高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定薏米中3種B族維生素

◎ 商云帥，解道博，謝新娜，羅 婧

（1.吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130507；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112）

B族維生素也叫乙族維生素、維他命B、維生素B復(fù)合體，共8種，統(tǒng)稱(chēng)為族，其結(jié)構(gòu)上沒(méi)有同一性，但有共同特點(diǎn)。維生素B為水溶性維生素，見(jiàn)光易分解，易被氧化，溫度高結(jié)構(gòu)易破壞[1]。維生素B是人體代謝所必須的，是糖、蛋白質(zhì)、脂肪等轉(zhuǎn)化成熱量時(shí)不可或缺的物質(zhì)之一，機(jī)體如果缺少維生素B，會(huì)降低細(xì)胞功能，引起代謝障礙[2-3]。人體無(wú)法自主合成維生素B，只能額外補(bǔ)充，市面上相關(guān)產(chǎn)品眾多，但是藥品、保健品的攝入會(huì)對(duì)肝臟腎臟帶來(lái)代謝負(fù)荷。米糠、麩皮、粗糧、蔬菜等食物中廣泛存在維生素B，因此，正確合理地從食物中攝取是補(bǔ)充維生素B健康的方式。其中，薏米是不錯(cuò)的選擇[4-5]。

薏米是中國(guó)傳統(tǒng)藥用兼食用的植物，作用溫和，有世界禾本植物之王的美譽(yù)。薏米味甘，寒性，可利水滲濕、健脾止瀉[6]。薏米雖然富含多種維生素，往往由于烹飪方法不當(dāng)，從中攝取的維生素含量并不高[7]。因此，通過(guò)定量檢測(cè)的方法準(zhǔn)確測(cè)定薏米中維生素B的種類(lèi)和含量，有利于指導(dǎo)維生素的合理補(bǔ)充，避免維生素B的流失。

維生素B1又被稱(chēng)為抗神經(jīng)炎素，經(jīng)常處于緊張狀態(tài)的人尤其需要，可改善精神狀況。維生素B2即核黃素，可消除口腔、舌、唇的炎癥，促使皮膚、毛發(fā)、指甲正常生長(zhǎng)。維生素B3即煙酸，可改善腸胃功能障礙，促進(jìn)消化系統(tǒng)的健康，有助于降低血液中膽固醇、甘油三酯水平[8-9]。目前，維生素B1、B2、B3這三種B族維生素的檢測(cè)有相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)。其中，DB37/T 2140—2012和GB/T 36921—2018標(biāo)準(zhǔn)中推薦了預(yù)混合飼料和牙膏中維生素B1、B2、B3的高效液相色譜檢測(cè)方法[10-11]。薛淼等人以4種不同茶葉為材料，實(shí)現(xiàn)5種水溶性維生素含量的測(cè)定，主要采用甲醇和乙酸鈉-乙酸為流動(dòng)相，梯度洗脫[12]。楊潤(rùn)等人建立了保健食品中維生素B1、維生素B2、維生素B6及煙酰胺等4種水溶性維生素的高效液相色譜測(cè)定法，方法以甲醇、冰乙酸溶液（含己烷磺酸鈉）為流動(dòng)相[13]。王浩等人建立了同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中煙酰胺、泛酸、煙酸、維生素B2、維生素B6等5種水溶性維生素的高效液相色譜測(cè)定法，方法以辛烷磺酸鈉、甲醇-乙腈為流動(dòng)相[14]。張媛媛等人以甲醇和庚烷磺酸鈉溶液為流動(dòng)相，建立了復(fù)合維生素B片中煙酰胺、維生素B1、維生素B2及維生素B6的超高效液相色譜含量測(cè)定方法[15]。

