瓜蔞薤白半夏湯改善高脂血癥小鼠脂代謝的藥理作用*

樊嶸, 李鐵云, 張姝媗, 徐鼐, 高麗娟, 曾銀珍

1天津市西青醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(天津 300309); 2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院麻醉科(廣東廣州 510515)

高脂血癥是指血脂水平異常升高,可直接導(dǎo)致一些嚴(yán)重危害人類健康的疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和胰腺炎[1],已被證明是心血管疾病發(fā)展的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素。在中國(guó),至少有41.9%的成年人患有高脂血癥;有研究表明,到2030年,中國(guó)將有920萬(wàn)因高脂血癥引起的心血管疾病患者[2]。早期發(fā)現(xiàn)和治療高脂血癥,對(duì)減少心血管疾患和過(guò)早死亡至關(guān)重要。目前,采用多種方式改善高脂血癥,包括改變生活方式、飲食干預(yù)和藥物治療等[3]。其中,他汀類藥物是治療高脂血癥的主要藥物。盡管全世界都在使用,但其長(zhǎng)期治療效果仍然值得懷疑。臨床發(fā)現(xiàn),他汀類藥物作為一線治療藥物,會(huì)導(dǎo)致肌肉疼痛、虛弱[4]和抑郁癥[5]的發(fā)生率略有增加。而且,這類藥物不能降低70歲及以上患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[6]。而且長(zhǎng)期使用他汀類藥物進(jìn)行降脂治療將不可避免地對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響,并可能隨著耐藥性的發(fā)展需要進(jìn)一步增加藥物劑量。因此,迫切地需要提出和應(yīng)用一種安全有效的替代療法或輔助療法。中草藥療法為發(fā)現(xiàn)和引入新的治療方案提供了可靠的來(lái)源[7-8]。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù),草藥中的生物活性化合物大多是安全的,而且耐受性很好[9-10]。目前,越來(lái)越多的臨床研究證明了中醫(yī)藥治療高脂血癥的安全性和有效性,這些治療方法可以有效地降低患者的血脂水平,降低了心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[11],減輕肥胖患者的體重,改善疲倦、嗜睡等臨床癥狀[12]。瓜蔞薤白半夏湯最早是在張仲景的《金匱要略》提出來(lái)的,主治痰濁阻胸、胸痛氣短咳喘等。近年來(lái)臨床上多用于治療冠心病、心絞痛等[13-14]。然而,目前該方對(duì)高脂血癥的藥理作用及機(jī)制研究尚不夠深入。本研究自2022年1—9月,在建立高脂血癥小鼠模型的基礎(chǔ)上,對(duì)瓜蔞薤白半夏湯調(diào)節(jié)血脂和肝臟功能的藥理作用開(kāi)展研究,為該方劑的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 瓜蔞、薤白、清水半夏均購(gòu)自亞洲大藥房;黃酒購(gòu)自紹興女兒紅釀酒有限公司;高脂飼料含60 kcal%脂肪,Lot# D12492,Research Diets(USA);三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、游離脂肪酸(FFA)、同型半胱氨酸(Hcy)、脂蛋白脂肪酶(LPL)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司;載脂蛋白B(ApoB)酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自江蘇酶免公司。蘇木素染液、油紅O染液試劑盒購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。甘油明膠封片劑、中性樹(shù)膠購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 全自動(dòng)生化分析儀,MINDRAY;臺(tái)式低溫離心機(jī),EPPENDORF;病理切片機(jī)、冰凍切片機(jī),上海徠卡儀器有限公司;脫水機(jī)、包埋機(jī)、組織攤片機(jī),武漢俊杰電子有限公司;顯微鏡,OLYMPUS。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 6周齡雄性C57BL/6J小鼠36只,體重約21 g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。本研究通過(guò)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所的動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批(倫理審查編號(hào):IACUC of AMMS-04-2021-041)。所有動(dòng)物均在軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房分籠飼養(yǎng),每籠6只,動(dòng)物飼養(yǎng)室保持溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度40%～70%,自然晝夜節(jié)律光照,動(dòng)物自由攝食,飲水。普通飼料購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 將瓜蔞240 g,薤白180 g,清水半夏240 g,切碎后用黃酒600 mL浸泡過(guò)夜,加純凈水大火煎至沸騰,轉(zhuǎn)小火繼續(xù)煮30 min,過(guò)濾棄去藥渣,將藥液繼續(xù)小火煮直到濃縮至600 mL(濃度為1 g/mL),晾涼后分裝,-20℃保存。使用時(shí)用37℃水浴鍋復(fù)溫[15-16]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 36只動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(n=12)和造模組(n=24),對(duì)照組給予普通飼料,造模組給予高脂飼料,各組小鼠均自由攝食飲水,連續(xù)12周,禁食不禁水,眼眶眥靜脈采血,離心獲得血漿,測(cè)定TG、TC、HDL-C和LDL-C,將造模成功小鼠分為模型組和藥物組,各12只,均繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng),對(duì)照組繼續(xù)給予普通飼料。藥物組給予瓜蔞薤白半夏湯灌胃給藥,2次/d,400 μL/次,連續(xù)給藥16周。每周稱量記錄體重1次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,眼球取血后處死,制備血漿,取肝臟進(jìn)行生化和組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 血脂水平檢測(cè) 使用試劑盒測(cè)定TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA、ALT、AST等生化指標(biāo)。采用ELISA法檢測(cè)血漿ApoB水平。

