水體消毒過程中活的不可培養(yǎng)細菌的形成與復蘇機制研究進展

李桂英，劉建瑩，安太成

廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院/環(huán)境健康與污染控制研究院/環(huán)境催化與健康風險控制重點實驗室/粵港澳污染物暴露與健康聯(lián)合實驗室，廣東 廣州 510006

有效的水消毒技術(shù)對供水質(zhì)量和人類健康保護至關(guān)重要（Cai et al.，2021）。其中，光催化技術(shù)具有高效、低毒、無選擇性等優(yōu)點（陽海等，2010）。然而，亞致死水平消毒技術(shù)卻不能完全去除水中的細菌，因為病原菌能夠通過進入休眠狀態(tài)來逃避消毒技術(shù)造成的損害（Cai et al.，2022）。在細菌的休眠狀態(tài)中，活的不可培養(yǎng)（Viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)細菌是一個典型的休眠亞群（Oliver，2005）。VBNC細菌存在可能會對飲用水安全、食品安全和生物安全控制均構(gòu)成一定程度的威脅。值得注意的是，細菌休眠是細菌獲得抗生素耐藥性的重要途徑（Wang et al.，2023a）?？股啬退幮约毦ˋRB）也能進入VBNC狀態(tài)以避免被消毒技術(shù)殺死（Guo et al.，2019a）。ARB能夠逃脫抗生素治療并造成嚴重疾病，因此VBNC ARB會增加抗生素耐藥性風險（Zhong et al.，2022）。

然而，目前卻很少有關(guān)于消毒技術(shù)誘導形成的VBNC細菌發(fā)生復蘇的相關(guān)研究。到目前為止，仍不清楚消毒技術(shù)誘導形成VBNC細菌復蘇的潛在分子機制。因此，本綜述結(jié)合課題組在抗生素耐藥菌方面的消毒控制機制和細菌休眠方面的研究及其文獻報道的綜述，詳細地介紹了消毒技術(shù)如何誘導VBNC細菌的形成。同時，本綜述也梳理了VBNC細菌的復蘇方法，并闡述了自然復蘇、復蘇促進因子（Rpf）復蘇與自誘導劑復蘇的潛在的復蘇機制，期望為水處理過程中病原微生物的安全性評估和滅活技術(shù)制定更有效的消毒策略提供理論依據(jù)。

