特應性皮炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞亞群及相應細胞因子的表達*

陳田恬, 黃顯博, 閔瑾雯, 張溢峻, 趙艷, 張慧云, 何韶衡, 孫健△

1錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科, 3變態(tài)反應與臨床免疫研究中心(遼寧錦州 121001); 2錦州醫(yī)科大學生命科學研究院(遼寧錦州 121001)

特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種慢性、反復發(fā)作的炎癥性皮膚病,表現(xiàn)為濕疹性皮損和皮膚瘙癢,多數(shù)伴有血漿中IgE和嗜酸性粒細胞水平升高。全世界有15%～30%的兒童和2%～10%的成人受到AD的影響[1]。盡管有大量的臨床和實驗研究,但AD的確切發(fā)病機制尚不清楚。關(guān)于AD發(fā)病機制的最新假設涉及眾多因素,包括遺傳易感性、環(huán)境因素、免疫功能改變和皮膚屏障功能障礙等[2-3]。先天和適應性免疫在AD的發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)加重中起了決定性作用。除了經(jīng)典的Th1/Th2失衡引起細胞因子的分泌異常[4],近年發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Treg)在AD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,AD是效應T細胞(effector T cells,Teffs)和Treg穩(wěn)態(tài)被破壞的結(jié)果[5]。以Foxp3表達為特征的Treg是有效的T細胞激活免疫調(diào)節(jié)劑,以產(chǎn)生白細胞介素-10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等抗炎癥因子為特征,通過直接細胞-細胞接觸信號傳導、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)以及分泌TGF-β和IL-10來抑制效應T細胞的增殖和細胞因子分泌,從而增強免疫耐受,維持免疫穩(wěn)態(tài)。有研究表明Treg細胞在控制皮膚損傷引起的炎癥和過敏原特異性免疫反應方面至關(guān)重要,是AD樣皮膚炎癥的重要抑制因子[6]。Treg細胞最具特征的亞群是胸腺來源Treg細胞(tTreg細胞)和外周Treg細胞(pTreg細胞)或誘導Treg細胞(iTreg細胞)[7],雖然這兩個Treg亞群來源不同,但它們具有相同的細胞標記CD4+CD25+Foxp3+,并且都具有抑制活性[8-9]。此外,在Treg家族中還存在 CD8+Treg細胞和IL-17+Treg細胞[10-11]。近年來,許多研究探討了AD和Treg細胞亞群的關(guān)系,但是出現(xiàn)了相互矛盾的結(jié)果[12-13]。目前根據(jù)AD患者是否有IgE的升高和是否患有其他特應性疾病將AD分為內(nèi)源性AD和外源性AD[14]。外源性AD是發(fā)病率高的典型類型,以高水平的血清總IgE為特征,伴有個人或家族性的特應性疾病史(如過敏性鼻炎、哮喘、過敏性結(jié)膜炎)以及食物和吸入性過敏原特異性sIgE。內(nèi)源性AD與外源性AD具有類似的臨床表型,但血清IgE水平正常,無特應性病史,且缺乏過敏原特異性sIgE[15]。本研究分別采集內(nèi)源性和外源性AD患者的外周血標本,探討Treg細胞亞群在內(nèi)源性AD和外源性AD患者的表達特征,為探索AD的發(fā)病機制和新的治療靶點提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年6—12月在錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院確診的 AD 患者36例(表1),其中內(nèi)源性AD患者18例,外源性AD患者18例。男6例,女30例,平均年齡(37.44±14.70)歲。

表1 各組臨床資料比較

納入標準:(1)符合特應性皮炎Williams診斷標準;(2)無其他系統(tǒng)性疾病;(3)近2周內(nèi)未用過系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和抗組胺藥。

AD分型標準:(1)內(nèi)源性AD(iAD):血清總IgE<150 kU/L(散射比濁法)、體外特異性IgE陰性、過敏原皮膚點刺試驗陰性且不合并其他特應性疾病(如變應性鼻炎、過敏性哮喘和食物過敏等)的AD為iAD。(2)外源性AD(eAD):血清總IgE>150 kU/L(散射比濁法)、體外特異性IgE陽性、過敏原皮膚點刺試驗陽性及合并其他特應性疾病的AD為eAD[16]。

排除標準:(1)臨床資料不全者;(2)免疫功能異常者。

選取同期在本院體檢的健康者15例為對照組,無過敏性疾病史,男4例,女11例,平均年齡(23.43±4.23)歲。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準同意(202316)。