1.2.4 肝臟脂質(zhì)代謝水平檢測(cè) 取適量肝組織,稱重后加入生理鹽水,研磨制備勻漿,冰上操作,2 500 r/min,4℃離心10 min,取上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū),檢測(cè)TC、TG、LPL、ALT和AST。

1.2.5 肝臟形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取部分新鮮肝臟于4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水、石蠟包埋切片后,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察、拍照。取部分新鮮肝臟做冰凍切片,油紅O染色和蘇木素染色,顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)高脂血癥小鼠血脂水平的影響 與對(duì)照組相比,模型組中TC、TG、LDL-C均顯著升高(P<0.05),模型制備成功。與模型組相比,藥物組TC、TG、LDL-C均顯著降低,HDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。此外,模型組ApoB、FFA和Hcy均高于對(duì)照組,而藥物組ApoB、FFA和Hcy水平較模型組顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠TC、TG、HDL-C及LDL-C水平比較

表2 各組小鼠ApoB、FFA及Hcy水平比較

2.2 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)高脂血癥小鼠肝臟脂質(zhì)水平、脂蛋白脂酶活性及肝臟功能的影響 與對(duì)照組相比,模型組中小鼠肝臟TC、TG均顯著升高(P<0.05),模型制備成功。與模型組相比,藥物組TC、TG均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。與對(duì)照組比較,模型組肝臟LPL活性顯著降低,而給藥后,LPL活性明顯升高(P<0.05),見(jiàn)表4。血漿中ALT和AST指標(biāo)檢測(cè)表明,模型組兩項(xiàng)指標(biāo)均高于對(duì)照組,而藥物組兩項(xiàng)指標(biāo)均顯著低于模型組(P<0.05);同時(shí),模型組肝組織ALT和AST較對(duì)照組顯著升高,而藥物組則逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象,見(jiàn)表5。

表3 各組小鼠肝臟脂質(zhì)水平比較

表4 各組小鼠肝臟LPL活性比較

表5 各組小鼠肝功能的比較

2.3 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)高脂血癥小鼠肝臟組織形態(tài)的影響 由HE染色可見(jiàn),對(duì)照組肝組織整體結(jié)構(gòu)基本正常,肝細(xì)胞飽滿,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,組織內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肝組織整體結(jié)構(gòu)異常,肝細(xì)胞飽滿,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,大部分肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂滴空泡(黑色箭頭所示),門脈區(qū)可見(jiàn)纖維組織增多(藍(lán)色箭頭所示),組織內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物組上述病理改變均有不同程度改善。可見(jiàn)肝組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常,肝細(xì)胞飽滿,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,中央靜脈淤血(黃色箭頭所示),部分肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)小的脂滴空泡(黑色箭頭所示),組織內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)油紅(OR)染色,對(duì)照組肝組織整體結(jié)構(gòu)基本正常,肝細(xì)胞飽滿,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,組織內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肝組織整體結(jié)構(gòu)異常,肝細(xì)胞飽滿,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,大部分肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)紅色脂滴(黑色箭頭所示),組織內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。和模型組相比,藥物組明顯改善?？梢?jiàn)肝組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常,肝細(xì)胞飽滿,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,部分肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)小的紅色脂滴(黑色箭頭所示),組織內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖1。

圖1 肝組織病理切片染色(×200)

