竹黃菌角質(zhì)酶Sb_5623的生物信息學(xué)分析及其原核表達(dá)

◎ 王 珞 ，羅 可 ，任錫毅

（1.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550006）

竹黃菌（Shiraia bambusicola）是一種罕見的藥用真菌，隸屬于子囊菌門，常寄生于竹子的嫩枝，大量發(fā)生會(huì)導(dǎo)致竹子衰敗死亡。竹黃菌可寄生于包括剛竹屬（Phyllostachys）、箭竹屬（Fargesia）在內(nèi)的10多種竹子，但其僅生長(zhǎng)在超過一年生的枝條上，具有明顯的組織特異性[1-2]。竹黃菌自然生長(zhǎng)周期短，對(duì)光照、溫度、濕度等條件要求較高，室內(nèi)培養(yǎng)難以形成子實(shí)體和孢子[3]。對(duì)竹黃菌基因組的組裝、轉(zhuǎn)錄組與代謝組的分析[4]，可以為竹黃菌基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。

角質(zhì)酶是屬于α/β水解酶超家族的絲氨酸酯酶，可以通過水解單體之間的酯鍵來分解角質(zhì)聚酯。角質(zhì)酶來源廣泛，在植物花粉、真菌和少量原核生物中均有表達(dá)[5]。真菌角質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶，病原真菌能夠通過分泌角質(zhì)酶降解植物細(xì)胞的角質(zhì)或栓質(zhì)，從而突破植物表面屏障，削弱宿主抗性[6]。病原真菌的休眠孢子含有“組成型”角質(zhì)酶，以空間定位的方式從宿主植物角質(zhì)層釋放少量角質(zhì)，破壞植物表面角質(zhì)層。在灰霉菌、鐮刀菌、彎孢菌、稻瘟病菌和炭疽菌的休眠孢子中，均在感染早期檢測(cè)到組成型表皮酶活性。這些孢子粘附在寄主植物表面，并從角質(zhì)層釋放對(duì)感染后續(xù)階段至關(guān)重要的角質(zhì)單體，在侵染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究以竹黃菌為材料，構(gòu)建了角質(zhì)酶Sb_5623基因原核表達(dá)載體pET28a_5623，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白并進(jìn)行純化，以期為后續(xù)角質(zhì)酶Sb_5623的功能研究提供蛋白材料與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Sb_5623序列由竹黃菌基因組數(shù)據(jù)中獲得[3]；原核表達(dá)載體pET28a_5623由武漢擎科生物科技有限公司構(gòu)建；感受態(tài)E.Coli BL21購(gòu)于武漢擎科生物科技有限公司。

硫酸卡那霉素（Kan）、異丙基β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、過硫酸銨及甲醇等，均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 Sb_5623生物信息學(xué)分析

利用在線軟件InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)；通過在線程序SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白信號(hào)肽位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

參照已建立的原核表達(dá)與Ni-NTA誘導(dǎo)純化的方法[7]，將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL21，設(shè)置IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.2 mM，設(shè)置不同的溫度梯度，摸索出重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最適條件、探索純化蛋白的最適上清洗脫條件。

1.4 Western Blot鑒定重組蛋白

根據(jù) Western Blot 操作步驟，誘導(dǎo)后蛋白先于15% SDS-PAGE 跑膠，然后100 V 80 min 恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；1×PBST 溶液洗膜4次，每次4 min；PVDF膜封閉30 min； 1×PBST溶液洗膜4次；帶His標(biāo)簽的一抗低溫孵育過夜；1×PBST清洗；二抗常溫孵育1 h；電化學(xué)發(fā)光法顯色，全自動(dòng)熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 角質(zhì)酶Sb_5623蛋白生物信息學(xué)分析

通過InterPro對(duì)Sb_5623蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其第37至第255個(gè)氨基酸的位置含一個(gè)Cutinase角質(zhì)酶結(jié)構(gòu)，屬于α/β水解酶超家族（AB_hydrolase）；而1～27個(gè)氨基酸的位置存在一段信號(hào)肽（如圖1）。

圖1 Sb_5623蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)圖

根據(jù)信號(hào)肽位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果，可見Sb_5623的信號(hào)肽屬于Sec/SPI類型，即由Sec轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)運(yùn)，并且由信號(hào)肽酶I（Lep）切割的標(biāo)準(zhǔn)型分泌信號(hào)肽，概率為0.974 6。此信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)在第19個(gè)和第20個(gè)氨基酸之間，概率為0.467 6（如圖2A）。

圖2 角質(zhì)酶Sb_5623生物信息學(xué)分析圖

Sb_5623蛋白共計(jì)324個(gè)氨基酸，有一個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，大部分序列在膜內(nèi)，其余序列在膜外，跨膜螺旋中氨基酸預(yù)期數(shù)量為22個(gè)，推測(cè)該蛋白屬于分泌蛋白（如圖2B）。

2.2 Sb_5623重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

設(shè)置蛋白誘導(dǎo)得到IPTG濃度為0.2 mM，誘導(dǎo)條件為過夜誘導(dǎo)，設(shè)置18、28、37 ℃3個(gè)溫度梯度，探究蛋白誘導(dǎo)的最適溫度。經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在33～43 kd之間有目的帶大小的條帶，但是誘導(dǎo)前后不明顯，且沉淀中的表達(dá)量多于上清中（如圖3A）。為了確認(rèn)該條帶是否為目的帶以及融合蛋白是否表達(dá)成功，利用帶His標(biāo)簽的抗體，通過western blot實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，不同溫度條件下，沉淀中均有Sb_5623重組蛋白表達(dá)，但僅在18 ℃誘導(dǎo)條件的上清中，出現(xiàn)Sb_5623蛋白表達(dá)（如圖3B）。沉淀中Sb_5623蛋白表達(dá)量多于上清中，但上清中蛋白表達(dá)條帶單一，產(chǎn)物干凈。

圖3 Sb_5623蛋白分子原核表達(dá)圖

2.3 Sb_5623重組蛋白純化分析

將18 ℃誘導(dǎo)后的上清液使用Ni-NTA 親和層析純化分析，經(jīng)過不同濃度的咪唑洗脫后，結(jié)果表明，250 mmol/L咪唑洗脫出來的目的蛋白能夠洗脫下大部分的雜帶，純度較高，可對(duì)其進(jìn)行收集。該蛋白具備生物活性，后續(xù)可用于抗體及材料制備，深入研究Sb_5623的基因功能（如圖4）。

圖4 Sb_5623蛋白分子純化分析圖

3 結(jié)語

本研究對(duì)竹黃菌Sb_5623基因的編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其編碼一個(gè)隸屬于α/β水解酶超家族的角質(zhì)酶，在病原真菌侵染寄主植物時(shí)起著關(guān)鍵的作用。通過信號(hào)肽預(yù)測(cè)與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Sb_5623存在信號(hào)肽區(qū)段與跨膜結(jié)構(gòu)域，該蛋白推測(cè)屬于分泌蛋白。隨后，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a_5623，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)在18 ℃誘導(dǎo)過夜的條件下，上清中出現(xiàn)了條帶單一的重組蛋白，隨后對(duì)上清液進(jìn)行純化分析，在250 mM咪唑的洗脫條件下，得到了純度較高且具備生物活性的目的蛋白。因此，本文可以為竹黃菌角質(zhì)酶Sb_5623的蛋白結(jié)構(gòu)解析與基因功能研究提供參考。