1.2 主要儀器與試劑 FACS Verse流式細胞儀購自美國BD公司;FITC偶聯(lián)抗人CD8抗體、PE偶聯(lián)抗人CCR6抗體、Alexa647偶聯(lián)抗人Foxp3抗體、PE/Cy7偶聯(lián)抗人IL-10抗體、PerCP/Cy5.5偶聯(lián)抗人IL-17抗體和Cytofix /Cytoperm破膜/固定試劑盒均購自美國Biolegend公司;PHA、離子霉素、高爾基體阻斷劑購自美國Sigma公司;PBS購自中國SolARbio公司;淋巴細胞分離液Lymphoprep購自挪威AXIS-SHIELD公司。

1.3 方法

1.3.1 提取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC) 分別取各組研究對象外周血2 mL于含EDTA抗凝劑的采血管中,在10 mL離心管中將外周血和生理鹽水1∶1混勻,將淋巴細胞分離液加入10 mL帶蓋離心管中,再在其上緩慢疊加混勻的2倍體積的稀釋血液,室溫800g離心25 min后,吸出置于1～3層之間的灰白色云霧層液體,即為PBMC,置于新的離心管中,用生理鹽水洗滌細胞,250 g離心10 min,獲得細胞沉淀,重懸于1640培養(yǎng)液中,即得到PBMC懸液。

1.3.2 流式細胞術(shù)分析 向提取好的外周血PBMC中加入淋巴細胞激活劑(PHA,離子霉素,高爾基體阻斷劑),37℃孵育 4 h 后加入FcR阻斷劑,室溫避光孵育15 min;A組實驗加入PerCP偶聯(lián)抗人CD4抗體、FITC偶聯(lián)抗人CD25抗體進行細胞表面標志物染色。然后對細胞固定、破膜,加入Alexa647偶聯(lián)抗人FoxP3抗體和PE-Cy7偶聯(lián)抗人IL-10抗體進行細胞內(nèi)標志物染色。B組實驗加入FITC偶聯(lián)抗人CD8抗體、PE偶聯(lián)抗人CCR6抗體進行細胞表面標志物染色。然后對細胞固定、破膜,加入Alexa647偶聯(lián)抗人FoxP3抗體、PE-Cy7偶聯(lián)抗人IL-10抗體和PerCP-Cy5.5偶聯(lián)抗人IL-17抗體進行細胞內(nèi)標志物染色。用流式細胞儀檢測細胞表面或細胞內(nèi)標志物的表達,Diva軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。Treg細胞首先被定義為淋巴細胞門內(nèi)的單細胞。A組實驗檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞百分比及其表達IL-10的百分比;B組實驗檢測CD8+Foxp3+Treg細胞占CD8+T細胞百分比及其表達IL-10的百分比。

2 結(jié)果

2.1 AD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例降低 與對照組相比較,內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T淋巴細胞的百分比均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1、2。并且內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者外周血IL-10+Foxp3+Treg細胞占CD4+T淋巴細胞比例明顯低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3、4。內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者幾組數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注:HC: 對照組; eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注:HC: 對照組; eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對照組比較P<0.01

注:HC: 對照組; eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注:HC: 對照組; eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對照組比較P<0.01

2.2 AD患者外周血CD8+Foxp3+Treg細胞比例降低 與對照組相比較,內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者外周血CD8+Foxp3+Treg占CD8+T淋巴細胞的百分比均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5、6。并且內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者外周血IL-10+Foxp3+Treg細胞占CD8+T淋巴比例明顯低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖7、8。內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者幾組數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注:HC: 對照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注:HC: 對照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對照組比較P<0.01

注:HC: 對照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注:HC: 對照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對照組比較P<0.01

2.3 內(nèi)源性AD患者外周血IL-17+Foxp3+Treg細胞比例增高 內(nèi)源性AD組外周血IL-17+Foxp3+Treg細胞百分比比對照組、外源性AD組明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);外源性AD組外周血IL-17+Foxp3+Treg細胞百分比與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖9、10。

注: HC: 對照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注: HC: 對照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對照組比較P<0.05;△與外源性AD組比較P<0.05

3 討論

AD是一種基于多種臨床表現(xiàn)的慢性瘙癢性復發(fā)性炎癥性皮膚病。近年來,在AD的發(fā)病機制的各種假說中,免疫功能的改變占據(jù)了重要地位。

