淺析蛋白質(zhì)沉淀劑對(duì)乳制品中環(huán)己基氨基磺酸鈉含量的測(cè)定影響

◎ 高元元

（云南省食品藥品審核查驗(yàn)中心（云南省疫苗檢查中心）， 云南 昆明 650031）

環(huán)己基氨基磺酸鈉為非營養(yǎng)型甜味劑，又名甜蜜素，過量攝入會(huì)損害人體肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)[1]。甜蜜素的致癌作用一直為人們所爭(zhēng)議[2]。根據(jù)GB2760—2014《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，甜蜜素可在冷凍飲品、果醬、蜜餞涼果、復(fù)合調(diào)味料、面包、糕點(diǎn)以及配制酒等19類食品中限量范圍使用[3-5]。由于甜蜜素禁止在美、日、英以及加拿大等40多個(gè)國家使用，而我國又是全球最大的甜蜜素出口國，因此，甜蜜素超標(biāo)問題將影響我國食品出口質(zhì)量[6]。高效檢測(cè)食品中的甜蜜素含量，確保食品中甜蜜素含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)的意義重大。對(duì)于蛋白質(zhì)含量較高的乳制品，為了解決樣品前處理中過濾速度慢等問題，試驗(yàn)過程中使用蛋白質(zhì)沉淀劑（即亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液1∶1）,生成的亞鐵氰化鋅沉淀吸附干擾物質(zhì)，可以有效去除蛋白質(zhì)。同時(shí)，環(huán)己基氨基磺酸鈉與亞硝酸鈉在硫酸介質(zhì)中反應(yīng)生成環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，環(huán)己醇亞硝酸酯會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化成環(huán)己醇[7]。亞鐵氰化鉀及乙酸鋅蛋白沉淀劑的加入可能會(huì)對(duì)上述衍生化反應(yīng)產(chǎn)生影響，也有可能對(duì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性造成影響。因此，本試驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)沉淀劑的加入，對(duì)樣品中甜蜜素含量測(cè)定造成的影響以及兩者間回收率的差異。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫Agilent GC-7890B（FID）、環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品：Dr.Ehrenstorfer GmbH（99.1%）、正庚烷、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、亞硝酸鈉、硫酸。

1.2 樣品

乳粉、風(fēng)味酸奶、酸奶（市售）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 環(huán)己基氨基磺酸鈉衍生物定性及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制0.050 13、0.100 26、0.200 52、0.300 78、0.401 04 、0.501 3 mg/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL于50 mL帶蓋離心管中，冰浴5 min。準(zhǔn)確加入5.00 mL正庚烷，2.5 mL亞硝酸鈉溶液，2.5 mL硫酸溶液，蓋緊離心管后搖勻，盡快置于冰浴30 min。加入2.5 g氯化鈉，混合1 min，4 ℃離心（3 000 r/min）10 min，吸取1 μL上清液上機(jī)測(cè)定。對(duì)比研究確定衍生物目標(biāo)峰，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 不同類別樣品添加回收試驗(yàn)

分別稱取2份乳粉、酸奶、風(fēng)味酸奶樣品置于50 mL帶蓋離心管中。其中，樣品乳粉、酸奶樣品添加0.50 mg標(biāo)準(zhǔn)溶液，風(fēng)味酸奶樣品中添加0.30 mg標(biāo)準(zhǔn)溶液；一份樣品中再添加3 mL蛋白質(zhì)沉淀劑，另一份樣品作為對(duì)照組不添加蛋白質(zhì)沉淀劑。加20 mL水，搖勻，超聲提取20 min，4 ℃離心（3 000 r/min）10 min，過濾，收集濾液并定容至50 mL。準(zhǔn)確移取試樣溶液10 mL ，按1.3.1操作，計(jì)算回收率。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：TG-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升溫：初溫55 ℃保持3 min，10 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，20 ℃/min升溫至200 ℃保持3 min。進(jìn)樣口、檢測(cè)器溫度：230 、260 ℃。進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為2∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)己基氨基磺酸鈉衍生物定性及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以甜蜜素濃度為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。甜蜜素衍生產(chǎn)物有2個(gè)色譜峰，甜蜜素(環(huán)己基氨基磺酸鈉)和亞硝酸鈉在硫酸酸性條件下反應(yīng)生成環(huán)己醇，環(huán)己醇在酸性條件下又繼續(xù)與亞硝酸鈉發(fā)生酯化反應(yīng)生成環(huán)己醇亞硝酸酯。因?yàn)槌甚シ磻?yīng)在一定反應(yīng)條件下是動(dòng)態(tài)平衡，所以正己烷提取物中會(huì)同時(shí)有環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇存在，并且在放置過程中，環(huán)己醇亞硝酸酯與環(huán)己醇的平衡會(huì)移動(dòng)。因此，主產(chǎn)物峰會(huì)隨著時(shí)間和反應(yīng)條件變化逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦碑a(chǎn)物峰，但是主副產(chǎn)物的峰面積之和基本保持不變，主產(chǎn)物和副產(chǎn)物的峰也有一定的線性關(guān)系，用組校準(zhǔn)的方法做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線1使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確（如圖1所示）。

圖1 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 氣相色譜圖比較

圖2為樣品色譜圖，顯示甜蜜素含量為0；圖3是空白對(duì)照色譜圖；圖4為標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，甜蜜素保留時(shí)間為4.393 min；圖5為加入標(biāo)準(zhǔn)品和3 mL蛋白質(zhì)沉淀劑的氣相色譜圖，甜蜜素的保留時(shí)間為4.394 min。結(jié)果顯示，加入蛋白質(zhì)添加劑的保留時(shí)間仍停留在4.3 min以內(nèi)，表明對(duì)甜蜜素的測(cè)量不會(huì)造成影響。

圖2 樣品氣相色譜圖

圖3 空白氣相色譜圖

圖4 加入標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖

圖5 加入標(biāo)準(zhǔn)品和3 mL蛋白質(zhì)沉淀劑氣相色譜圖

2.3 蛋白質(zhì)沉淀劑對(duì)測(cè)定乳制品中甜蜜素回收率的影響

市售乳粉、風(fēng)味酸奶、酸奶加入不同量的甜蜜素與蛋白沉淀劑，回收率結(jié)果見表1；精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 甜蜜素回收率試驗(yàn)結(jié)果表

表2 精密度試驗(yàn)（n=6）結(jié)果表

如表1、表2所示，未加入蛋白質(zhì)沉淀劑時(shí)，乳粉、風(fēng)味酸奶、酸奶樣品回收率分別為96%、94%、96%，加入蛋白質(zhì)沉淀劑后，對(duì)應(yīng)回收率分別為99%、100%、100%，由此可見，蛋白質(zhì)沉淀劑的加入，提高了樣品回收率。此外，在樣品處理過程中添加蛋白質(zhì)沉淀劑亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，可使試樣澄清，有效消除溶液渾濁現(xiàn)象，提高處理效率；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）均＜10%，證明該方法準(zhǔn)確度高，精密度和重復(fù)性良好，滿足試驗(yàn)要求。

3 結(jié)語

本研究表明，加入蛋白質(zhì)沉淀劑可以有效提高樣品回收率，回收率可達(dá)100%，使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。同時(shí)，亞鐵氰化鉀和乙酸鋅合成的沉淀劑除蛋白能力較強(qiáng)，可有效減少測(cè)試樣品對(duì)色譜柱的損壞。