1 VBNC細菌的形成

在水消毒過程中，細菌的各種應激反應會被激活以保護細菌免受損害和死亡。ARB更能抵抗刺激產(chǎn)生的損傷，因為抗生素耐藥作用靶點能夠影響應激反應，從而加速細菌細胞的修復（Liu et al.，2022）。也就是說，細菌能夠接受亞致死水平的氧化壓力（Ji et al.，2022）。亞致死光催化消毒會導致抗生素耐藥性的長期維持和通過基因水平轉(zhuǎn)移方式促進抗生素耐藥性的傳播（Yin et al.，2019）。亞致死消毒無法完全消除ARB，甚至會誘導VBNC狀態(tài)的形成（Cai et al.，2022）。VBNC細菌普遍存在于在水體中，尤其是生物膜中（Chen et al.，2022）。然而，用于去除水傳播致病菌的傳統(tǒng)水消毒技術(shù)可以誘導細菌進入VBNC狀態(tài)，包括紫外線消毒（Zhang et al.，2015）、氯和氯胺消毒（Chen et al.，2018）、臭氧消毒（J?ger et al.，2018）等。另外，消毒技術(shù)對抗生素耐藥基因（ARGs）的去除效果有限（陳蕾等，2018）。光電催化會誘導ARB細菌從可培養(yǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閂BNC狀態(tài)，這會導致ARGs在水體中殘留在和增加繼續(xù)擴散的潛在風險（Qi et al.，2022）。具有強耐受性的VBNC細菌可能無法被傳統(tǒng)的水消毒技術(shù)完全消除（Cai et al.，2022）。完成消毒的飲用水中也檢測到了處于VBNC狀態(tài)的病原體（Guo et al.，2021）。因此水處理系統(tǒng)中的VBNC細菌可能會構(gòu)成巨大的健康風險，因為它們無法被傳統(tǒng)的異養(yǎng)平板計數(shù)方法檢測到，這導致了總的活細菌數(shù)量被明顯低估（Dong et al.，2020）。進入VBNC狀態(tài)后，病原體對多種抗生素具有更強的耐受性（Lin et al.，2017）。進入休眠后，VBNC細菌可通過不同的耐藥機制增加對抗生素的耐藥性，比如增加外排泵的表達（Yin et al.，2020）和降低代謝活性（Qi et al.，2022）。此外，VBNC細菌可能會引起生素耐藥性的傳播和造成慢性感染。亞致死消毒誘導了VBNC狀態(tài)的形成，還可能會導致抗生素耐藥性的進一步傳播和發(fā)展（Ahmed et al.，2021）。這是因為亞致死刺激會引起細菌的氧化應激和促進外排泵基因的表達上調(diào)（Yin et al.，2020）。在暴露于亞致死刺激下，細菌會進入休眠狀態(tài)，其外排泵的活性也會增強，這有助于細菌存活并將進入胞內(nèi)的抗生素泵出細胞外以降低細菌體內(nèi)藥物濃度，從而導致細菌的抗生素耐藥性的增加（Liu et al.，2023）。另外，從休眠狀態(tài)復蘇的ARB可以通過結(jié)合轉(zhuǎn)移等方式恢復ARGs的產(chǎn)生及其傳播（Wang et al.，2023a）。

消毒可以誘導細胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成（Li et al.，2020）。環(huán)境壓力會引起細菌的氧化損傷，包括蛋白質(zhì)損傷、DNA損傷、RNA損傷，從而阻止細菌的正常生長（Chen et al.，2019）。細菌可以通過表型的變化來響應環(huán)境的變化和提高細菌的存活率。VBNC細菌的生理特性發(fā)生了很大改變。與長桿狀的正常細菌相比，VBNC細菌大多表現(xiàn)為短桿狀或圓球狀，仍保持低代謝活性和毒性（Alvear-Daza et al.，2021）。如果致病性持續(xù)存在，VBNC狀態(tài)下的病原體可能會構(gòu)成未識別的公共衛(wèi)生威脅（Zhang et al.，2015）。因為能量限制，細胞生長和死亡、細胞運動、細胞群落、運輸和分解代謝等細胞等過程被抑制，從而導致細胞生長、運動和分裂的障礙，這可能導致其不能在平板培養(yǎng)基上形成菌落（Zhu et al.，2022）。信號轉(zhuǎn)導和膜傳輸過程等耗能活動在VBNC細胞中被顯著抑制以節(jié)省能量（Liao et al.，2020）。

目前，有少許關(guān)于VBNC狀態(tài)的潛在的形成機制的研究（圖1）。環(huán)境刺激會增加ROS水平，這會造成DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)損傷和會誘導SOS反應（Zhao et al.，2014）。當產(chǎn)生的ROS多于消除能力時，氧化應激隨之而來。在暴露于消毒后，細菌與氧化應激、細胞修復、DNA修復以及轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)相關(guān)的一系列應激反應被觸發(fā)，這有助于細菌應對氧化損傷和提高存活率（Yin et al.，2021）。一般應激反應是由聚合酶σS（RpoS）和LysR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（OxyR）調(diào)控的（Dalebroux et al.，2010）。RpoS賦予了細菌對各種環(huán)境壓力源的耐受性，而OxyR主要參與使細菌能夠應對氧化應激的過程（Liao et al.，2020）。因此，RpoS基因?qū)τ诩せ頥BNC細菌的形成很重要，其是調(diào)節(jié)脅迫反應因子的主要信號。

