微RNA在甲基苯丙胺成癮中的作用研究進展

盧關(guān)伊，吳寧，李錦

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，神經(jīng)精神藥理學(xué)北京市重點實驗室，北京 100850）

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）是一種強效中樞興奮劑，其濫用已成為全球性公共衛(wèi)生和社會問題。在世界范圍內(nèi)，MA 流行率不斷上升［1］。盡管國內(nèi)毒品濫用規(guī)模日趨縮小，但根據(jù)最新發(fā)布的《2021 年中國毒品趨勢報告》，MA 仍然是我國最主要的濫用毒品［2］。MA 長期使用或急性中毒可產(chǎn)生嚴(yán)重不良后果，包括MA 成癮、認(rèn)知功能損害和精神病樣癥狀、心腦血管功能損傷、艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染風(fēng)險增加、肝腎功能衰竭及暴力行為和自殺等［3］，且MA 濫用者在治療后1年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達61%～88%［4-5］。目前，由于MA 成癮機制尚未完全闡明，臨床缺乏客觀診斷指標(biāo)及有效干預(yù)手段，因此MA 成癮防治面臨巨大挑戰(zhàn)。

長期攝入MA 會引起基因表達譜的改變，導(dǎo)致獎賞和學(xué)習(xí)記憶等相關(guān)腦區(qū)病理性神經(jīng)適應(yīng)性的變化。表觀遺傳水平包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控等可導(dǎo)致基因表達長期改變，提示其可能在物質(zhì)成癮這種持久、異常行為調(diào)節(jié)中起重要作用［6-7］。在這些表觀遺傳調(diào)控機制中，微RNA（microRNA，miRNA）主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，其是一類長度為20～24 個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，在進化過程中高度保守，可通過與mRNA 的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，降解靶mRNA 或抑制靶mRNA 翻譯［8］而發(fā)揮生物學(xué)功能。已有研究表明，miRNA 可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元增殖、分化、凋亡及突觸可塑性等參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病的發(fā)生發(fā)展［9］，且循環(huán)miRNA 已被證實具有作為CNS 疾病診斷生物標(biāo)志物的潛能［10］。目前，已有研究表明，miRNA 在阿片類、可卡因、煙和酒等不同類型物質(zhì)成癮中發(fā)揮重要作用［11-12］，但關(guān)于miRNA 在MA 成癮中的調(diào)節(jié)作用研究較少，尚無較系統(tǒng)、全面的綜述。本文從非臨床（MA 暴露的動物和細胞模型）和臨床（MA 濫用者）兩個方面綜述miRNA 在MA 成癮中的作用，并簡要介紹細胞外囊泡中的miRNA 在MA 成癮診斷中的應(yīng)用前景，以期為闡明MA 成癮機制及其診斷和治療提供新思路。

1 非臨床研究

經(jīng)典的獎賞回路是以中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)纖維投射到伏隔核（nucleus accumbens，NAc）、前額葉皮質(zhì)（prefrontal cortex，PFC）、背側(cè)紋狀體（dorsal striatum，dStr）及海馬和杏仁核等腦區(qū)構(gòu)成的［13］。目前研究認(rèn)為，物質(zhì)濫用的急性獎賞效應(yīng)是由NAc 中DA 釋放增加介導(dǎo)的，而強迫性藥物尋求和復(fù)發(fā)的易感性是由于皮質(zhì)-Str回路的長期可塑性改變，導(dǎo)致藥物尋求行為強化并失去對這些行為的控制［14-15］，但其分子機制尚需闡明。已有大量研究利用MA 誘導(dǎo)的行為敏化、條件性位置偏愛和自身給藥等經(jīng)典的成癮相關(guān)動物模型，在MA 成癮的關(guān)鍵腦區(qū)發(fā)現(xiàn)表達失調(diào)的miR?NA。雖然大多數(shù)研究僅在生物信息學(xué)水平預(yù)測了差異表達miRNA 可能參與MA 成癮相關(guān)調(diào)節(jié)的靶基因及通路，但部分研究表明，miRNA 可通過調(diào)節(jié)突觸可塑性、神經(jīng)損傷和免疫功能等參與MA 成癮及所致?lián)p害的發(fā)生發(fā)展。

