黃芪多糖對MC-3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制研究

王劉玉,萬全會,陳軍

(南陽市第二人民醫(yī)院,河南 南陽 473003)

骨質(zhì)疏松癥是以骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的臨床常見骨病,骨質(zhì)疏松癥患者骨骼脆性的增加會使骨折風(fēng)險增加,不僅影響患者的生活質(zhì)量,也增加了家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病涉及多因素、多環(huán)節(jié)、多機(jī)制,其中成骨細(xì)胞的增殖和分化受到抑制是造成骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)破壞的重要環(huán)節(jié)[1-2]。因此,調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和分化也被認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松癥的重要研究方向。近年來,中藥湯劑在骨質(zhì)疏松癥治療中的價值受到了越來越多的關(guān)注。黃芪是具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表作用的一味中藥,是多種具有補(bǔ)骨作用的中藥方劑的重要組成藥物[3-6]。黃芪多糖是黃芪中的多糖類活性成分,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[7],調(diào)控成骨細(xì)胞中維生素D受體、1α-羥化酶、24-羥化酶的表達(dá)[8-9]。為了進(jìn)一步探討黃芪多糖對成骨細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制,我們以MC-3T3-E1成骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行了相關(guān)研究,現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料MC-3T3-E1成骨細(xì)胞,購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Hyclone公司,黃芪多糖、腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制劑Compound C(美國Sigma公司),MTS細(xì)胞活力檢測試劑盒(美國Promega公司),放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(上海碧云天生物科技公司),堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-lymphoblastoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-related X protein,BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,Caspase)-3、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記免疫球蛋白G二抗(美國Abcam公司),增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影液(美國Thermo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器HERAcell 240型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),Synergy LX型多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司),ChemiDoc MP化學(xué)顯影儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方 法

2.1 MC-3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MC-3T3-E1成骨細(xì)胞,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面90%后,用胰蛋白酶進(jìn)行消化,按照1∶3的比例進(jìn)行傳代。傳代后的細(xì)胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)和消化傳代,收集第3代細(xì)胞,接種于培養(yǎng)板中進(jìn)行分組及干預(yù)處理。

2.2 分組及干預(yù)方法將收集的第3代MC-3T3-E1成骨細(xì)胞,分別接種于96孔和12孔培養(yǎng)板,各接種25孔,各分為黃芪多糖低、中、高濃度組及黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組、對照組,每組各5孔。黃芪多糖低、中、高濃度組分別用含有0.1 mol·L-1、1.0 mol·L-1、10 mol·L-1黃芪多糖的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組用含有10 mol·L-1黃芪多糖和10 μmol·L-1Compound C的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),對照組用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 MC-3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活力檢測方法培養(yǎng)24 h后,于96孔培養(yǎng)板內(nèi),分別加入20 μL MTS試劑,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板后,充分震蕩,在酶標(biāo)儀上測定各樣品于490 nm波長處的吸光值。

2.4 MC-3T3-E1成骨細(xì)胞增殖相關(guān)基因蛋白表達(dá)檢測方法培養(yǎng)24 h后,棄去12孔培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基,加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞,離心后提取總蛋白。采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度,每個樣品取30 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后,將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,用5%脫脂牛奶在室溫封閉2 h,加入ALP、OCN、Bcl-2、BAX、Caspase-3、p-AMPK、eNOS一抗,于4 ℃孵育過夜;洗膜后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記免疫球蛋白G二抗,于室溫孵育2 h;加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影液。于化學(xué)顯影儀中顯影、拍照,用imageJ軟件分析蛋白條帶灰度值,以β-肌動蛋白為參考,計算各蛋白的相對表達(dá)量。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。細(xì)胞增殖活力及ALP、OCN、Bcl-2、BAX、Caspase-3、p-AMPK、eNOS蛋白表達(dá)量的組間比較均采用單因素方差分析,組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 MC-3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果黃芪多糖低、中、高濃度組及黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組、對照組細(xì)胞增殖活力比較,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.59±0.06,0.71±0.08,0.97±0.14,0.60±0.07,0.41±0.06,F=28.832,P=0.000)。黃芪多糖低、中、高濃度組細(xì)胞增殖活力及黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組均大于對照組(LSD-t=4.743,P=0.002;LSD-t=6.708,P=0.000;LSD-t=8.221,P=0.000;LSD-t=4.608,P=0.002);黃芪多糖低濃度組細(xì)胞增殖活力與黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=0.243,P=0.811),黃芪多糖中、高濃度組細(xì)胞增殖活力均大于黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組(LSD-t=2.314,P=0.049;LSD-t=5.286,P=0.001);黃芪多糖低、中濃度組細(xì)胞增殖活力均小于黃芪多糖高濃度組(LSD-t=5.579,P=0.001;LSD-t=4.423,P=0.010);黃芪多糖低濃度組細(xì)胞增殖活力小于黃芪多糖中濃度組(LSD-t=2.683,P=0.028)。