綜合文獻(xiàn)可知，不同類(lèi)別樣品可以通過(guò)高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)維生素B的檢測(cè)。因此，建立一套高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定薏米中的維生素B種類(lèi)，很有必要?；诖?，本文以維生素混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的分離效果和洗脫程序運(yùn)行時(shí)間為評(píng)價(jià)依據(jù)，摸索并確定儀器方法，優(yōu)化流動(dòng)相配比、流速、柱溫等色譜條件，進(jìn)行方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米產(chǎn)地吉林??；維生素B1、B2、B3標(biāo)準(zhǔn)品（純度分別大于98.9%、96.8%、99.9%，LGC有限公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；乙酸銨、冰乙酸、鹽酸（分析純）等化學(xué)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（U3000，賽默飛世爾科技有限公司）；電子天平（FA2004N，上海精密科學(xué)儀器公司）；超聲波清洗機(jī)（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫干燥箱（GZX-9070MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；pH計(jì)（PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；粉碎機(jī)（JY7114，上海微型電機(jī)廠）；低速離心機(jī)（SC-3610，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 提取方法

薏米除去雜質(zhì)，105 ℃干燥2 h，粉碎，過(guò)篩（60目），制得薏米粉，備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品0.5 g（精確至0.000 1 g），置于25 mL離心管中，加入10 mL甲醇超聲30 min后過(guò)濾，用適量甲醇清洗濾渣3～4次，棄掉濾液。將濾渣轉(zhuǎn)移至25 mL離心管中，加入0.01 mol/L鹽酸10 mL超聲提取30 min，離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，并用0.01 mol/L鹽酸定容。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣小瓶后上機(jī)分析。

1.4 色譜條件

色譜柱（C18，4.6 mm×250 mm×5 μm），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm，流動(dòng)相為甲醇和0.02 mol/L乙酸銨-乙酸緩沖溶液（pH=3.5）；洗脫程序?yàn)椋?～2 min，70～66 ℃；2～4 min，66～64 ℃；4～6 min，64～66 ℃；6～8 min，66～70℃；8～10 min，70 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5 mg（精確至0.000 1 g）維生素B1、B2、B3標(biāo)準(zhǔn)品置于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇水溶解定容，配制成濃度為100 μg/mL的B1、B2、B3單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取3種單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1、0.2 、0.5、1、2、3 mL到10 mL容量瓶中，甲醇水定容，配制成濃度為1、2、5、10、20、30 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，上機(jī)測(cè)試。維生素B1、B2、B3標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在1～30 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程分別為Y=0.306 8X-0.045 7、Y=0.800 1X+0.092 4、Y=0.237 7X+0.105 8，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6、0.999 8、0.999 0。

2.2 檢出限

取1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，進(jìn)樣分析，3倍信噪比即為方法檢出限，計(jì)算維生素B1、B2、B3的方法檢出限分別為0.066、0.022、0.059 μg/mL。

2.3 穩(wěn)定性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按優(yōu)化后的色譜條件將維生素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液在0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，根據(jù)維生素B1、B2、B3的峰面積計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.23%～3.87%；將維生素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，根據(jù)維生素B1、B2、B3的峰面積計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.26%～2.54%，方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.4 色譜條件優(yōu)化

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，將維生素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液在190～540 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，最大吸收波長(zhǎng)為268 nm。

2.4.2 流動(dòng)相配比的確定

綜合文獻(xiàn)方法篩選出基礎(chǔ)程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，有機(jī)相A為甲醇，水相C為0.02 mol/L乙酸銨-乙酸緩沖溶液（pH=3.5）?；A(chǔ)程序A的洗脫條件為：0～1 min，90 ℃；1～7 min，90～80 ℃；7～13 min，80～40 ℃；13～20 min，40～30 ℃；20～27 min，30～10 ℃；27～33 min，10～90℃；33～35 min，90 ℃。用維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-a所示。由圖1-a可知，程序A在2～15 min內(nèi)洗脫出特征明顯的幾個(gè)組分，同樣儀器條件下進(jìn)3種維生素單標(biāo)可知，3.61、5.88、13.77 min分別為維生素B3、B1、B2這3個(gè)組分，特征明顯，分離良好，只是B1、B3響應(yīng)信號(hào)較弱。在15～35 min有未知組分干擾，且基線有顯著波動(dòng)，故需要進(jìn)一步優(yōu)化洗脫程序。