3 討論

脂代謝異常是以TC、LDL-C和TG增加或HDL-C降低為特征的慢性代謝性疾病[17]。如果沒(méi)有得到有效的控制,脂代謝異常會(huì)導(dǎo)致心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的增加[18]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),高血漿膽固醇濃度影響了全球?qū)⒔?0%人口的健康。流行病學(xué)報(bào)告研究顯示,脂代謝異常影響了34%中國(guó)成年人[19]。

高脂血癥是一種常見(jiàn)的血脂紊亂癥,分為原發(fā)性和繼發(fā)性高脂血癥。原發(fā)性高脂血癥的病因主要是LPL缺乏以及β脂蛋白紊亂等;繼發(fā)性高脂血癥主要是肥胖、1型和2型糖尿病、藥物治療、腎臟及肝臟疾病等引起。高脂血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、心血管并發(fā)癥、胰腺疾病和脂肪肝等疾病的最重要的危險(xiǎn)因素之一[20]。高脂血癥的主要特征是TG、TC和低密度脂蛋白(LDL)水平升高,或高密度脂蛋白(HDL)含量降低,LDL和HDL主要是作為磷脂、膽固醇和TG的乳化劑和轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮作用。國(guó)際血脂異常研究(DYSIS)和中國(guó)他汀類藥物促進(jìn)急性冠脈綜合征降脂研究(CHILAS)的中國(guó)數(shù)據(jù)也顯示,中國(guó)患者的LDL-C依從率仍處于較低水平。據(jù)統(tǒng)計(jì),中國(guó)人群中血脂異常的患病率約占總?cè)丝诘?0%。特別是低高密度脂蛋白血癥的患病率為44.8%;三酰甘油血癥的患病率為11.3%;高膽固醇血癥的患病率為3.3%;高低密度脂蛋白血癥的患病率為2.1%[21]。

中醫(yī)上將高脂血癥稱為“脂濁”,認(rèn)為食物中過(guò)多的厚濁成分不能被機(jī)體吸收利用,堆積下來(lái)化為濁。這與西醫(yī)上講的“血脂過(guò)高”屬于同一概念。有研究證實(shí),痰濁型患者體內(nèi)TG、TC和LDL-C明顯升高,認(rèn)為血脂異常升高與“痰濁”密切相關(guān)[22]。血癥論中提到“須知痰水之壅,由瘀血使然”。該理論認(rèn)為痰濁會(huì)造成氣血受阻,進(jìn)而血瘀,久而久之,則形成瘀濁。而西醫(yī)上認(rèn)為,血脂升高,導(dǎo)致脂質(zhì)沉積于血管壁,二者理論有異曲同工之處。總之,血脂升高是導(dǎo)致血液黏稠度增加和血瘀的重要原因,也是進(jìn)而產(chǎn)生瘀濁的重要病理基礎(chǔ)[23]。

中草藥在世界范圍內(nèi)已被用作替代藥物。嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)表明,草藥中的生物活性化合物對(duì)改善血脂狀況是有效和安全的[24]。根據(jù)國(guó)際脂質(zhì)專家小組的建議,在不耐受他汀類藥物的人群中使用草藥作為他汀類藥物的降脂替代品[9]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明,藥用植物或植物來(lái)源的單體在體外和體內(nèi)研究中都具有降血脂的特性。這些研究表明,草藥可以干擾控制脂代謝的主要過(guò)程,包括膽固醇合成[25]、外源吸收[26]、轉(zhuǎn)運(yùn)[27]和膽固醇排泄。

瓜蔞和薤白能溫中通陽(yáng),散結(jié)化痰;半夏祛痰燥濕。瓜蔞薤白湯是中醫(yī)治療心臟疾病的經(jīng)典方劑,還有其他功能,包括抗氧化、抗細(xì)胞凋亡和抗炎[28]。瓜蔞薤白湯可以降低缺血再灌注引起的心肌血流量下降、心肌梗死和心肌細(xì)胞凋亡,改善心功能和心肌結(jié)構(gòu)損傷,通過(guò)抑制RhoA和ROCK表達(dá)恢復(fù)ADP/ATP和AMP/ATP比值的下降[29]。含有半夏的湯劑也被用于治療高脂血癥。半夏白術(shù)天麻湯由半夏等6種中草藥組成。對(duì)大鼠的研究表明,半夏白術(shù)天麻湯能降低高脂血癥大鼠的血清TC、TG、LDL-C、ApoB、超氧化物歧化酶和丙二醛[30]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)半夏白術(shù)天麻湯對(duì)肥胖高血壓小鼠的體重和TC有顯著影響,可減少動(dòng)脈根部脂質(zhì)沉積,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,減少細(xì)胞凋亡,降低氧化LDL引起的遷移速度,維持細(xì)胞形態(tài)[31]。

