血管內皮生長因子-A165對形覺剝奪性近視豚鼠視網膜中多巴胺水平的影響

孫瑞婷 高洪蓮 張鳳一 彭慶生 王 磊 張 磊

近視是視力損害的主要原因,由于其在全球范圍內的患病率越來越高,已成為一個重大的公共衛(wèi)生問題[1]。據(jù)估計,2050年全球會有接近47.58億近視患者,其中高度近視患者將有9.38億人[2]。目前青少年近視發(fā)病低齡化,發(fā)生率也逐漸增高,近視相關的眼部并發(fā)癥也隨之增多。隨著近視度數(shù)的增高,眼軸進行性延長,視網膜脈絡膜發(fā)生退行性改變,會導致視網膜脫離、黃斑出血甚至失明等嚴重的并發(fā)癥[3-4]。近視的病因復雜,至今還不能完全解釋近視的發(fā)病機制,采取有效的防控措施,對于避免進展為高度近視至關重要。多巴胺(DA)是一種重要的神經遞質,在調控視網膜信號傳遞、光刺激的反應以及對比敏感度視力等過程起著重要的作用[5],被認為是近視的終止信號[6-7]。血管內皮生長因子(VEGF)作為血管生成因子大家族的一員,是與新生血管密切相關的多肽類生長因子,其中VEGF-A165是主要的同種型[8],不但具有促進新生血管形成、血管重建的作用,還具有直接和間接的神經營養(yǎng)和神經保護作用[9]。有研究證明,VEGF-A165在體內外均能促進多巴胺能神經元的存活和功能恢復[10-13]。本課題組前期實驗已經證明,形覺剝奪性近視(FDM)豚鼠玻璃體內注射抗VEGF藥物可以進一步抑制視網膜中DA的含量,加重近視程度[14],初步證實了VEGF對視網膜DA含量的影響?；诖?本研究擬對FDM豚鼠玻璃體內注射不同劑量的VEGF-A165,研究其對視網膜DA水平的影響及對新生血管的影響,為控制近視的發(fā)生發(fā)展尋找新的思路和可能的藥物治療方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

選取健康3周齡三色豚鼠90只(濟南金豐實驗動物有限公司提供),體重150～200 g,雌雄不限。自然照明環(huán)境下12 h/12 h晝夜循環(huán),自由攝水攝食,維持溫度為22～25 ℃,濕度為50%～70%。按照隨機數(shù)表法將豚鼠分為空白組、FDM組、PBS組、10 ng組、5 ng組、1 ng組,共6組,每組15只。空白組豚鼠雙眼不做任何處理,FDM組豚鼠右眼建立FDM模型,PBS組、10 ng組、5 ng組、1 ng組豚鼠右眼玻璃體內分別注射PBS緩沖液及10 ng、5 ng、1 ng VEGF-A165重組人蛋白緩沖液,之后右眼建立FDM模型。本研究經濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審批(審批號:20220128-78),實驗動物的喂養(yǎng)和使用嚴格遵循濱州醫(yī)學院動物管理委員會相關規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器

重組人蛋白VEGF-A165(美國 R&D Systems公司);Bouin固定液(福建飛凈Phygene公司);酪氨酸羥化酶(TH)兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology 公司);山羊抗兔IgG(英國 Abcam公司);帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺科技有限公司);A型超聲儀(法國Quantel公司);OCT冰凍切片包埋耦合劑(美國Sakura公司);冰凍切片機(德國Leica公司);正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司);蘇木精-伊紅染色試劑盒、抗熒光衰減封片劑(含DAPI)(北京Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 FDM豚鼠模型的建立

采用半透明無毒乳膠氣球套頭處理,只遮蓋右眼,充分暴露左眼、口鼻和兩側耳部,每日清洗頭套1次,保持頭套清潔。分籠飼養(yǎng),連續(xù)遮蓋14 d建立FDM豚鼠近視模型。