圖1 洗脫程序a-c時(shí)三種維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

在程序A基礎(chǔ)上，主要針對(duì)維生素B1、B3響應(yīng)信號(hào)弱的問(wèn)題，不改變程序A的大方向，適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相比例和洗脫時(shí)間。程序B的洗脫條件為：0～5 min，80～60 ℃；5～10 min，60～40 ℃；10～15 min，40～20℃；10～20 min，20～40 ℃；20～25 min，40～60 ℃；25～30 min，60～80 ℃；30～35 min，80℃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-b所示。比較目標(biāo)組分出峰時(shí)間，可將乙酸銨的初始比例從90%降到80%；程序A在15～35 min有未知組分，在80%降到40%之間加一個(gè)60%的梯度，同時(shí)調(diào)整了乙酸銨的最低比例，從40%降到30%再降到10%調(diào)整為從40%降到20%，并增加乙酸銨從20%升到80%的梯度。由圖1-b可知，雜峰干擾問(wèn)題得到改善，基線趨向平穩(wěn)，維生素B1、B3響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度有所提高，但兩組分保留時(shí)間接近。

為改善維生素B1、B3保留時(shí)間，再次降低乙酸銨初始比例，從80%降到70%，且放緩乙酸銨洗脫梯度并提高最低比例，調(diào)整后程序C的洗脫條件為：0～2 min，70～66 ℃；2～4 min，66～64 ℃；4～6 min，64～66 ℃；6～8 min，66～70 ℃；8～10 min，70 ℃；實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-c所示。維生素B1、B3響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度大，3個(gè)目標(biāo)組分在10 min內(nèi)有效分離，B3保留時(shí)間為3.22 min、B1保留時(shí)間為4.34 min、B2保留時(shí)間為6.39 min，峰形良好，基線穩(wěn)定，洗脫程序E適合維生素B1、B2、B3的分離。

2.4.3 柱溫的確定

按著程序C的洗脫條件，檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL條件下考察不同流速對(duì)B1、B2、B3分離的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。分析可知，柱溫分別為25、30、35 ℃時(shí)，柱溫的變化對(duì)基線、峰形影響不大，只是柱溫高保留時(shí)間稍有提前。綜合考慮分離效果，最終選擇30 ℃作為分離柱溫。

2.4.4 流速的確定

按著程序C的洗脫條件，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm，進(jìn)樣體積為10 μL條件下考察不同流速對(duì)B1、B2、B3分離的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。分析可知，流速分別為0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min時(shí)，3組分峰形良好且有效分離，差別僅在于保留時(shí)間提前，但同時(shí)柱壓也會(huì)增大。流速為1.4 mL/min較0.8 mL/min比，保留時(shí)間提前約1 min，考慮分析時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，選擇1.0 mL/min作為最佳流速。

圖3 不同流速時(shí)的標(biāo)品色譜圖

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

為考察方法的準(zhǔn)確度及精密度，進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，設(shè)置了低、中、高三個(gè)水平，6平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。薏米中維生素B1提取率平均值為0.41 mg/100 g，RSD為2.62%；加標(biāo)回收率平均值為88.3%～94.2%，RSD為3.97%～5.32%；維生素B3提取率為0.24 mg/100 g，RSD為2.84%；加標(biāo)回收率平均值為91.1%～101.9%，RSD為4.24%～6.75%。分析可知，此方法具有較好的回收率，符合分析要求。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了超聲輔助提取-高效液相色譜法測(cè)定薏米中3種B族維生素的分析方法，實(shí)現(xiàn)了單一液相條件下薏米中維生素B1、B2、B3的同時(shí)測(cè)定。通過(guò)考察檢測(cè)波長(zhǎng)、洗脫程序、柱溫、流速等因素，篩選出最佳色譜分離條件，3種目標(biāo)組分均在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效分離。其中，維生素B3保留時(shí)間為3.22 min、B1保留時(shí)間為4.34 min、B2保留時(shí)間為6.39 min。由此可見(jiàn)，該方法分析時(shí)間短、操作便捷、可同時(shí)測(cè)定多種維生素B含量，為雜糧維生素檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。