圖1 VBNC細菌的形成機制Figure 1 Formation mechanism of VBNC bacteria

嚴謹反應也在VBNC細菌的形成中起著重要作用，而過度產(chǎn)生ppGpp的細菌更有可能被誘導到VBNC狀態(tài)（Boaretti et al.，2003）。這是因為環(huán)境脅迫會誘導嚴謹反應以增強細菌對環(huán)境脅迫的抗性。但是，VBNC細菌增強了對環(huán)境脅迫的抗性卻付出了相應的代價。在嚴謹反應中，由relA基因編碼合成的(p)ppGpp會影響ATP合成過程，進一步抑制DNA復制、細胞分裂、轉(zhuǎn)錄和翻譯活動以降低能量的消耗（Ayrapetyan et al.，2018）。另外，(p)ppGpp能夠促進RpoS的合成，從而調(diào)控一般應激反應（Wang et al.，2019）。此外，毒素-抗毒素系統(tǒng)體系受到嚴謹反應的調(diào)控。嚴謹反應中的(p)ppGpp會導致多磷酸鹽的積累，從而激活Lon蛋白酶/ClpX蛋白酶并降解抗毒素（Ayrapetyan et al.，2018）。因此，更多的游離毒素積累，這擾亂了毒素-抗毒素系統(tǒng)的正常比例和導致細菌的生長被抑制（Harms et al.，2018）。毒素-抗毒素系統(tǒng)的失衡會促進細菌進入VBNC狀態(tài)（Zhang et al.，2020）。

VBNC細菌的生存策略是減少代謝活動（Oliver，2005）。ATP的合成對于修復細胞損傷和細菌生長是必要的能力，但ATP含量的降低會意味著能量代謝途徑被阻斷（Sun et al.，2017）。ATP的耗竭會導致蛋白質(zhì)聚集體產(chǎn)生，這會導致細菌進入深度休眠狀態(tài)（Pu et al.，2019）。比如非熱等離子體細菌技術(shù)通過代謝抑制和產(chǎn)生氧化應激反應誘導金黃色葡萄球菌的VBNC狀態(tài)（Liao et al.，2020）。

總的來說，VBNC狀態(tài)不是單一因素形成，而是由應對氧化應激的一般應激反應、修復DNA損傷的嚴謹反應、失衡的毒素-抗毒素系統(tǒng)、ATP的耗竭和蛋白質(zhì)聚集體的產(chǎn)生的全局調(diào)控共同促進暴露于消毒的細菌進入了VBNC狀態(tài)。

2 VBNC細菌的復蘇

VBNC細菌可以在外部壓力源消失時（例如，在水儲存和分配期間）從VBNC狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檎５目膳囵B(yǎng)狀態(tài)，即發(fā)生復蘇（Zhang et al.，2018）（圖2）。只有VBNC細菌具有復蘇能力時，進入VBNC狀態(tài)才可以被認為是細菌在壓力下的一種生存策略（Bodor et al.，2020）。復蘇過程可能是一個復雜的生理過程，涉及各個通路的調(diào)控，這意味著細胞的生理和代謝過程的恢復到正常水平（Pan et al.，2023）。VBNC細菌的形態(tài)恢復是一個重塑的過程，即從VBNC狀態(tài)復蘇過程中細胞分裂能力的恢復需要細胞質(zhì)蛋白和細胞壁肽聚糖的重新合成（Pan et al.，2023）。

圖2 VBNC細菌的復蘇示意圖Figure 2 Resuscitation diagram of VBNC bacteria

未在水消毒中去除的VBNC細菌可能會在運輸過程中復蘇，而這些復蘇的細菌很可能通過飲用水的途徑進入人體并可能產(chǎn)生嚴重疾?。↙iu et al.，2009）。因此，VBNC抗生素耐藥菌能夠復蘇是一個非常重要的公共衛(wèi)生威脅（Zhu et al.，2022）。發(fā)生復蘇后，恢復可培養(yǎng)能力的細菌導致大多數(shù)蠟蛾幼蟲感染疾病并造成其死亡，這說明了VBNC細菌在復蘇后恢復了其強致病性（Zhu et al.，2022）。VBNC細菌在恢復可培養(yǎng)能力后仍表現(xiàn)出較好的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力，這說明了復蘇細菌的抗生素耐藥性風險依然存在（Zhu et al.，2022）。

