雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失衡與妊娠高血壓疾病胎盤血管病變發(fā)生的關(guān)系*

高倩, 張愛萍, 王海娜

青海紅十字醫(yī)院 1產(chǎn)一科, 2婦三科(青海西寧 810000)

妊娠高血壓是孕婦的常見疾病,主要癥狀是妊娠20周后血壓持續(xù)升高、蛋白尿和水腫。這些癥狀會影響胎兒的正常發(fā)育,妊娠高血壓對孕婦也有害,當(dāng)發(fā)生妊娠高血壓時,腎小球濾過屏障的通透性增加,大量的白蛋白被腎小球過濾,進(jìn)而引起水腫和代謝紊亂等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。肝臟是新陳代謝的主要器官,孕婦血清中雌激素和黃體酮水平較高,明顯影響肝臟的代謝過程,從而增加酶的合成和分泌,加速有害物質(zhì)的代謝[2]。在妊娠高血壓患者中,由于肝小動脈血管收縮和肝缺血性損傷,肝臟代謝受到抑制,影響孕婦的健康,研究表明,高血壓會導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷,最終可能導(dǎo)致多種血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。雌二醇(E2)是最常見的循環(huán)雌激素形式,E2與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的經(jīng)典雌激素受體(ERs),雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)結(jié)合。E2結(jié)合的ER復(fù)合物經(jīng)歷構(gòu)象變化以二聚化,易位到細(xì)胞核,并直接與稱為雌激素反應(yīng)元件(EREs)的DNA序列結(jié)合,或通過其他轉(zhuǎn)錄因子間接結(jié)合到DNA以差異調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[4]。研究顯示E2與纖維化減少、氧化應(yīng)激減少、線粒體功能改善、心臟肥大減弱以及血管生成和血管舒張刺激有關(guān)[5]。相關(guān)研究顯示血管內(nèi)皮保護(hù)因子可維持血管張力和血壓穩(wěn)定,E2水平的降低可能誘發(fā)心血管疾病[6]。此外,相關(guān)研究先兆子癇中E2、丙二醇和黃體酮的水平異常[7]。但確切機(jī)制尚不清楚。 2022年1月至2022年9月期間本研究主要研究雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失衡在妊娠高血壓疾病胎盤血管病變發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 購買了48只體重210～250 g(年齡7周)的成年SD大鼠。所有大鼠都可以隨意獲得食物和水,并在(21±3)℃、(62±3)%濕度和12 h光/暗循環(huán)的穩(wěn)定環(huán)境中維持。將雌性大鼠與雄性大鼠關(guān)在籠子里24 h,并通過陰道涂片中存在陰道塞和精子來確認(rèn)交配。檢測到授精的日期被指定為懷孕的第1天。動物實驗的實驗方案遵循美國國立衛(wèi)生研究院《實驗動物護(hù)理與使用指南》,該研究得到了青海紅十字醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審核通過(L0115610)。

1.2 高血壓大鼠模型的建立 本研究通過腹膜內(nèi)注射一氧化氮合酶(NOS)抑制劑N(ω)-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)建立了高血壓大鼠模型。懷孕的大鼠從第11天到第18天腹膜內(nèi)注射L-NAME(50 mg/kg,1次/d)以建立高血壓模型。將大鼠分為3組[對照組(n=16)、模型組(n=16)、模型+E2組(n=16)]。對照組的妊娠大鼠從第11天到第18天腹膜內(nèi)注射生理鹽水。模型組每天注射1次L-NAME(50 mg/kg)。模型+E2組每天接受50 mg/kg L-NAME加100 μg/kg E2激動劑,在第8天檢測到這些懷孕大鼠尾動脈的血壓(收縮壓),確認(rèn)高血壓模型的建立。從這些大鼠中收集24 h尿液樣本以檢測尿蛋白含量的變化。所有懷孕的大鼠在3周后被處死。然后收集胎盤組織并使用蘇木精和曙紅(HE)染色。

1.3 血壓和尿蛋白測量 使用大鼠血壓計檢測大鼠尾動脈的血壓,以確認(rèn)高血壓模型的建立。最初加熱了老鼠的尾巴,使用固定器來限制老鼠的運動。使用大鼠血壓計檢測血壓(收縮壓),檢測大鼠尾巴上的相同位置。收集懷孕大鼠的尿量。使用雙辛可寧酸(BCA)(中國江蘇Beyotime)方法檢查尿蛋白含量。