1.2.2 玻璃體內注射

于造模前對PBS組、10 ng組、5 ng組、1 ng組豚鼠右眼分別行玻璃體內注射PBS溶液及10 ng、5 ng、1 ng VEGF-A165。注射前1 d使用妥布霉素滴眼液滴眼(每天3次),注射前用復方托吡卡胺滴眼液散瞳,50 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉,眼周用碘伏消毒完畢后鋪無菌洞巾,聚維酮碘滴眼液消毒結膜囊及眼表,1 min后用氯化鈉注射液沖洗干凈。在顯微鏡下用顯微有齒鑷固定眼球,微量注射器在顳側角膜緣后1 mm處垂直鞏膜進針,針頭向眼球壁傾斜20°避開晶狀體推進約3 mm后注射,注射完畢后用齒鑷輕輕夾住針孔30 s,氧氟沙星眼膏涂眼,無菌紗布遮蓋包扎10 min后進行FDM豚鼠造模,術后第2天、第3天右眼涂氧氟沙星眼膏(每天3次)。

1.2.3 眼部生物學參數(shù)測量

于造模前1 d和造模后14 d測量各組豚鼠眼球的屈光度和眼軸長度。屈光度測量前用復方托吡卡胺(美多麗)滴眼液滴右眼,待瞳孔充分散大后使用帶狀光檢影鏡測量屈光度,由驗光經驗豐富的檢查者檢影,以等效球鏡度(球鏡度+1/2柱鏡度)進行數(shù)據(jù)分析,連續(xù)測量5次計算平均值作為該眼的屈光值。屈光度測量后20 min測量眼軸長度,鹽酸丙美卡因滴眼液滴右眼行表面麻醉后,應用眼部A型超聲儀測量眼軸長度,測量時探頭對準角膜中心并垂直于角膜平面,測定右眼眼軸長度,手動模式連續(xù)測量5次計算平均值,精確到0.01 mm。

1.2.4 免疫熒光法檢測豚鼠視網膜中TH的陽性細胞數(shù)

每組各隨機取3只豚鼠,在造模后14 d頸椎脫臼法處死;取出右側眼球置于冰上,在顯微鏡下剔除多余結締組織與眼外肌,保留視神經并保持眼球完整性,置于Bouin固定液中固定,顯微鏡下去除角膜、虹膜、晶狀體、玻璃體后將眼球從中間分開制成眼杯,使視網膜保持完整,沖洗干凈后將組織依次放入100 g·L-1、200 g·L-1和 300 g·L-1的蔗糖溶液中梯度脫水, 4 ℃存放。充分脫水后取出眼杯置于濾紙上,去除多余溶液,OCT包埋眼杯后冰凍切片機切片,切片厚度為8 μm。將冰凍切片吸附于黏性載玻片上,4 ℃丙酮處理,PBS 溶液洗滌3次, 3 g·L-1Trition-100漂洗3次;滴加50 g·L-1BSA封閉液,37 ℃ 孵育30 min;滴加TH兔單克隆抗體(1：100),4 ℃過夜;次日置于37 ℃孵育箱復溫1 h;PBS 溶液洗滌3次;避光狀態(tài)下,滴加山羊抗兔IgG(1：500),37 ℃孵育1 h;滴加含DAPI的抗熒光衰減劑封片,在正置熒光顯微鏡400 倍視野下觀察TH分布,每組分別選取6個不同視野計算TH陽性細胞數(shù),以平均值進行對比分析。

1.2.5 高效液相色譜法測定視網膜中DA及DOPAC的含量

每組各隨機取6只豚鼠,在造模14 d后頸椎脫臼法處死,摘取右側眼球置于冰上,取出視網膜并稱重,每毫克組織樣加入新鮮配制的勻漿液20 μL(H3ClO40.1 mol·L-1, EDTA-Na20.1 mmol·L-1,內標物DHBA),-40 ℃冷凍勻漿(2 mm氧化鋯珠,60 Hz,30 s,4次);低溫離心(20 000 r·min-1,30 min,4 ℃)后取上清保存于-80 ℃冰箱。測樣前取出再次離心(20 000 r·min-1,30 min,4 ℃)后取上清液上機檢測。色譜柱:Thermo Acclaim Rapid Separation Liquid Chromatography (RSLC) 2.1×100 mm C18 2.2 μm,柱溫40 ℃;流動相:含90 mmol·L-1NaH2PO4,50 mmol·L-1檸檬酸,1.7 mmol·L-1OSA,50 μmol·L-1EDTA和體積分數(shù)4.5%乙腈;Chromeleon 6.9色譜工作站采集與分析數(shù)據(jù),以內標法計算DA和DOPAC濃度,并計算DA代謝率。