然而，仍不清楚促進VBNC細菌復蘇和致病性恢復的因素及其復蘇機制和缺乏控制VBNC致病菌復蘇的有效手段。因此，需要進行VBNC細菌的復蘇機制研究來制定更有效的消毒方法以預防或控制VBNC細菌的形成和復蘇。異養(yǎng)菌平板計數(shù)通常用于監(jiān)測細菌的消毒效果，VBNC致病菌由于其不可培養(yǎng)特性造成了消毒效果的誤判。因此，復蘇研究對于飲用水中微生物的安全性評估來說是非常必要。監(jiān)測在水消毒技術(shù)下形成VBNC致病菌的復蘇有利于確定該消毒技術(shù)的強度和處理時間是否足以完全殺滅水環(huán)境中的細菌，這有助于制定更有效的消毒策略。同樣在臨床醫(yī)療環(huán)境中，細菌可以通過進入休眠狀態(tài)來逃脫宿主的免疫系統(tǒng)和抗生素治療（主要針對活躍生長的細菌），但是這些休眠細菌會復蘇，造成疾病的復發(fā)（Epstein，2009）。因此很有必要研究休眠細菌復蘇的分子機制，這非常有助于研究人員設計一種可能的方法來降低休眠細菌復蘇造成疾病復發(fā)的頻率和進行有效抗菌。

3 VBNC細菌的復蘇方法進展

VBNC細菌對有利的環(huán)境和條件下刺激做出反應，變得代謝活躍且可培養(yǎng)（Pan et al.，2023）。目前復蘇VBNC細菌的方式各種各樣，見表1。總體來說，富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基對于細菌的復蘇是優(yōu)先的刺激。在添加了LB肉湯后，VBNC大腸桿菌發(fā)生了復蘇（Zhang et al.，2018）。升高溫度能促進低溫誘導的VBNC細菌發(fā)生復蘇（Wei et al.，2018）。復蘇促進因子能夠增加細菌的活力并促使細菌從VBNC狀態(tài)轉(zhuǎn)變成可培養(yǎng)狀態(tài)（Ye et al.，2020）。此外，添加一些促進生長的物質(zhì)也可以幫助VBNC細菌復蘇，包括過氧化氫酶、蛋白酶、YeaZ蛋白、氨基酸、丙酮酸（Ramamurthy et al.，2014）。群體感應自誘導劑AI-2可復蘇VBNC創(chuàng)傷弧菌。值得注意的是，VBNC細菌在進入宿主體內(nèi)后恢復了可培養(yǎng)能力（Hwang et al.，2006）。在河口環(huán)境中進行原位復蘇（添加營養(yǎng)和原位培養(yǎng)）治療后，VBNC創(chuàng)傷弧菌恢復了可培養(yǎng)能力和katG表達（Oliver et al.，1995a）。當紫外線輻射誘導細菌形成VBNC狀態(tài)后，可在適當?shù)臏囟龋?7 ℃）和營養(yǎng)物質(zhì)（LB肉湯）下，使得銅綠假單胞菌和大腸桿菌都可以發(fā)生復蘇，但大腸桿菌表現(xiàn)出比銅綠假單胞菌更強的復蘇能力（Zhang et al.，2015）。氯誘導的VBNC大腸桿菌在37 ℃時可以在LB肉湯中復蘇（Chen et al.，2018）。上述的復蘇條件與人體體內(nèi)環(huán)境相似，這就揭示了消毒技術(shù)誘導的VBNC細菌也是可以在人體內(nèi)恢復培養(yǎng)能力而具有潛在的健康風險。VBNC細菌代表了絕大多數(shù)有效的微生物資源，其在生物治療中具有重要意義（Su et al.，2013）。總的來說，復蘇VBNC細菌的研究大多是復蘇條件的探索，包括原位復蘇（Nichols et al.，2010）。但目前仍缺乏VBNC細菌復蘇機制方面的研究。因此我們接下來重點對復蘇機制進行詳細的綜述。