3.2 MC-3T3-E1成骨細(xì)胞成骨標(biāo)志基因蛋白表達(dá)檢測結(jié)果5組細(xì)胞ALP、OCN的蛋白表達(dá)量比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。黃芪多糖低、中、高濃度組細(xì)胞ALP、OCN的蛋白表達(dá)量均高于對照組(ALP:LSD-t=3.528,P=0.008;LSD-t=4.417,P=0.002;LSD-t=6.822,P=0.000;OCN:LSD-t=3.153,P=0.014;LSD-t=6.485,P=0.000;LSD-t=6.543,P=0.000)和黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組(ALP:LSD-t=2.414,P=0.042;LSD-t=3.155,P=0.013;LSD-t=5.892,P=0.000;OCN:LSD-t=2.339,P=0.047;LSD-t=5.926,P=0.000;LSD-t=14.546,P=0.000),黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組細(xì)胞ALP、OCN的蛋白表達(dá)量與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.186,P=0.270;LSD-t=1.145,P=0.285);黃芪多糖低、中濃度組細(xì)胞ALP、OCN的蛋白表達(dá)量均低于黃芪多糖高濃度組(ALP:LSD-t=3.727,P=0.006;LSD-t=3.702,P=0.006;OCN:LSD-t=4.737,P=0.001;LSD-t=2.625,P=0.031);黃芪多糖低濃度組細(xì)胞ALP的蛋白表達(dá)量與黃芪多糖中濃度組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=0.392,P=0.705),黃芪多糖低濃度組細(xì)胞OCN的蛋白表達(dá)量低于黃芪多糖中濃度組(LSD-t=3.366,P=0.010)。見圖1、表1。

表1 5組MC-3T3-E1成骨細(xì)胞成骨標(biāo)志基因蛋白相對表達(dá)量

注:ALP為堿性磷酸酶,OCN為骨鈣素,β-actin為β-肌動蛋白,①為對照組,②為黃芪多糖低濃度組,③為黃芪多糖中濃度組,④為黃芪多糖高濃度組,⑤為黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組。

3.3 MC-3T3-E1成骨細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)基因蛋白表達(dá)檢測結(jié)果5組細(xì)胞中Bcl-2、BAX、Caspase-3的蛋白表達(dá)量比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)量與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.746,P=0.119;LSD-t=0.859,P=0.415),黃芪多糖中、高濃度組細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)量均高于對照組(LSD-t=5.238,P=0.001;LSD-t=9.618,P=0.000)和黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組(LSD-t=3.821,P=0.006;LSD-t=8.246,P=0.000);黃芪多糖低濃度組細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)量與黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=0.620,P=0.552);黃芪多糖低、中濃度組細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)量均低于黃芪多糖高濃度組(LSD-t=8.875,P=0.001;LSD-t=6.102,P=0.000);黃芪多糖低濃度組細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)量低于黃芪多糖中濃度組(LSD-t=3.953,P=0.004)。