1.2.6 HE染色觀察視網膜中血管內皮細胞核數(shù)

每組隨機選取6只豚鼠頸椎脫臼處死,摘取右側眼球,固定后經常規(guī)脫水、OCT包埋后,制成8 μm切片,每組小鼠隨機選取20張切片行HE染色,隨機選取6張切片于400倍光學顯微鏡下觀察小鼠視網膜情況,并對血管內皮細胞核數(shù)進行計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析。本研究的計量資料數(shù)據(jù)經Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布,以均數(shù)±標準差表示,組間數(shù)據(jù)經Levene檢驗方差齊性。各組數(shù)據(jù)總體比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準:α=0.05。

2 結果

2.1 豚鼠眼球生物學參數(shù)分析

造模前6組豚鼠雙眼均呈現(xiàn)遠視狀態(tài),各組豚鼠間眼球屈光度和眼軸長度差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。造模后14 d,與空白組相比,FDM組豚鼠的等效球鏡度數(shù)和眼軸長度均增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.001);與FDM組相比,PBS組豚鼠等效球鏡度數(shù)和眼軸長度差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.622、0.948);與FDM組相比,10 ng組、5 ng組、1 ng 組豚鼠近視程度減輕,眼軸長度變短,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.001)。與FDM組相比,1 ng組豚鼠的近視程度減輕最明顯,眼軸長度明顯變短,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.001)(表1)。

表1 各組豚鼠造模前1 d和造模后14 d屈光度和眼軸長度

2.2 免疫熒光法檢測豚鼠視網膜中TH陽性細胞數(shù)

免疫熒光法檢測結果顯示,各組豚鼠視網膜結構完整,各層排列整齊,視網膜中TH陽性細胞表達呈綠色點狀熒光(圖1箭頭所指區(qū)域),主要位于內側神經細胞層(無長突細胞層)?？瞻捉M、FDM組、PBS組、10 ng組、5 ng組、1 ng組豚鼠視網膜中TH陽性細胞數(shù)分別為(34.833±2.137)個、(8.000±2.608)個、(8.833±2.563)個、(17.167±2.137)個、(21.667±3.266)個、(32.667±2.422)個,各組間總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=121.429,P<0.001)。兩兩比較結果顯示,FDM組豚鼠視網膜中TH陽性細胞數(shù)明顯低于空白組(P<0.001);FDM組豚鼠視網膜中TH陽性細胞數(shù)與PBS組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.576);與FDM組相比,10 ng組、5 ng組、1 ng組豚鼠視網膜中TH陽性細胞數(shù)均增多(均為P<0.05),其中5 ng組豚鼠視網膜中TH陽性細胞數(shù)比10 ng組多,1 ng組TH陽性細胞數(shù)比5 ng組多,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(圖1)。

ONL:視網膜外核層;INL:視網膜內核層。箭頭示TH陽性細胞。圖1 各組豚鼠視網膜中TH的表達(×400)

2.3 高效液相色譜法檢測結果

造模后14 d,與空白組相比,FDM組豚鼠視網膜DA和DOPAC含量均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與FDM組相比,PBS組豚鼠視網膜DA、DOPAC含量未發(fā)生明顯變化,差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.811、0.682);與FDM組相比,10 ng組、5 ng組、1 ng組豚鼠視網膜DA和DOPAC含量均增加(均為P<0.05),其中1 ng組豚鼠視網膜中的DA和DOPAC含量均較5 ng組明顯增加,5 ng組豚鼠視網膜中的DA和DOPAC含量均較10 ng組明顯增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。6組豚鼠間視網膜DA 代謝率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.574)(表2)。