表1 復蘇的VBNC細菌的方法Table 1 Resuscitation method of VBNC bacteria

4 VBNC細菌的復蘇機制

消毒過程誘導的VBNC細菌會進入到水體環(huán)境中，有可能通過自身修復來進行復蘇。在水體環(huán)境中，其他細菌分泌的自誘導劑-2可以促進這些VBNC細菌復蘇。藤黃微球菌能夠分泌Rpf，這使得VBNC細菌可以在Rpf作用下恢復可培養(yǎng)能力。

4.1 VBNC細菌的自然復蘇潛在機制

消毒技術(shù)會引起不同細胞水平的損傷，包括膜損傷、蛋白質(zhì)碎裂、ATP生成抑制和核酸損傷（Yoon et al.，2021）。細菌已經(jīng)發(fā)展出氧化還原平衡系統(tǒng)，以防止活性氧（ROS）損傷。但是在環(huán)境刺激下，細菌內(nèi)的ROS對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA、DNA和細胞膜造成的損傷會超過細菌的修復能力時，就會發(fā)生氧化應激。氧化應激攻擊細菌細胞成分，這會導致細胞損傷甚至死亡（Sun et al.，2017）。受損的DNA無法被替換，需要修復才能保持活力（Lee et al.，2019）。為了存活并適應環(huán)境刺激，細菌會發(fā)生嚴謹反應并關(guān)閉大量基因的表達并伴隨著表型的變化（Irving et al.，2021）。細菌的新陳代謝和所利用的蛋白質(zhì)去響應環(huán)境的變化和提高細菌的存活率（Yang et al.，2021）。SOS反應可以修復消毒過程中細菌的DNA損傷并促進細菌存活，但會抑制細胞分裂（D?rr et al.，2009）。還原系統(tǒng)能夠修復細胞質(zhì)和細菌細胞膜中氧化損傷的半胱氨酸和蛋氨酸殘基（Ezraty et al.，2017）。

VBNC細菌能夠復蘇的前提就是要修復這些損傷，恢復氧化還原平衡和代謝活性。因此，我們綜述了VBNC細菌發(fā)生自然復蘇的潛在機制（圖3）。為了使細胞離開休眠狀態(tài)并恢復活力，首先需要清除蛋白質(zhì)聚集體和恢復蛋白穩(wěn)態(tài)（Pu et al.，2019）。嚴謹反應的過程中，細菌通過僅僅維持最低量的活性來節(jié)約其資源，直到條件改善時，它們可能又會恢復正常代謝（Wang et al.，2023b）。通常，細菌的應激反應允許細胞適應并從特定應激中恢復。光消毒誘導的DNA損傷可以根據(jù)消毒后條件（比如合適的光照條件）進行修復（Sousa et al.，2017）。有文獻報道UVC誘導形成的VBNC大腸桿菌確實發(fā)生了復蘇（Zhang et al.，2018）。VBNC細菌能夠修復亞致死損傷并恢復可培養(yǎng)能力。但是，隨著紫外線劑量的增加和暴露時間的延長，恢復速度似乎越來越慢（Suss et al.，2009）。也就是說，光的持續(xù)刺激會對細菌造成嚴重的損傷以至于細菌很難恢復（Karaolia et al.，2018）。

圖3 VBNC細菌的自然復蘇潛在機制Figure 3 Potential resuscitation mechanism by natural resuscitation