眾所周知,LDL-C的主要功能是將膽固醇運(yùn)送到肝外組織,過(guò)載時(shí)會(huì)造成其沉積于血管壁上,形成粥樣斑塊,是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變的基本因素;而HDL-C負(fù)責(zé)膽固醇由肝外向肝內(nèi)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞通過(guò)識(shí)別LDL表面ApoB對(duì)LDL進(jìn)行攝取加工,所以說(shuō)ApoB是LDL的參考指標(biāo)之一[32]。因此,降低TG、TC和LDL-C水平及提高HDL-C水平有利于防治脂質(zhì)沉積。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)瓜蔞薤白半夏湯可以降低高脂血癥小鼠的TG、TC、LDL-C、ApoB以及FFA水平,雖然對(duì)HDL-C的下調(diào)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是有明顯的改善趨勢(shì)。這些改變可以有效抑制膽固醇的積累,都是脂代謝異常明顯改善的標(biāo)志,可以延緩心血管疾病的發(fā)展進(jìn)程。LPL是可以催化TG水解成為脂肪酸和甘油,還可以幫助磷脂和載脂蛋白轉(zhuǎn)移到HDL-C,促進(jìn)脂質(zhì)排泄,LPL表達(dá)不足或者活性降低都將影響機(jī)體代謝進(jìn)程[33]。因此,調(diào)節(jié)LPL是治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。本研究發(fā)現(xiàn),瓜蔞薤白半夏湯可以明顯改善高脂飲食引起的LPL水平降低,提示瓜蔞薤白半夏湯促進(jìn)LPL對(duì)TG的代謝可能是其改善高脂血癥的途徑之一。

肝臟是脂代謝的重要器官,富含多種脂質(zhì)代謝相關(guān)酶類物質(zhì),脂質(zhì)在這些酶的作用下完成攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及排泄等過(guò)程[34]。中醫(yī)理論認(rèn)為痰濁血瘀日積月累可以造成對(duì)臟腑的損傷,尤其影響肝的藏血疏泄功能,而西醫(yī)理論認(rèn)為脂肪肝的發(fā)生是由過(guò)量脂肪沉積于肝細(xì)胞,影響了肝臟的正常代謝,二者殊途同歸,都認(rèn)為脂代謝異?？梢栽斐筛闻K損傷。對(duì)此,中醫(yī)提出給予疏肝活血、健脾化痰和清熱燥濕[35]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)瓜蔞薤白半夏湯還可以降低血漿和肝組織轉(zhuǎn)氨酶的水平,而且肝組織病理切片顯示。這些結(jié)果都表明瓜蔞薤白半夏湯可以明顯減輕肝組織脂肪沉積,對(duì)于恢復(fù)肝功能,促進(jìn)脂代謝有積極意義。

綜上所述,本研究建立了高脂飼料喂養(yǎng)的高脂血癥小鼠模型,給予瓜蔞薤白半夏湯后高脂血癥小鼠血液和肝臟組織中的高脂血癥癥狀明顯減輕,顯示出其作為治療高脂血癥的可靠藥物的潛力,也揭示了多種植物衍生藥物聯(lián)合應(yīng)用在治療復(fù)雜代謝疾病方面的巨大價(jià)值。然而,我們目前的研究存在局限性。例如,瓜蔞薤白半夏湯治療高脂血癥的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探索。對(duì)此,我們下一步將從瓜蔞薤白半夏湯改善LPL活性入手,采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和腸道微生物測(cè)序技術(shù)聯(lián)合分析,從膽固醇及膽汁酸的代謝入手,對(duì)瓜蔞薤白半夏湯抗高脂血癥藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制開(kāi)展深入研究。

利益相關(guān)聲明:各作者聲明沒(méi)有利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:樊嶸負(fù)責(zé)基金申請(qǐng)及論文撰寫(xiě)等工作,李鐵云和張姝媗負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集等,徐鼐和高麗娟負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖等,曾銀珍負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及論文修改等工作。