′非編碼區(qū),降低的CAC1 mRNA的穩(wěn)定性,而腫瘤中抑制CAC1表達(dá)的微小RNA-199表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致CAC1過(guò)表達(dá),促進(jìn)腫瘤的惡性增殖[11]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),腫瘤分期Ⅱ～Ⅲa期及多發(fā)腫瘤的HCC癌組織中CAC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較高,提示HCC中CAC1蛋白表達(dá)升高參與HCC的腫瘤進(jìn)展。分析其機(jī)制,可能與CAC1對(duì)下游抑癌基因的調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),CAC1的表達(dá)上調(diào)通過(guò)促進(jìn)PML基因的SUMO化修飾,抑制抑癌基因p53的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[12]。此外,CAC1的表達(dá)升高還能夠通過(guò)促進(jìn)腫瘤中基質(zhì)金屬蛋酶-19等的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的降解,促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[13]。

細(xì)胞周期受到多種細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的調(diào)控。CCNB2屬于B型細(xì)胞周期蛋白。研究表明,CCNB2在G1期合成并在后期迅速降低,腫瘤中CCNB2的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致G2/M檢查點(diǎn)失效,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。本研究中,HCC癌組織中CCNB2蛋白表達(dá)升高,其機(jī)制可能是CCNB2受上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤中轉(zhuǎn)錄因子HMGA能夠結(jié)合CNNB2基因啟動(dòng)子區(qū)域的CAAT盒,促進(jìn)CNNB2的表達(dá)[15],而HCC中HMGA表達(dá)上調(diào)[16],因此,HCC中HMGA的表達(dá)促進(jìn)CNNB2的表達(dá)上調(diào)。此外,HCC癌組織中CNNB2表達(dá)與腫瘤TNM分期及腫瘤數(shù)目有關(guān),提示CNNB2參與促進(jìn)HCC的腫瘤進(jìn)展。有學(xué)者報(bào)道,CNNB2的表達(dá)增加通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞G2/M期的進(jìn)行,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有絲分裂,促進(jìn)腫瘤的惡性增殖[14]。除CCNB2外,多種細(xì)胞周期蛋白如Cyclin Y、Cyclin E1亦參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)[17-18]。本研究中,HCC癌組織中Cyclin Y、Cyclin E1蛋白表達(dá)顯著升高,提示Cyclin Y、Cyclin E1均參與HCC的腫瘤發(fā)生過(guò)程。一方面,Cyclin Y的表達(dá)上調(diào)可能與上游AMPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。Dohmen等[19]研究表明,AMPK能夠磷酸化激活其底物Cyclin Y,促進(jìn)Cyclin Y結(jié)合CDK16,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另一方面,HCC中Cyclin E1的表達(dá)升高可能與其上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控有關(guān),研究發(fā)現(xiàn),HCC中Cyclin E1的表達(dá)上調(diào)受到E2F的調(diào)控,E2F通過(guò)激活HCC中E2F的表達(dá),促進(jìn)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者的不良預(yù)后[17]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),HCC中Cyclin Y、Cyclin E1陽(yáng)性表達(dá)與較高的腫瘤TNM分期及腫瘤數(shù)目有關(guān),提示Cyclin Y、Cyclin E1可能參與HCC的腫瘤進(jìn)展。分析其機(jī)制,可能與Cyclin Y、Cyclin E1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。其中Cyclin Y能夠與CDK4結(jié)合形成復(fù)合體,促進(jìn)腫瘤G1/S期轉(zhuǎn)換,促進(jìn)腫瘤增殖[5],而Cyclin E1除能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期G1/S期進(jìn)行以外,還能通過(guò)激活A(yù)KT/雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20]。

本研究進(jìn)一步分析CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1表達(dá)與HCC患者生存預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1陽(yáng)性表達(dá)的HCC患者生存預(yù)后較差,提示檢測(cè)HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1的表達(dá)有助于判斷HCC患者生存預(yù)后。本研究通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),HCC癌組織中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1 mRNA表達(dá)均呈顯著正相關(guān),其中CCNB2與Cyclin E1間為強(qiáng)相關(guān),提示四者在HCC的疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中存在相互作用的關(guān)系。有學(xué)者[21]研究發(fā)現(xiàn),HCC中Cyclin A、B、E等家族成員受到上游轉(zhuǎn)錄因子E2F的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,腫瘤發(fā)生時(shí)E2F能夠上調(diào)Cyclins的表達(dá),共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)行,但具體作用及調(diào)控機(jī)制有待深入探索。

綜上所述,HCC中CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1表達(dá)上調(diào),四者表達(dá)與腫瘤TNM分期及腫瘤數(shù)目有關(guān)。CAC1、CCNB2、Cyclin Y及Cyclin E1陽(yáng)性表達(dá)的HCC患者生存預(yù)后較差,有助于判斷HCC患者的臨床預(yù)后。但本研究樣本例數(shù)有限,研究可能存在一定的偏倚,有待今后進(jìn)行多中心臨床試驗(yàn)深入研究。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:方麗負(fù)責(zé)醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)收集、起草和修訂論文等工作。牛廣旭、吳士茜負(fù)責(zé)協(xié)助實(shí)施研究、部分?jǐn)?shù)據(jù)的收集和分析以及論文審查和修訂等工作。王靜負(fù)責(zé)論文編輯和審查,并提供了行政、技術(shù)和材料等方面的支持。