表2 各組豚鼠視網膜中DA、DOPAC的含量及DA代謝率

2.4 HE染色觀察結果

豚鼠視網膜切片HE染色結果顯示,空白組、FDM組、PBS組豚鼠視網膜各層排列整齊,未見或偶見血管內皮細胞分布在內界膜內;10 ng組、5 ng組、1 ng組豚鼠視網膜內界膜內血管內皮細胞核均有不同程度的增多,隨著VEGF-A165劑量的增加,血管內皮細胞核數(shù)也隨之增加(圖2)?？瞻捉M、FDM組、PBS組、10 ng組、5 ng組、1 ng組豚鼠視網膜中血管內皮細胞核數(shù)分別為(1.500±1.049)個、(2.500±1.517)個、(2.333±1.211)個、(12.167±1.722)個、(9.000±1.414)個、(4.500±1.049)個。兩兩比較結果顯示,與空白組相比,FDM組、PBS組豚鼠視網膜中血管內皮細胞核數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.209、0.293);10 ng組、5 ng組和1 ng組豚鼠視網膜中血管內皮細胞核數(shù)與空白組相比均明顯增多,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.001);10 ng組豚鼠視網膜中血管內皮細胞核數(shù)較 5 ng組明顯增多(P<0.001);5 ng組豚鼠視網膜中血管內皮細胞核數(shù)較 1 ng 組明顯增多(P<0.001)。

A:空白組;B:FDM組;C:PBS組;D:10 ng組;E:5 ng組;F:1 ng組。箭頭示視網膜內血管內皮細胞核。圖2 各組豚鼠視網膜切片HE染色

3 討論

近年來,近視發(fā)病率逐年增高,已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。近視的發(fā)病機制目前仍不明確[1,15],因此近視的具體發(fā)病機制一直是眼科研究的熱點。近視動物模型的成功建立以及對實驗性近視眼分子生物學等方面的研究發(fā)現(xiàn),近視眼的特點是眼球的前后徑變長,局部視網膜調控、鞏膜重塑等過程在近視的發(fā)病中起到了重要的作用[16-17]。對包括人類在內的許多生物而言,視覺信號刺激的剝奪可使眼軸前后徑異常生長而致FDM。形覺剝奪通過某些神經遞質、信號分子使局部視網膜成像改變,調控眼球生長的微環(huán)境,其中DA的參與最為密切[18]。DA作為一種重要的神經遞質,與眼球的生長發(fā)育和近視的形成密切相關。

DA屬兒茶酚胺類神經遞質[19],主要由視網膜內核層的多巴胺能無長突細胞分泌[20]。DA的合成起源于酪氨酸。酪氨酸在被多巴胺能神經元攝取后,在TH的作用下先轉變?yōu)樽笮喟?再經多巴脫羧酶催化形成DA。合成的DA在單胺氧化酶的作用下分解為DOPAC和高香草酸。TH是DA合成過程中的限速酶,DOPAC是反映DA釋放量的重要標志物。視網膜中的DA釋放后,通過與DA受體結合參與細胞的營養(yǎng)凋亡、眼球的生長發(fā)育及視覺信號轉導活動[21]。本實驗結果顯示, FDM組豚鼠視網膜中DA和DOPAC的含量均明顯較空白組降低,通過測量等效球鏡度和眼軸長度確定豚鼠近視模型建造成功,說明DA可能參與了近視的發(fā)生發(fā)展。