黃芪多糖低濃度組細(xì)胞BAX的蛋白表達(dá)量與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.881,P=0.097),Caspase-3的蛋白表達(dá)量低于對照組(LSD-t=2.907,P=0.020);黃芪多糖中、高濃度組細(xì)胞BAX、Caspase-3的蛋白表達(dá)量均低于對照組(BAX:LSD-t=5.285,P=0.001;LSD-t=7.340,P=0.000;Caspase-3:LSD-t=3.654,P=0.006;LSD-t=6.875,P=0.000)和黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組(BAX:LSD-t=3.654,P=0.006;LSD-t=6.875,P=0.000;Caspase-3:LSD-t=2.940,P=0.019;LSD-t=6.314,P=0.000),黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組細(xì)胞BAX、Caspase-3的蛋白表達(dá)量與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.053,P=0.323;LSD-t=0.714,P=0.496);黃芪多糖低濃度組細(xì)胞BAX的蛋白表達(dá)量均低于黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組(LSD-t=3.253,P=0.012;),Caspase-3的蛋白表達(dá)量與黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=2.212,P=0.058);黃芪多糖低、中濃度組細(xì)胞BAX、Caspase-3的蛋白表達(dá)量均高于黃芪多糖高濃度組(BAX:LSD-t=7.442,P=0.001;LSD-t=3.690,P=0.006;Caspase-3:LSD-t=4.496,P=0.002;LSD-t=4.642,P=0.002);黃芪多糖低濃度組細(xì)胞BAX的蛋白表達(dá)量高于黃芪多糖中濃度組(LSD-t=4.548,P=0.002),黃芪多糖低濃度組細(xì)胞Caspase-3的蛋白表達(dá)量與黃芪多糖中濃度組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.728,P=0.088)。見圖2、表2。

表2 5組MC-3T3-E1成骨細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)基因蛋白相對表達(dá)量

注:Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2,BAX為B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白,Caspase-3為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,β-actin為β-肌動蛋白,①為對照組,②為黃芪多糖低濃度組,③為黃芪多糖中濃度組,④為黃芪多糖高濃度組,⑤為黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組。

3.4 MC-3T3-E1成骨細(xì)胞AMPK/eNOS信號通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)檢測結(jié)果5組細(xì)胞中p-AMPK、eNOS的蛋白表達(dá)量比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。黃芪多糖低、中、高濃度組細(xì)胞P-AMPK、eNOS的蛋白表達(dá)量均高于對照組(p-AMPK:LSD-t=3.082,P=0.015;LSD-t=4.546,P=0.002;LSD-t=5.064,P=0.001;eNOS:LSD-t=3.395,P=0.009;LSD-t=5.873,P=0.000;LSD-t=7.327,P=0.000)和黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組(p-AMPK:LSD-t=5.819,P=0.000;LSD-t=6.731,P=0.000;LSD-t=6.961,P=0.000;eNOS:LSD-t=4.851,P=0.001;LSD-t=7.761,P=0.000;LSD-t=8.200,P=0.000),黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組細(xì)胞p-AMPK、eNOS的蛋白表達(dá)量與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.893,P=0.095;LSD-t=1.455,P=0.184);黃芪多糖中、高濃度組細(xì)胞p-AMPK、eNOS的蛋白表達(dá)量均高于黃芪低糖高濃度組(p-AMPK:LSD-t=2.370,P=0.045;LSD-t=3.200,P=0.013;eNOS:LSD-t=2.910,P=0.020;LSD-t=4.985,P=0.001);黃芪多糖中濃度組細(xì)胞p-AMPK的蛋白表達(dá)量與黃芪多糖高濃度組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.048,P=0.325),黃芪多糖中濃度組細(xì)胞eNOS的蛋白表達(dá)量低于黃芪多糖高濃度組(LSD-t=2.564,P=0.033)。見圖3、表3。

表3 5組MC-3T3-E1成骨細(xì)胞磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶/內(nèi)皮型一氧化氮合酶信號通路相關(guān)基因蛋白相對表達(dá)量

注:p-AMPK為磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶,eNOS為內(nèi)皮型一氧化氮合酶,β-actin為β-肌動蛋白,①為對照組,②為黃芪多糖低濃度組,③為黃芪多糖中濃度組,④為黃芪多糖高濃度組,⑤為黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組。

