牛奶中黃曲霉毒素常見(jiàn)檢測(cè)方式及其危害分析

◎ 袁 莉

（呂梁市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西 呂梁 033000）

為貫徹、響應(yīng)并落實(shí)《食品安全法》《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》等有關(guān)規(guī)定，保障動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量與安全，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)是必要的。在此過(guò)程中，相關(guān)檢測(cè)部門(mén)必須深入基層，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品安全檢測(cè)站進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)食用動(dòng)物的肉、蛋、奶等進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)輸入動(dòng)物的飼料、獸藥、飼料添加劑等進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)農(nóng)場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、奶站、貿(mào)易市場(chǎng)、超市等地方銷(xiāo)售的動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，保障廣大消費(fèi)者的食品安全[1]。

1 理化性質(zhì)

黃曲霉毒素M1 （AFM1）是由黃曲霉毒素B1（AFB1）經(jīng)羥基化而形成的衍生物，其主要結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)氧化萘并酮，具有較高的熱穩(wěn)定性。AFM1為一種在365 nm UV照射下，顯示出藍(lán)紫發(fā)光的無(wú)色晶體，可溶于極性有機(jī)溶劑，但無(wú)法溶于非極性溶劑（如乙醚、石油醚、正己烷等）。除此之外，裂解僅在熔融時(shí)出現(xiàn)，其在中性和弱酸性環(huán)境下會(huì)非常穩(wěn)定；在酸性環(huán)境下， pH值在1～3，會(huì)略微裂解，pH值在9～10，會(huì)很快裂解。AFT與堿性物質(zhì)發(fā)生快速降解，在 pH值為9～10的情況下， AFT很快降解為基本無(wú)毒性鹽類(lèi)。所以，該化學(xué)反應(yīng)可用于食物脫毒[2]。

2 檢測(cè)方法

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

世界范圍內(nèi)，最常用的 AFM分析技術(shù)是 HPLC。其基本原理是在對(duì)樣本進(jìn)行一定比例有機(jī)溶劑提取后，通過(guò)帶有對(duì)應(yīng)填料的純化柱，除去其中雜質(zhì)，經(jīng)純化處理后再進(jìn)行濃縮干燥，進(jìn)而在弱酸情況下進(jìn)行衍生，最終通過(guò)反轉(zhuǎn)C18柱進(jìn)行分離，檢測(cè)器進(jìn)行定量。具體操作程序?yàn)槿〕?0 g試樣，用水將試樣溶解并定容至100 mL，然后進(jìn)行離心處理，將上清液穿過(guò)免疫親和柱，再用1 mL甲醇進(jìn)行洗脫，將洗脫液提取出來(lái)，定容到2 mL，混合后，使用 HPLC對(duì)其進(jìn)行分析。該方法采用色譜柱溫度為30 ℃，色譜柱流率為0.8 mL/min，色譜柱的色譜條件為甲醇、水；熒光探測(cè)器發(fā)射波長(zhǎng)為435 nm ，激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm ，進(jìn)樣量為50 mL。

通過(guò)對(duì)牛奶中黃曲霉毒素M1的測(cè)定，其測(cè)定值在91.2%～106.4%，測(cè)定值最小為0.4 μg/kg。取黃曲霉毒素M1真值為0.085 μg/kg的陽(yáng)性奶粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)30 g，一式3份平行樣，用該方法進(jìn)行檢測(cè)和分析，得到0.081 2、0.083 7、0.084 1 μg/kg,根據(jù)結(jié)果可知，3次檢測(cè)皆在允許范圍內(nèi)，與真值近似。利用 HPLC法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和分析，其具有高效、靈敏、快速、準(zhǔn)確、檢出限低、特異性強(qiáng)和再現(xiàn)性好等特點(diǎn)。然而，由于樣本處理過(guò)程復(fù)雜（預(yù)處理會(huì)導(dǎo)致AFM1丟失）、凈化柱消耗大、檢測(cè)成本高，因此需要操作人員具有較高的職業(yè)素質(zhì)[3]。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

其原理為將待測(cè)樣本中AFM1蛋白與待測(cè)樣本中被測(cè)樣本進(jìn)行特異結(jié)合，通過(guò)與待測(cè)樣本特異作用，在待測(cè)樣本上形成一種新的抗原-抗體復(fù)合物。在清洗過(guò)量抗體組份之后，添加酶標(biāo)物 II抗，并且與該抗體發(fā)生反應(yīng)，在酶作用下，使顯色劑顯色，并且能夠根據(jù)顯色深度來(lái)判斷樣本中含有AFM1的數(shù)量。換言之，取50 mL待檢牛奶樣品，將其冷卻10 ℃之下，以3 500 r/min速度進(jìn)行10 min離心，用吸管吸去表層脂肪層，取下層乳液展開(kāi)檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，本文提出一種特殊方法，即將AFM1抗體包裹在一種特殊膜上，并在4 ℃下存放一晚，以達(dá)到精確AFM1抗體目的。將AFM1標(biāo)準(zhǔn)液和試樣處理液分別加入每個(gè)小孔，然后加入AFM1酶型粘合劑，37 ℃下30 min進(jìn)行反應(yīng)；清洗后，將酶底物和顯色劑加入每個(gè)孔洞中，在37 ℃下15 min內(nèi)進(jìn)行顯色，可通過(guò)目視方法或儀器方法進(jìn)行檢測(cè)。由此繪制在試樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏、快速、成本低等特點(diǎn)，其儀器的使用非常方便，大大降低了工作人員的勞動(dòng)量，而且待檢樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)特別處理即可對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。所以，當(dāng)需要進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)，皆可使用該方法。