目前的近視治療方法如配戴多焦點眼鏡、角膜塑形鏡和屈光手術等,可部分控制但不能完全抑制近視進展,藥物治療近視主要是通過視網膜及鞏膜的信號分子起作用,或者有望解決近視進展的難題?，F(xiàn)在臨床應用的控制近視藥物,如低濃度阿托品、派侖西平等,都可能產生副作用,如畏光、視物模糊、無癥狀的乳頭狀結膜炎等[22-23]。有研究證明,在6-羥基DA神經毒素介導的帕金森病臨床前模型中,VEGF過表達或在紋狀體中植入包被的VEGF分泌細胞可降低苯丙胺誘導的旋轉行為,并預先服務于黑質中的TH神經元[10-12]。這種神經保護作用歸因于VEGF對神經細胞和血管的雙重作用。由此我們推斷,VEGF可能會對視網膜中多巴胺能無長突細胞有神經營養(yǎng)和神經保護等作用,本課題組前期實驗證明,玻璃體內注射抗VEGF藥物(康柏西普)會使近視加重,視網膜中DA水平降低更明顯[14],間接證明了VEGF對視網膜DA含量的影響。本實驗在FDM豚鼠玻璃體內注射VEGF-A165觀察視網膜中DA的變化,探討VEGF對視網膜中DA水平的影響,以及對近視的作用。

本研究選擇玻璃體內注射不同劑量VEGF-A165驗證視網膜中DA和DOPAC含量的變化及對FDM的影響,實驗分為三個不同劑量進行注射,分別為10 ng、5 ng、1 ng。實驗結果顯示,與空白組相比,FDM組豚鼠的等效球鏡度變?yōu)樨撝?為明顯的近視狀態(tài),眼軸長度明顯延長,視網膜中DA和DOPAC的含量均明顯降低,TH陽性細胞數(shù)減少,DA代謝率不變;與FDM組相比,10 ng組、5 ng組、1 ng組豚鼠遮蓋眼近視程度均降低,眼軸延長幅度減小,視網膜中DA和DOPAC的含量均有升高,TH陽性細胞數(shù)增加,但DA代謝率均不變。由于各組豚鼠視網膜中DA代謝率均未發(fā)生變化,可分析出其DA的升高是因為 DA 的合成增加而非代謝的減少引起。其中,5 ng組豚鼠視網膜DA和DOPAC含量、TH陽性細胞數(shù)均比10 ng組豚鼠多,1 ng組豚鼠視網膜DA和DOPAC含量、TH陽性細胞數(shù)均比5 ng組豚鼠多,這說明VEGF-A165在低劑量下對近視的抑制效果最好,這與Meng等[24]的研究結果一致,VEGF-A165對DA神經元的作用與劑量有關,在低劑量下獲益最大,更高的劑量則會引起過度的血管生成甚至水腫。在各組豚鼠視網膜切片HE染色實驗中可以看到,10 ng 組、5 ng組、1 ng組豚鼠視網膜內界膜內血管內皮細胞核均有不同程度的增多,10 ng組豚鼠視網膜中血管內皮細胞核數(shù)較1 ng組明顯增多,由此可見,VEGF-A165在低劑量下對視網膜中多巴胺能神經元起到明顯促進作用,而高劑量 VEGF-A165對多巴胺能神經元的促進作用反而不明顯。我們結合相關文獻推測,過量的VEGF-A165可能通過引發(fā)胞外Ca2+內流,激活前列腺環(huán)素和血小板活化因子等增加血管滲透性[12],從而影響了其對多巴胺能神經元的神經營養(yǎng)作用。也有實驗研究表明,在早產兒視網膜病變小鼠模型中,VEGF過量表達使視網膜出現(xiàn)大量新生血管,新生血管長入玻璃體導致視網膜脫離,從而對視網膜神經結構造成損害,使得視網膜中DA含量反而降低[25]。由此可見,如果我們加大VEGF-A165玻璃體內注射劑量則會損害視網膜神經系統(tǒng),反而使得DA水平下降。因此,眼內注射VEGF劑量的選擇至關重要。

4 結論

本研究進一步證明了FDM豚鼠玻璃體內注射VEGF-A165可以使視網膜中DA含量增加,抑制FDM的發(fā)展,對近視的形成有抑制作用,其機制可能是VEGF-A165通過與視網膜中的VEGF受體結合發(fā)揮其對多巴胺能神經元的神經營養(yǎng)和神經保護作用,導致TH表達增多,DA分泌增加,從而使近視得到控制,但具體通過結合哪些VEGF受體和通過哪些通路發(fā)揮作用尚不明確,具體發(fā)生機制還需要進一步研究,本研究為今后近視的防治提供更多實驗依據(jù)。