1.1 miRNA在MA誘導(dǎo)的神經(jīng)可塑性中的作用

神經(jīng)可塑性可分為結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性。結(jié)構(gòu)可塑性一般指神經(jīng)元數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如神經(jīng)再生、神經(jīng)元樹突或樹突棘的改變［16］；功能可塑性一般指神經(jīng)元突觸電生理強度或化學(xué)信號的變化，如α-氨-3-羥-5-甲-4-異唑丙酸（alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid，AMPA）受體和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid，NMDA）受體興奮性突觸后電流比率的變化、突觸傳遞長時程增強（long-term potentia?tion，LTP）或長時程抑制［17-18］。長期使用成癮性物質(zhì)導(dǎo)致的神經(jīng)可塑性改變，被認(rèn)為是強迫性用藥及長期戒斷后復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)［19］。因此，突觸可塑性調(diào)節(jié)可能是藥物成癮治療的潛在靶點［20］。研究表明，miRNA 可能通過調(diào)節(jié)突觸可塑性參與阿片類、可卡因和乙醇等物質(zhì)成癮［21］，而且一些miRNA 如miR-181a，miR-124，miR-31-3p，miR-134，miR-128 和novel-m009C 等可能也通過調(diào)控神經(jīng)可塑性參與MA成癮。

1.1.1 miR-181a

Saba 等［22］報道，可卡因和安非他明這類可誘導(dǎo)DA 過度釋放的精神興奮劑，可介導(dǎo)miR-181a 在成癮相關(guān)腦區(qū)NAc、PFC、海馬和腹側(cè)中腦中高表達。此外，采用大鼠原代海馬神經(jīng)元研究表明，miR-181a 是AMPA 受體亞基谷氨酸受體2（gluta?mate receptor 2，GluR2）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miR-181a過度表達不僅可降低突觸表面GluR2水平，還可降低海馬神經(jīng)元中樹突棘的形成和微小興奮性突觸后電流頻率。研究表明，miR-181a 可通過調(diào)節(jié)突觸可塑性參與可卡因成癮［23-24］。在MA 誘導(dǎo)的條件性位置偏愛大鼠海馬腦區(qū)中也發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p表達上調(diào)［25］，表明不同種類的成癮性物質(zhì)可能通過相似的途徑（增加腦內(nèi)獎賞環(huán)路中DA 神經(jīng)信號）導(dǎo)致miR-181a 表達上調(diào)，進而降低GluR2 表達、調(diào)節(jié)突觸可塑性而參與成癮進程。相反，在MA 誘導(dǎo)的條件性位置偏愛大鼠dStr 中發(fā)現(xiàn)，miR-181a 表達下調(diào)［26］。miR-181a還可直接靶向A型γ-氨基丁酸受體α1 亞基〔GABA（A）receptor subunit alpha-1，GABAAα1〕，但在MA 誘導(dǎo)的條件性位置偏愛大鼠dStr 中miR-181a 卻不直接靶向GABAAα1，而是通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解間接導(dǎo)致GABAAα1下調(diào)，參與MA 成癮的調(diào)節(jié)［26］。綜上所述，MA 處理導(dǎo)致的miR-181a 表達變化在不同腦區(qū)存在差異，且miR-181a 可能通過調(diào)節(jié)不同靶基因共同參與MA成癮。因此，miRNA 在疾病中多靶點的研究值得進一步探索。

1.1.2 miR-124

目前，miR-124 在神經(jīng)元分化、成熟、存活和突觸可塑性中的作用已有許多報道［23，27-28］。miR-124的主要表達形式為miR-124-1。Kozuka 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，部分抑制miR-124-1表達（miR-124-1+/?）的小鼠呈現(xiàn)MA 誘發(fā)的高活動性增強、受損的前脈沖抑制及社交障礙。進一步研究表明，miR-124-1 雖不直接靶向DA D2 受體（DA D2 receptor，DAD2R），但miR-124-1+/-小鼠PFC 中DAD2R 表達升高且突觸傳遞增強，給予DAD2R 激動劑可降低抑制性突觸后電流的振幅，推測miR-124 可能通過DAD2R影響PFC 中DA 功能及突觸傳遞參與MA 成癮。以往研究表明，對認(rèn)知功能具有重要作用的內(nèi)側(cè)PFC（medial PFC，mPFC）參與MA 誘導(dǎo)的海馬LTP損傷［29］。