總體而言，復蘇能力取決于外部應激強度和VBNC狀態(tài)的持續(xù)時間（Pinto et al.，2011）。在不同強度的外應激下，細菌損傷的程度是不同的，因此休眠的深度也不一樣（Yin et al.，2022）。隨著細菌的ATP濃度的降低，高壓二氧化碳技術(shù)處理后VBNC比值增加，這表明了ATP含量與VBNC比值呈高度負相關(guān)（Yang et al.，2023）。VBNC細菌進入休眠所需的時間不同，因此休眠的深度也可能是不同的（Wang et al.，2010）。在相同的處理條件下，同一批次下的VBNC細菌并非都會發(fā)生復蘇（Chen et al.，2018）。在休眠的初始階段，這些休眠細菌可以在消除壓力后迅速復蘇。然而，如果細菌暴露在長期的壓力下，會積累更多的損傷，使得休眠程度增加，代謝活性進一步降低，那就是細胞需要更多時間來復蘇。一些VBNC細菌無法復蘇，可能因為損傷程度超出了細胞恢復生長的能力（Ayrapetyan et al.，2015）。VBNC細菌能否復蘇也取決于體內(nèi)的能量儲備。當ATP得到補充，細菌準備復蘇生長時，還需要蛋白DnaK和ClpB來完成蛋白質(zhì)聚集體的解聚（Pu et al.，2019）。撤去應激后，VBNC細胞對有利的環(huán)境條件做出反應，然后變得代謝活躍且可培養(yǎng)（Zhang et al.，2015）。復蘇過程是由偵察細胞退出休眠而激活的，這些細菌可能是休眠深度較淺的VBNC細菌（Epstein，2009）。如果環(huán)境有利，偵察細菌開始繁殖，可以向其他細菌發(fā)出信號并促進其他細菌復蘇（Epstein，2009）。細菌復蘇有最佳的時間（復蘇窗口），能量會隨著VBNC狀態(tài)持續(xù)時間的延長而消耗，復蘇能力逐漸變?nèi)酰≒into et al.，2015）。一旦時間過長，能量耗盡，細菌就可能會失去復蘇的能力。在進入VBNC狀態(tài)22 d后，通過直接活菌計數(shù)法檢測到的活細胞數(shù)量顯著減少了（Masmoudi et al.，2010）。這可能是因為休眠細菌無法修復永久性損傷，隨之因為能量耗盡而發(fā)生死亡。

4.2 VBNC細菌的Rpf復蘇潛在機制

細胞壁的改變是休眠細菌的共同特征。進入VBNC狀態(tài)后，細菌的平均細胞壁變厚了，這有助于細菌增強對環(huán)境壓力的耐受性（Rittershaus et al.，2013）。此外，VBNC細菌的細胞壁的化學性質(zhì)也發(fā)生了改變。例如，乙?；脑黾印㈦木厶堑慕宦?lián)和脂蛋白共價結(jié)合多肽的數(shù)量等（Jia et al.，2020）。雖然變厚的細胞壁是抵抗環(huán)境壓力的有效屏障，但這可能不利于細胞生長。因此，細胞壁的重塑對于休眠細胞恢復到活躍生長狀態(tài)是必不可少的（Sexton et al.，2015）。在進入VBNC狀態(tài)和復蘇過程中，調(diào)控肽聚糖合成和形態(tài)重塑的相關(guān)基因的表達發(fā)生變化，從而導致形態(tài)變化，也就是說，細胞壁的改變在VBNC狀態(tài)的維持和退出中起著至關(guān)重要的作用（Jia et al.，2020）。