Treg細胞功能缺失或受到抑制而導致機體對過敏原的免疫耐受力降低可能是AD發(fā)病的重要機制[4]。AD根據(jù)免疫機制被分為內(nèi)源性AD和外源性AD兩種類型[14]。外源性AD表現(xiàn)為Th2的免疫反應,內(nèi)源性AD患者中Th17活化程度要高于外源性AD患者[15]。

Treg細胞調(diào)節(jié)自身免疫反應,在許多自身免疫、過敏和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[17]。Treg細胞可通過抑制Teffs的活性和增殖來防止過度的免疫反應,從而增強免疫耐受,維持免疫穩(wěn)態(tài)。因此,Treg細胞對于維持外周耐受性、預防自身免疫性疾病和限制炎癥反應至關(guān)重要。Treg細胞在AD發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越引起人們的關(guān)注,但對于AD患者中Treg細胞的具體類型、數(shù)量及確切功能尚不清楚,既往對AD患者Treg細胞的研究[12-13]結(jié)果也存在爭議。

CD4+CD25+Foxp3+細胞是最具特征的Treg細胞,在人類中,CD4+CD25+Foxp3+細胞占外周血CD4+細胞總數(shù)的5%～15%[18]。CD4+CD25+Foxp3+Tregs參與調(diào)節(jié)過敏原特異性免疫反應,以及抑制抗原提呈細胞(APC)、效應T細胞和肥大細胞功能[19]。IL-10是一種主要由Treg細胞產(chǎn)生的抗炎和免疫抑制細胞因子,它可以抑制Th1、Th2及Th17細胞,抑制炎癥反應,減少炎癥期間的組織損傷[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),AD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T淋巴細胞的百分比及IL-10+Foxp3+Treg細胞比例明顯低于對照組,而內(nèi)源性AD和外源性AD差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明CD4+CD25+Foxp3+Treg及IL-10+Foxp3+Treg細胞比例降低,引起免疫抑制能力減弱,導致了AD疾病的發(fā)生、發(fā)展,并且在內(nèi)源性AD和外源性AD中都有參與,對于Th2、Th17引起的免疫反應均有抑制功能。

CD8+Treg細胞作為一種新的Treg亞型,同樣高水平表達常見的Treg關(guān)鍵標記Foxp3,并在維持自身耐受中發(fā)揮重要作用,獨立于CD4+T細胞,誘導CD4+Foxp3+Treg細胞向Th17轉(zhuǎn)化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)CD8+Foxp3+Treg及IL-10+Foxp3+Treg細胞比例明顯低于對照組,而內(nèi)源性AD和外源性AD差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明CD8+Foxp3+Treg細胞在AD的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要的作用,并且在內(nèi)源性AD和外源性AD中都有參與。

IL-17是Th17標志性的促炎性細胞因子,主要表現(xiàn)為強大的募集和激活中性粒細胞來誘導炎癥。在炎癥條件下,具有抑制功能的Treg細胞保留了分泌IL-17的可塑性,并失去了抑制功能[23]。也有研究表明IL-17+Foxp3+細胞優(yōu)先由記憶CCR6+T細胞產(chǎn)生,包括Treg和傳統(tǒng)T細胞。IL-17+Foxp3+T細胞是功能性Treg細胞群[24]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性AD患者外周血IL-17+Foxp3+Treg細胞百分比明顯高于對照組和外源性AD組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明IL-17+Foxp3+細胞在內(nèi)源性AD的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)主導地位,與Klonowska等[25]報道相一致,并有可能是IL-17細胞因子通過負性調(diào)控TSLP免疫通路阻斷Th2細胞因子作用,最終抑制內(nèi)源性AD中IgE的產(chǎn)生。內(nèi)源性AD以低水平IgE和Th17激活為特征[26]。

本研究證實了外周血中Treg細胞亞群及相應細胞因子分別在內(nèi)源性AD和外源性AD的發(fā)病機制中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。明確AD亞型的發(fā)病機制,有益于基于靶向的免疫治療和研發(fā)新的治療靶點。但Tregs如何調(diào)控效應細胞及其靶點的開發(fā)還有待于進一步研究。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻說明:陳田恬負責調(diào)研整理文獻、論文撰寫;黃顯博、閔瑾雯、張溢峻負責臨床資料收集、數(shù)據(jù)整理;趙艷負責實驗操作、實驗數(shù)據(jù)分析;張慧云、何韶衡負責獲取研究經(jīng)費、技術(shù)或材料支持和指導性支持;孫健負責論文設計、論文審核校對。全體作者都閱讀并同意最終的文本。