牛奶中黃曲霉毒素常見檢測方式及其危害分析

◎ 袁 莉

（呂梁市綜合檢驗檢測中心，山西 呂梁 033000）

為貫徹、響應并落實《食品安全法》《農產品質量安全法》等有關規(guī)定，保障動物產品質量與安全，對動物產品進行檢驗是必要的。在此過程中，相關檢測部門必須深入基層，對動物產品安全檢測站進行檢測，對食用動物的肉、蛋、奶等進行檢測，對輸入動物的飼料、獸藥、飼料添加劑等進行檢測，對農場、屠宰場、奶站、貿易市場、超市等地方銷售的動物產品品質進行檢測，保障廣大消費者的食品安全[1]。

1 理化性質

黃曲霉毒素M1 （AFM1）是由黃曲霉毒素B1（AFB1）經羥基化而形成的衍生物，其主要結構為二呋喃環(huán)氧化萘并酮，具有較高的熱穩(wěn)定性。AFM1為一種在365 nm UV照射下，顯示出藍紫發(fā)光的無色晶體，可溶于極性有機溶劑，但無法溶于非極性溶劑（如乙醚、石油醚、正己烷等）。除此之外，裂解僅在熔融時出現(xiàn)，其在中性和弱酸性環(huán)境下會非常穩(wěn)定；在酸性環(huán)境下， pH值在1～3，會略微裂解，pH值在9～10，會很快裂解。AFT與堿性物質發(fā)生快速降解，在 pH值為9～10的情況下， AFT很快降解為基本無毒性鹽類。所以，該化學反應可用于食物脫毒[2]。

2 檢測方法

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

世界范圍內，最常用的 AFM分析技術是 HPLC。其基本原理是在對樣本進行一定比例有機溶劑提取后，通過帶有對應填料的純化柱，除去其中雜質，經純化處理后再進行濃縮干燥，進而在弱酸情況下進行衍生，最終通過反轉C18柱進行分離，檢測器進行定量。具體操作程序為取出10 g試樣，用水將試樣溶解并定容至100 mL，然后進行離心處理，將上清液穿過免疫親和柱，再用1 mL甲醇進行洗脫，將洗脫液提取出來，定容到2 mL，混合后，使用 HPLC對其進行分析。該方法采用色譜柱溫度為30 ℃，色譜柱流率為0.8 mL/min，色譜柱的色譜條件為甲醇、水；熒光探測器發(fā)射波長為435 nm ，激發(fā)波長為365 nm ，進樣量為50 mL。

通過對牛奶中黃曲霉毒素M1的測定，其測定值在91.2%～106.4%，測定值最小為0.4 μg/kg。取黃曲霉毒素M1真值為0.085 μg/kg的陽性奶粉標準物質30 g，一式3份平行樣，用該方法進行檢測和分析，得到0.081 2、0.083 7、0.084 1 μg/kg,根據結果可知，3次檢測皆在允許范圍內，與真值近似。利用 HPLC法對其進行檢測和分析，其具有高效、靈敏、快速、準確、檢出限低、特異性強和再現(xiàn)性好等特點。然而，由于樣本處理過程復雜（預處理會導致AFM1丟失）、凈化柱消耗大、檢測成本高，因此需要操作人員具有較高的職業(yè)素質[3]。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

其原理為將待測樣本中AFM1蛋白與待測樣本中被測樣本進行特異結合，通過與待測樣本特異作用，在待測樣本上形成一種新的抗原-抗體復合物。在清洗過量抗體組份之后，添加酶標物 II抗，并且與該抗體發(fā)生反應，在酶作用下，使顯色劑顯色，并且能夠根據顯色深度來判斷樣本中含有AFM1的數量。換言之，取50 mL待檢牛奶樣品，將其冷卻10 ℃之下，以3 500 r/min速度進行10 min離心，用吸管吸去表層脂肪層，取下層乳液展開檢測。在此基礎上，本文提出一種特殊方法，即將AFM1抗體包裹在一種特殊膜上，并在4 ℃下存放一晚，以達到精確AFM1抗體目的。將AFM1標準液和試樣處理液分別加入每個小孔，然后加入AFM1酶型粘合劑，37 ℃下30 min進行反應；清洗后，將酶底物和顯色劑加入每個孔洞中，在37 ℃下15 min內進行顯色，可通過目視方法或儀器方法進行檢測。由此繪制在試樣中的標準曲線。該檢測方法具有特異性強、靈敏、快速、成本低等特點，其儀器的使用非常方便，大大降低了工作人員的勞動量，而且待檢樣品無需經過特別處理即可對其進行測定。所以，當需要進行大規(guī)模檢測或現(xiàn)場檢測時，皆可使用該方法。