當這些休眠細胞恢復生長時，可能需要調(diào)整肽聚糖的種類以進行細胞分裂（Boudreau et al.，2012）?，F(xiàn)有研究表明休眠細胞的激活需要肽聚糖水解，這會改變細胞壁的機械特性以促進細胞分裂或釋放起抗休眠信號作用的裂解產(chǎn)物（Keep et al.，2006）。值得注意的是，VBNC細菌可以被一種溶菌酶樣蛋白重新激活，然后發(fā)生復蘇（Cohen-Gonsaud et al.，2005）。當Rpf添加到VBNC/休眠微生物的培養(yǎng)物中時，即使在皮摩爾濃度下，含Rpf的細菌培養(yǎng)上清液也是可以刺激細胞生長的（Cohen-Gonsaud et al.，2005）。細胞壁衍生的多肽可以刺激大腸桿菌和銅綠假單胞菌的生長恢復（J?ers et al.，2019）。Rpf有類似于溶菌酶的折疊結(jié)構(gòu)，能夠裂解細胞壁肽聚糖，從而產(chǎn)生可以作為生長啟動信號分子的多肽（Mukamolova et al.，2006）。細胞壁衍生的多肽可以充當信使，然后促進VBNC細菌退出休眠狀態(tài)（Boudreau et al.，2012）。這可能是其觀察到的細菌復蘇和刺激其增殖的原因，也就是說這可能是Rpf復蘇VBNC細菌的潛在機制（圖4）。目前Rpf蛋白如何促進VBNC細菌退出休眠的機制有兩種說法：（1）Rpf具有細胞壁裂解活性，能夠降低因為進入VBNC狀態(tài)而改變的細胞壁結(jié)構(gòu)施加的物理限制，從而使得VBNC細菌退出休眠；（2）Rpf進入細菌體內(nèi)，細菌感知Rpf的信號，刺激細菌恢復生長（Dworkin et al.，2010）。簡單概括Rpf復蘇VBNC細菌的潛在機制：Rpf在整個細菌生長過程中重塑細胞壁，促使VBNC細菌從“不可培養(yǎng)”狀態(tài)恢復到活躍生長的可培養(yǎng)狀態(tài)。

圖4 VBNC細菌的Rpf復蘇潛在機制Figure 4 Potential Mechanism of Resuscitation by Rpf

4.3 VBNC細菌的自誘導劑復蘇潛在機制

自誘導劑是由微生物產(chǎn)生并分泌到環(huán)境中被群體中的細菌感知的小分子（Valastyan Julie et al.，2021）。群體感應信號對于復蘇過程至關(guān)重要。群體感應自誘導劑能夠促進環(huán)境水樣中休眠的霍亂弧菌發(fā)生復蘇（Bari et al.，2013）。當環(huán)境條件允許時，群體感應信號分子自誘導劑2（AI-2）能夠介導微生物種群中的細胞間通訊，并通過“群體感應”觸發(fā)相關(guān)基因表達，從而觸發(fā)VBNC細菌的復蘇（Ayrapetyan et al.，2014）。在暴露于含有AI-2的培養(yǎng)基后，自然環(huán)境中的VBNC霍亂弧菌的復蘇會迅速發(fā)生，其細胞形態(tài)從圓球狀恢復到桿狀形狀（Ayrapetyan et al.，2014）。如果水體環(huán)境中的細菌分泌大量自誘導劑，那么水環(huán)境中的休眠霍亂弧菌可能會在此期間復蘇并更容易引起人類疾病。

根據(jù)先前的研究，VBNC創(chuàng)傷弧菌不能夠在實驗室培養(yǎng)基上培養(yǎng)的原因是過氧化氫酶（CAT）活性過低（Kong et al.，2004）。CAT活性的降低是因為katG的轉(zhuǎn)錄被抑制。但是人為添加CAT可以幫助細菌從VBNC狀態(tài)中復蘇（Hamabata et al.，2021）。蛋白質(zhì)RpoS調(diào)控CAT的產(chǎn)生，而LuxR能夠增強RpoS的表達，這對VBNC細菌的復蘇來說是很重要的（Joelsson et al.，2007）。添加了AI-2后，野生型VBNC細菌能夠發(fā)生復蘇，然而RpoS突變體（不能表達RpoS基因）的VBNC細菌并不能發(fā)生復蘇（Ayrapetyan et al.，2014）。當環(huán)境中AI-2進入到VBNC細菌體內(nèi)，VBNC細菌會做出一系列響應。LuxR作為受體與AI-2結(jié)合，然后刺激VBNC細菌的RpoS的表達，隨后誘導katG表達來增強CAT的活性，降低過氧化氫毒性，從而使生物體從VBNC狀態(tài)恢復到可培養(yǎng)狀態(tài)（Ayrapetyan et al.，2014）。這可能是自誘導劑復蘇VBNC細菌的潛在機制（圖5）。