2.3 薄層層析法(TLC)

薄層層析法又稱薄層色譜，是一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定樣品的方法。1990年，薄層層析法（TLC）被美國(guó)分析化學(xué)協(xié)會(huì)（AOAC）確立為標(biāo)準(zhǔn)法。用該方法提取、濃縮、薄層分離，用365 nm紫外光照射AFM1，使其發(fā)出藍(lán)紫熒光，并以其在平板上所顯示最小熒光探測(cè)值，與標(biāo)準(zhǔn)液熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定其強(qiáng)度。具體方法如下：先用三氯甲烷提取黃曲霉毒素M1，再向殘留物中加入四氯化碳及氯化鈉-甲醇，再用三氯甲烷提取，最終用 TLC進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示：奶粉中黃曲霉毒素M1測(cè)定的最低限度為0.5 μg/kg，用1∶3硫磺顯色可提高測(cè)定最低限度為0.3 μg/kg。以空白樣品為標(biāo)樣，分別在0.5、2.0、10.0 μg/kg條件下，測(cè)定3個(gè)條件下的樣品，其測(cè)定結(jié)果在85.6%～98.6%之間，其相對(duì)誤差為11%，符合試驗(yàn)條件[4]。

2.4 免疫親和柱法

20世紀(jì)90年代，研究人員開(kāi)發(fā)出一種新型、高選擇性、高純度的方法——“免疫親和柱”。具體操作為：將含鹽牛奶與含水牛奶混合制成還原奶，用離心法將牛奶中油脂與AFM1乳清相分離。提取上清液，濾出，將特異性單克隆抗體與AFM1經(jīng)免疫親和柱結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，用水沖洗法將AFM1從抗原中分離出來(lái)，再用甲醇洗滌。將顯色劑添加到甲醇溶液中，用螢光法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，其檢出最低限值為0.1 μg/kg。

將黃曲霉毒素M1（0 、0.1、0.5、1.0 μg/kg）定容至50 mL，以測(cè)定其含量，結(jié)果如表1所示。

表1 奶粉添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

經(jīng)上述試驗(yàn)，本發(fā)明測(cè)定方法對(duì)奶制品中AFM1的測(cè)定，其測(cè)定值為0.1～1 μg/kg，其測(cè)定值平均回收率為89.6%～96.0%, CV變異系數(shù)為0.52%～5.8%，符合國(guó)標(biāo)測(cè)定要求。經(jīng)測(cè)定，該方法檢出率為0.1 μg/kg，比國(guó)標(biāo)規(guī)定0.5 μg/kg低。

曹葉中等人將該技術(shù)應(yīng)用于牛奶中 AFM測(cè)定，其檢出率為0.05 μg/L，平均回收率為97%。該新檢測(cè)技術(shù)雖簡(jiǎn)化了樣本預(yù)處理流程，不需采用參照物AFM1，減少操作者風(fēng)險(xiǎn)，但整個(gè)檢測(cè)流程較煩瑣、時(shí)間較長(zhǎng)，且易產(chǎn)生大量試劑造成環(huán)境污染，進(jìn)而導(dǎo)致其應(yīng)用范圍有所限制。

3 檢測(cè)結(jié)果分析

上述4種測(cè)定法是目前國(guó)際上對(duì)牛奶和奶制品中AFM1進(jìn)行測(cè)定的主要手段，其具體特征見(jiàn)表2。

表2 檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表

4 牛奶中黃曲霉毒素的危害分析

黃曲霉毒素是一種致命的真菌毒素，存在于霉變牛奶和乳制品中，不僅會(huì)對(duì)人體的內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，還會(huì)增加某些癌癥發(fā)病率。因此，我們必須注意食品安全，避免食用過(guò)期或泛黃的牛奶和乳制品，特別是嬰幼兒、孕婦和老人等人群，更應(yīng)選擇無(wú)毒素和安全的產(chǎn)品。長(zhǎng)期攝入含有黃曲霉毒素的牛奶或乳制品可能會(huì)導(dǎo)致如下健康問(wèn)題。①肝臟損傷：黃曲霉毒素會(huì)被肝臟代謝，嚴(yán)重的霉菌感染會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷及肝細(xì)胞壞死。②免疫抑制：高劑量的黃曲霉毒素會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的抑制，從而增加感染的可能性。③神經(jīng)系統(tǒng)問(wèn)題：黃曲霉毒素可以影響神經(jīng)系統(tǒng)，包括對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，腦部發(fā)育的影響以及神經(jīng)信號(hào)傳遞的干擾。④癌癥：一些研究顯示，長(zhǎng)期攝入含有黃曲霉毒素的食物，可能增加某些癌癥的發(fā)病率，如肝癌和食道癌[5]。

5 結(jié)語(yǔ)

本文介紹了奶制品中存在的黃曲霉毒素的類(lèi)型、危害性、產(chǎn)生原因、檢測(cè)技術(shù)等內(nèi)容，以及對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，如高效液相色譜法（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。其中， HPLC法具有高效、靈敏、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，需要操作人員具有較高的職業(yè)素質(zhì)； ELISA法是一種特殊的檢測(cè)方法，能夠?qū)⒋郎y(cè)樣本中AFM1蛋白與待測(cè)樣本中被測(cè)樣本進(jìn)行特異結(jié)合，通過(guò)與待測(cè)樣本特異作用，使顯色劑顯色，并根據(jù)顯色深度來(lái)判斷樣本中含有AFM1的數(shù)量?？傮w而言，這些檢測(cè)方法都具有特異性強(qiáng)、靈敏、快速等特點(diǎn)，能夠?qū)δ讨破分械狞S曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè)。