2.3 薄層層析法(TLC)

薄層層析法又稱薄層色譜，是一種快速、準確測定樣品的方法。1990年，薄層層析法（TLC）被美國分析化學協(xié)會（AOAC）確立為標準法。用該方法提取、濃縮、薄層分離，用365 nm紫外光照射AFM1，使其發(fā)出藍紫熒光，并以其在平板上所顯示最小熒光探測值，與標準液熒光強度進行比較來測定其強度。具體方法如下：先用三氯甲烷提取黃曲霉毒素M1，再向殘留物中加入四氯化碳及氯化鈉-甲醇，再用三氯甲烷提取，最終用 TLC進行定量分析。結果顯示：奶粉中黃曲霉毒素M1測定的最低限度為0.5 μg/kg，用1∶3硫磺顯色可提高測定最低限度為0.3 μg/kg。以空白樣品為標樣，分別在0.5、2.0、10.0 μg/kg條件下，測定3個條件下的樣品，其測定結果在85.6%～98.6%之間，其相對誤差為11%，符合試驗條件[4]。

2.4 免疫親和柱法

20世紀90年代，研究人員開發(fā)出一種新型、高選擇性、高純度的方法——“免疫親和柱”。具體操作為：將含鹽牛奶與含水牛奶混合制成還原奶，用離心法將牛奶中油脂與AFM1乳清相分離。提取上清液，濾出，將特異性單克隆抗體與AFM1經免疫親和柱結合。在此基礎上，用水沖洗法將AFM1從抗原中分離出來，再用甲醇洗滌。將顯色劑添加到甲醇溶液中，用螢光法對其進行測定，其檢出最低限值為0.1 μg/kg。

將黃曲霉毒素M1（0 、0.1、0.5、1.0 μg/kg）定容至50 mL，以測定其含量，結果如表1所示。

表1 奶粉添加回收率實驗結果表

經上述試驗，本發(fā)明測定方法對奶制品中AFM1的測定，其測定值為0.1～1 μg/kg，其測定值平均回收率為89.6%～96.0%, CV變異系數為0.52%～5.8%，符合國標測定要求。經測定，該方法檢出率為0.1 μg/kg，比國標規(guī)定0.5 μg/kg低。

曹葉中等人將該技術應用于牛奶中 AFM測定，其檢出率為0.05 μg/L，平均回收率為97%。該新檢測技術雖簡化了樣本預處理流程，不需采用參照物AFM1，減少操作者風險，但整個檢測流程較煩瑣、時間較長，且易產生大量試劑造成環(huán)境污染，進而導致其應用范圍有所限制。

3 檢測結果分析

上述4種測定法是目前國際上對牛奶和奶制品中AFM1進行測定的主要手段，其具體特征見表2。

表2 檢測結果對照表

4 牛奶中黃曲霉毒素的危害分析

黃曲霉毒素是一種致命的真菌毒素，存在于霉變牛奶和乳制品中，不僅會對人體的內臟器官、免疫系統(tǒng)和神經系統(tǒng)造成損傷，還會增加某些癌癥發(fā)病率。因此，我們必須注意食品安全，避免食用過期或泛黃的牛奶和乳制品，特別是嬰幼兒、孕婦和老人等人群，更應選擇無毒素和安全的產品。長期攝入含有黃曲霉毒素的牛奶或乳制品可能會導致如下健康問題。①肝臟損傷：黃曲霉毒素會被肝臟代謝，嚴重的霉菌感染會導致肝臟損傷及肝細胞壞死。②免疫抑制：高劑量的黃曲霉毒素會導致免疫系統(tǒng)的抑制，從而增加感染的可能性。③神經系統(tǒng)問題：黃曲霉毒素可以影響神經系統(tǒng)，包括對中樞神經系統(tǒng)的損傷，腦部發(fā)育的影響以及神經信號傳遞的干擾。④癌癥：一些研究顯示，長期攝入含有黃曲霉毒素的食物，可能增加某些癌癥的發(fā)病率，如肝癌和食道癌[5]。

5 結語

本文介紹了奶制品中存在的黃曲霉毒素的類型、危害性、產生原因、檢測技術等內容，以及對黃曲霉毒素的檢測方法，如高效液相色譜法（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。其中， HPLC法具有高效、靈敏、快速、準確等特點，需要操作人員具有較高的職業(yè)素質； ELISA法是一種特殊的檢測方法，能夠將待測樣本中AFM1蛋白與待測樣本中被測樣本進行特異結合，通過與待測樣本特異作用，使顯色劑顯色，并根據顯色深度來判斷樣本中含有AFM1的數量。總體而言，這些檢測方法都具有特異性強、靈敏、快速等特點，能夠對奶制品中的黃曲霉毒素進行檢測。