圖5 VBNC細菌的自誘導劑復蘇潛在機制Figure 5 Potential resuscitation mechanism by self-inducer

5 展望

VBNC細菌的復蘇研究結(jié)果對飲用水的微生物安全性來說非常重要。但是，評估VBNC細菌復蘇所帶來的潛在健康風險還不夠全面，還未在復蘇細菌的抗生素耐藥性、毒性表達和致病性方面進行深入研究。而且，進入/退出VBNC狀態(tài)對細菌的抗生素耐藥性的發(fā)展和傳播的具體機制仍不清楚。VBNC細菌在復蘇后發(fā)生自然轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導的頻率等需要進一步研究，這非常有助于更全面地評估VBNC細菌復蘇所帶來的潛在健康風險。

最近的研究對“多大劑量的消毒技術(shù)能夠滅活VBNC細菌并避免其復蘇”、“復蘇的VBNC細菌生理和代謝過程是否都恢復到正常水平”等問題的回答比較模糊。目前，在消毒技術(shù)下形成的VBNC細菌的復蘇機制的研究仍然比較缺乏。因此，仍需要深入研究在復蘇過程細胞的生理特性和代謝過程的恢復程度，然后從基因?qū)用骊U述VBNC細菌復蘇的潛在機制。微流控技術(shù)的延時成像能夠提供了大量圖像數(shù)據(jù)，這有助于進行深度學習分析并解析單細胞水平的微生物行為（Kasahara et al.,2023）。因此，可以開發(fā)更準確的分析方法來實現(xiàn)在單細胞水平上可視化細菌復蘇的過程并利用微流控技術(shù)分析細菌的生理特性。

人們對VBNC細菌和復蘇細菌的特定代謝特征仍然知之甚少。與可培養(yǎng)細菌相比，VBNC大腸桿菌的代謝發(fā)生了變化，這是VBNC細菌減少能量消耗的生存策略（Wang et al.，2023c）。代謝組學可作為新的技術(shù)手段來揭示復蘇細菌的標志性代謝產(chǎn)物和代謝途徑。代謝途徑的動態(tài)調(diào)節(jié)可以通過穩(wěn)定同位素示蹤來監(jiān)測（Trefely et al.，2019）。穩(wěn)定同位素示蹤代謝組學方法可以通過測量同位素標記的代謝物來定量揭示代謝活動（Wang et al.，2022）。VBNC細菌和復蘇細菌的特定代謝特征和標志物可以通過質(zhì)譜和同位素示蹤技術(shù)直接檢測，特別是單細胞代謝分析提供了強有力的技術(shù)支持。CTC-流式細胞儀檢測技術(shù)（CTC-FCM）可以測定VBNC細菌的呼吸活性（Guo et al.，2019b）?？梢赃\用CTCFCM來監(jiān)測復蘇過程細菌的呼吸活性變化并開展細菌代謝網(wǎng)絡的動態(tài)波動過程及調(diào)控機制研究。單細胞拉曼光譜顯示出更多的異質(zhì)代謝活性分布，而一些細胞甚至進入代謝“沉默”（Bao et al.，2023）。重水標記結(jié)合拉曼光譜儀可以用來監(jiān)測復蘇過程中單個細胞的代謝活性的恢復程度。熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)可以在單細胞水平上定量監(jiān)測實時監(jiān)測細菌胞內(nèi)代謝產(chǎn)物濃度（Bi et al.，2023）。也就是說，這種技術(shù)可以監(jiān)測細菌從VBNC狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閺吞K狀態(tài)的代謝過程。