1.1.3 miR-31-3p

Qian 等［30］在MA 誘導(dǎo)的條件性位置偏愛小鼠背側(cè)海馬中發(fā)現(xiàn)miR-31-3p 表達上調(diào)，抑制或過表達背側(cè)海馬的miR-31-3p 可促進或抑制條件性位置偏愛的形成，且miR-31-3p 可負(fù)性調(diào)控RhoA的表達。前期研究表明，小G 蛋白Rho 家族的RhoA 參與神經(jīng)元形態(tài)和突觸可塑性的調(diào)節(jié)［31-32］，在嗎啡和可卡因成癮的動物模型中也觀察到RhoA 蛋白與成癮形成和戒斷密切相關(guān)［33-34］。因此推測，背側(cè)海馬中的miR-31-3p 可能通過RhoA信號通路調(diào)節(jié)突觸可塑性，影響MA 成癮相關(guān)記憶的形成。

1.1.4 miR-134

神經(jīng)行為學(xué)和神經(jīng)影像學(xué)證據(jù)表明，從娛樂性藥物使用到藥物成癮的變化表現(xiàn)為從PFC 對行為的控制向皮質(zhì)下Str 控制的轉(zhuǎn)變，以及Str 對行為的控制從腹側(cè)部向背側(cè)部的轉(zhuǎn)變［35］；且以往研究發(fā)現(xiàn)，失活或干預(yù)背外側(cè)Str（dorsolateral Str，dlStr）而不是背內(nèi)側(cè)Str（dorsomedial Str，dmStr）可選擇性地破壞可卡因習(xí)慣性和強迫性藥物使用以及藥物尋求行為［36］，但對其分子調(diào)節(jié)機制的研究較少。本課題組近期的研究采用大鼠規(guī)律性用藥及強迫性用藥自身給藥模型，分別模擬臨床MA 使用障礙（MA use disorder，MUD）患者從娛樂性和規(guī)律性用藥到過量的不可控用藥的行為過程，發(fā)現(xiàn)miR-134 表達水平僅在MA 主動給藥（而非被動給藥）模型中強迫性用藥大鼠而非規(guī)律性用藥大鼠的dlStr中顯著升高，在dmStr 中無顯著變化［37］，這與規(guī)律性用藥向強迫性用藥行為轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵腦區(qū)相符合。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，降低dlStr中miR-134可顯著升高LIM 激酶1（LIM kinase 1，LIMK1）蛋白表達水平，并減輕大鼠強迫性用藥行為［37］。已有研究表明，miR-134 可直接負(fù)性調(diào)節(jié)LIMK1 蛋白表達水平，且LIMK1 在樹突棘結(jié)構(gòu)和突觸可塑性中均發(fā)揮重要作用［38-39］。此外，miR-134 作為大腦中神經(jīng)元分化和樹突棘發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，與記憶形成和突觸可塑性相關(guān)［38，40］，此作用部分是通過LIMK1 和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮的［39］。因此，dlStr 中miR-134可能通過調(diào)節(jié)突觸可塑性在規(guī)律性用藥向強迫性用藥的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。由于強迫性用藥不僅是藥物成癮的核心特征，而且是戒斷后高復(fù)發(fā)傾向的前提，因此上述發(fā)現(xiàn)為進一步闡明MA成癮的神經(jīng)生物學(xué)機制和防復(fù)吸干預(yù)治療提供新的思路。