1.4 HE染色 對于胎盤的組織病理學(xué)分析,將組織樣品在室溫下固定在10%磷酸鹽緩沖福爾馬林中48 h,包埋在石蠟中,切成5 mm切片并放置在載玻片上。用0.5%的H&E溶液染色切片,并在×200放大倍率下的光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯公司)下進(jìn)行檢查。隨機(jī)選擇每個切片上胎盤組織的5個視野。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析 使用RIPA(Beyotime)用于從組織中提取蛋白質(zhì)。使用BCA方法測定樣品濃度。將上樣緩沖液(Beyotime)加入樣品中,并在99℃下孵育10 min。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE;貝約時間)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,Billerica,MA,USA)中,并用5%脫脂奶粉封閉膜并與一抗在4℃下孵育過夜。第二天,用磷酸鹽緩沖鹽水吐溫-20(PBST)洗滌膜3次。然后將膜與第二種抗體在室溫下孵育2 h,并用PBST洗滌膜3次并使用Tanon 4600暴露(Tanon Co.上海,中國)。

2 結(jié)果

2.1 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在妊娠高血壓疾病的表達(dá) 檢測雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在妊娠高血壓疾病的表達(dá),通過蛋白質(zhì)印跡分析評估ERα36、ERα、ERβ和G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)的蛋白質(zhì)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組ERα36、ERα和ERβ蛋白明顯下調(diào),而模型+E2組雌激素信號通路升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而GPER表達(dá)三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

表1 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在妊娠高血壓疾病的表達(dá)

2.2 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對血壓和尿蛋白含量的影響 妊娠期高血壓是一種正常的婦科疾病。本研究構(gòu)建了一個大鼠模型來研究懷孕期間的高血壓。測量血壓以確認(rèn)高血壓模型的建立和E2激動劑的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組血壓明顯高于對照組,尿蛋白含量也比對照組升高。但與模型組相比,模型+E2組大鼠的血壓顯著下降,尿蛋白含量也顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對血壓和尿蛋白含量的影響

2.3 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對胎盤組織病理學(xué)的影響 HE染色觀察胎盤的病理變化(均在400倍鏡下觀察)。對照組胎盤絨毛的主細(xì)胞為合體滋養(yǎng)母細(xì)胞,與對照組相比,模型組胎盤絨毛中的細(xì)胞膽細(xì)胞較少,胎盤絨毛數(shù)量減少,胎盤絨毛結(jié)構(gòu)萎縮,部分絨毛出現(xiàn)纖維蛋白樣壞死,滋養(yǎng)層細(xì)胞在模型組出現(xiàn)代償性增殖。而模型+E2組胎盤絨毛纖維化和合體營養(yǎng)母細(xì)胞結(jié)節(jié)減少。因此,E2激動劑減少了妊娠期間高血壓在胎盤中引起的結(jié)節(jié)和病變的形成。見圖2。

圖2 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對胎盤組織病理學(xué)的影響(×400倍)

2.4 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對妊娠高血壓中血管內(nèi)皮細(xì)胞作用 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在內(nèi)皮血管的健康中起著至關(guān)重要的作用,內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)對血管內(nèi)皮的健康也至關(guān)重要。因此,蛋白質(zhì)印跡檢測大鼠胎盤組織中的VEGF和eNOS表達(dá)。結(jié)果表明,與對照組相比,模型構(gòu)建后VEGF和eNOS表達(dá)被抑制,而模型+E2組eNOS和VEGF水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外,C反應(yīng)蛋白(CRP)是一種廣泛研究的炎癥標(biāo)志物,它通常用于預(yù)測心血管疾病的風(fēng)險。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比,模型組大鼠胎盤組織中的CRP水平增高,與模型組相比,模型+E2組的CRP水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對妊娠高血壓中血管內(nèi)皮細(xì)胞作用

2.5 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對妊娠高血壓胎盤TLR4信號通路中關(guān)鍵分子表達(dá)的影響 與對照組相比,模型組TLR4、MyD88、p-IRAK4和TRAF6蛋白表達(dá)顯著增加,而模型+E2組TLR4、MyD88、p-IRAK4和TRAF6蛋白表達(dá)較模型組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖4。

圖4 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對妊娠高血壓胎盤TLR4信號通路中關(guān)鍵分子表達(dá)的影響

表4 雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對妊娠高血壓胎盤TLR4信號通路中關(guān)鍵分子表達(dá)的影響

3 討論

妊娠高血壓是妊娠期的常見疾病。它包括先兆子癇、子癇和妊娠高血壓,也是全世界孕產(chǎn)婦死亡的重要原因,妊娠高血壓的發(fā)展還伴有蛋白尿、水腫和血管內(nèi)皮損傷。血管內(nèi)皮損傷和功能障礙是多種高血壓類型(包括妊娠高血壓)的主要并發(fā)癥[8]。相關(guān)研究顯示雌激素通過影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)以增加血容量并調(diào)節(jié)內(nèi)皮活性以誘導(dǎo)血管收縮劑的釋放,從而在PE中起到保護(hù)作用[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2治療減輕了L-NAME誘導(dǎo)的妊娠高血壓大鼠模型中的不良妊娠結(jié)局,這些效應(yīng)與內(nèi)皮功能障礙的減少以及胎盤的組織學(xué)改善有關(guān)。