4 討 論

成骨細(xì)胞的分化和增殖受到抑制是骨質(zhì)疏松發(fā)生和發(fā)展過程中的重要病理環(huán)節(jié)。成骨細(xì)胞參與骨形成過程,其正常的分化與增殖能夠保證機(jī)體的骨量及骨質(zhì)量;而成骨細(xì)胞的分化和增殖受到抑制,則會導(dǎo)致機(jī)體骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)改變,進(jìn)而逐步發(fā)展為骨質(zhì)疏松癥。黃芪是補(bǔ)腎壯骨湯、益腎補(bǔ)骨湯等用于治療骨質(zhì)疏松癥中藥方劑中的君藥。黃芪多糖是中藥黃芪中的有效成分,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制炎癥反應(yīng)、減少自由基生成等多種生物學(xué)作用[10-13]。有研究[7,14-15]發(fā)現(xiàn),黃芪多糖能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。但對于黃芪多糖對成骨細(xì)胞增殖的影響尚未明確。我們采用不同濃度的黃芪多糖干預(yù)MC-3T3-E1成骨細(xì)胞,并檢測MC-3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖活力,結(jié)果顯示,濃度為10 mol·L-1的黃芪多糖能夠顯著增強(qiáng)MC-3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖活力,且MC-3T3-E1成骨細(xì)胞中成骨標(biāo)志基因ALP及OCN的蛋白表達(dá)量隨黃芪多糖濃度升高而顯著增加。

成骨細(xì)胞增殖受到抑制與線粒體凋亡途徑的過度激活關(guān)系密切。線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞漿,細(xì)胞色素C能夠通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)激活Caspase-3,進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[16]。BAX和Bcl-2是調(diào)控線粒體途徑凋亡的重要蛋白,BAX能通過促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C,進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡;而Bcl-2則能夠拮抗BAX,抑制細(xì)胞色素C的釋放及線粒體凋亡途徑的激活[17-18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松組織中Bcl-2的蛋白表達(dá)量減少,而BAX、Caspase-3的蛋白表達(dá)量升高[19-20]。我們研究發(fā)現(xiàn),MC-3T3-E1成骨細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)量隨黃芪多糖濃度升高而顯著增加,而BAX和Caspase-3的蛋白表達(dá)量隨黃芪多糖濃度升高而顯著降低。因此,黃芪多糖可能通過抑制成骨細(xì)胞中線粒體凋亡途徑的激活,進(jìn)而減少成骨細(xì)胞凋亡。

AMPK/eNOS信號通路參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡[21-22]。多項(xiàng)研究[23-25]發(fā)現(xiàn),黃芪多糖能夠通過激活A(yù)MPK/eNOS信號通路減輕細(xì)胞損傷。我們分析了不同濃度黃芪多糖干預(yù)后MC-3T3-E1成骨細(xì)胞AMPK/eNOS信號通路相關(guān)基因的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示隨黃芪多糖濃度增加,MC-3T3-E1成骨細(xì)胞p-AMPK和eNOS的蛋白表達(dá)量顯著增加,提示黃芪多糖能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞中AMPK/eNOS信號通路的激活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AMPK/eNOS信號通路與黃芪多糖促進(jìn)細(xì)胞增殖的關(guān)系,我們采用AMPK抑制劑Compound C聯(lián)合10 mol·L-1的黃芪多糖干預(yù)MC-3T3-E1成骨細(xì)胞,結(jié)果顯示,黃芪多糖聯(lián)合抑制劑干預(yù)組細(xì)胞中p-AMPK、eNOS的蛋白表達(dá)量低于黃芪多糖高濃度組,而細(xì)胞增殖活力小于黃芪多糖高濃度組,ALP、OCN、Bcl-2的蛋白表達(dá)量均低于黃芪多糖高濃度組,BAX、Caspase-3的蛋白表達(dá)量均高于黃芪多糖高濃度組。因此,我們認(rèn)為黃芪多糖對成骨細(xì)胞增殖的調(diào)控作用依賴于AMPK/eNOS信號通路的激活。

本研究結(jié)果表明,黃芪多糖能夠促進(jìn)MC-3T3-E1成骨細(xì)胞增殖,且該作用具有一定的濃度依賴性,其作用機(jī)制可能與調(diào)控線粒體凋亡途徑及AMPK/eNOS信號通路有關(guān)。