研究顯示PE大鼠血清生化指數(shù)和妊娠結(jié)局發(fā)生異常變化,PE組的血壓、尿蛋白和胎兒死亡水平升高,而胎兒體重下降,高血壓是導(dǎo)致PE和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)損傷的病理生理學(xué)因素之一[10]。E2通過降低血壓、尿蛋白和死產(chǎn)率,增加胎兒體重和減輕病理性損傷,改善了生化指標(biāo)和新生兒結(jié)局,表明PE的改善與E2治療有關(guān)[11]。此外,先前的研究表明,L-NAME誘導(dǎo)大鼠血壓升高,并且iNOS和NO的產(chǎn)生較低參與正常妊娠期間發(fā)生的脈管系統(tǒng)的適應(yīng)性重建,并在維持恒定的血管張力和血壓穩(wěn)定方面起重要作用[12]。在本研究中,本研究的結(jié)果還表明,E2降低了妊娠高血壓大鼠的血壓及尿蛋白,可能是妊娠高血壓的有益治療方法。ERα36是ERα的膜變體,也受到雌激素信號傳導(dǎo)失調(diào)的影響,ERα已被證明可以以雌激素非依賴性方式抑制ERα36啟動子的活性,ERα36已被確定為惡性肝病中E2作用的介質(zhì),并且可能參與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13]。與先前的結(jié)果一致,本研究的結(jié)果表明,與正常妊娠大鼠相比,妊娠高血壓大鼠通過E2處理后上調(diào)了妊娠高血壓大鼠胎盤中ERα36,ERα和ERβ的表達(dá)。

VEGF是一種引起血管生成并維持血管內(nèi)皮細(xì)胞健康的蛋白質(zhì)。VEGF的上調(diào)可以保護(hù)HUVECs免受細(xì)胞凋亡,CRP是血管內(nèi)皮炎癥和損傷的指標(biāo),較高的CRP水平會增加高血壓和腦血管疾病的風(fēng)險[14]。在這項研究中發(fā)現(xiàn)妊娠高血壓大鼠血漿和胎盤組織中VEGF和eNOS表達(dá)較低,但與對照組相比,CRP水平較高。因此,本研究結(jié)果表明,妊娠高血壓與血管內(nèi)皮損傷有關(guān),妊娠高血壓可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和功能障礙。而E2激動劑組降低了CRP、VEGF和eNOS的表達(dá),表明E2治療可改善血管內(nèi)皮損傷。

在本研究中,E2的抗血管功能障礙特性可能部分是通過抑制MyD88和TRAF6表達(dá),抑制TLR4途徑以及IRAK4的磷酸化介導(dǎo)。研究顯示TLR4信號通路在自身免疫性疾病以及與人類各種疾病相關(guān)的血管功能障礙和病理損傷中起重要作用,MyD88和TRAF-6是重要的細(xì)胞內(nèi)適配器蛋白,可作為TLR4信號級聯(lián)反應(yīng)的效應(yīng)子,MyD88激活和磷酸化IRAK4,導(dǎo)致TRAF6的募集并促進(jìn)炎癥,TLR4通過將IRAK4募集到膜上來激活細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4/MyD88/IRAK4/TRAF6信號通路在妊娠高血壓大鼠中被激活,而E2處理后其表達(dá)降低。TLR4/MyD88/IRAK4/TRAF6通路的調(diào)控可能參與E2對L-NAME誘導(dǎo)的妊娠高血壓病理過程的影響。E2與ERα36的結(jié)合可能通過依賴于妊娠高血壓中TLR4激活的機(jī)制參與血管生成。

綜上所述,本研究的結(jié)果表明E2可以改善妊娠高血壓大鼠結(jié)局。E2的保護(hù)作用可以通過與ERα36結(jié)合,來降低胎盤血管生成因子以及TLR4/MyD88/IRAK4/TRAF6信號傳導(dǎo)的表達(dá)。因此,E2可能是治療妊娠高血壓的潛在治療方法。

利益相關(guān)聲明:本文所有作者聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:高倩負(fù)責(zé)了論文的全部撰寫和進(jìn)行本研究中動物實驗、分子實驗的設(shè)計;張愛萍負(fù)責(zé)實施了論文中動物實驗造模、分子實驗、免疫組化等,王海娜在論文修改、討論以及研究設(shè)計中都有巨大貢獻(xiàn)。