1.1.5 miR-128

Li 等［41］報道，反復(fù)給予而非單次給予MA 可增加小鼠NAc 中miR-128 的表達，因此NAc 中miR-128 的上調(diào)與更持久的神經(jīng)適應(yīng)改變有關(guān)，而非急性MA 處理引起的的短暫反應(yīng)。抑制或過表達NAc中的miR-128，可顯著減弱或增強MA 誘導(dǎo)的行為敏化的形成和表達。蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在MA敏化過程中，有25個潛在的靶點受到miR-128的調(diào)控，功能注釋和富集分析表明這些靶點主要集中在調(diào)節(jié)樹突棘、突觸傳遞以及神經(jīng)疾病等方面。同時，過表達或抑制miR-128 可進一步降低或增加MA 誘導(dǎo)的諸如ADP 核糖基化因子6 和突觸細胞黏附分子1 等與神經(jīng)元突觸可塑性相關(guān)基因表達下調(diào)。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-128 可調(diào)節(jié)DAD1R 而非D2R 依賴的神經(jīng)元興奮性［42］，且DAD1R 而非D2R對NMDA 受體介導(dǎo)的海馬-mPFC 的LTP 起決定性作用［29］，因此推測miR-128 通過影響DA 功能調(diào)節(jié)突觸可塑性參與MA成癮。

1.1.6 novel-m009C

Zhu 等［43］在小鼠中發(fā)現(xiàn)一個新的miRNA，暫命名為novel-m009C，其主要分布于小鼠NAc、dStr和前扣帶回中，但在MA 暴露后novel-m009C 僅在NAc中顯著下調(diào)，NAc中過表達或抑制novel-m009可減弱或增強MA 誘導(dǎo)的小鼠高活動性和條件性位置偏愛行為，但不影響小鼠對蔗糖的自然偏好。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MA 可通過激活DA 受體信號通路導(dǎo)致小鼠NAc 中novel-m009C 表達降低，且novelm009C可能靶向NMDA 受體1，在NAc中過表達或抑制novel-m009C 的同時給予NMDA 受體激動劑或拮抗劑可逆轉(zhuǎn)novel-m009C對MA誘導(dǎo)條件性位置偏愛的調(diào)控，提示novel-m009C 可能通過影響DA 獎賞通路中NMDA 受體介導(dǎo)的突觸可塑性參與MA 的獎賞效應(yīng)。鑒于成熟miRNA 在不同物種間高度保守，序列比對認(rèn)為novel-m009C 可能與hsamiR-604同源。以往研究僅在乙醇使用障礙患者的PFC 中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-604 表達上調(diào)［44］，其在MUD中的作用及機制需進一步研究。

1.2 miRNA在MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷中的作用

MA 介導(dǎo)的神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥均可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，產(chǎn)生廣泛的神經(jīng)損傷［45］。MA 誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷與成癮行為之間形成閉環(huán)，相互促進。目前認(rèn)為MA 所致神經(jīng)損傷主要與DA 功能紊亂導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、興奮性毒性、多種凋亡途徑及膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等有關(guān)［45-46］，但具體分子機制有待進一步闡明。

1.2.1 調(diào)節(jié)DA功能和凋亡相關(guān)通路

Chavoshi 等［47］報道，MA 反復(fù)給藥可降低大鼠Str體積和樹突長度，同時酪氨酸羥化酶表達顯著降低，凋亡相關(guān)蛋白胱天蛋白酶3表達升高，星形膠質(zhì)細胞過度激活和增生，提示MA可導(dǎo)致DA系統(tǒng)功能障礙和Str 損傷。此研究還同時觀察了上述MA 暴露大鼠Str 內(nèi)miRNA 表達的改變，共發(fā)現(xiàn)167 個失調(diào)的miRNA，包括let-7b-5p，miR-485-5p，miR-326-3p，miR-34a-5p，miR-3068-5p 和miR-101a-3p 等，并預(yù)測變化的miRNA 主要富集于細胞凋亡、增殖、分化以及突觸可塑性相關(guān)通路。Li 等［48］報道，非編碼環(huán)狀RNA Homer1 在MA 誘導(dǎo)的條件性位置偏愛模型小鼠NAc、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、PFC 和海馬中表達上調(diào)；生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Homer1 可作為miR-101-3p的海綿，參與miR-101-3及其靶基因的調(diào)控。前期已有大量研究報道，miR-101 表達下調(diào)可通過增強凋亡相關(guān)通路如人磷脂酰肌醇三羥基激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphoinositide-3 kinase/RAC-alpha serine/threonine-protein kinase/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR）等參與腫瘤發(fā)生［49-50］，而mTOR 作為細胞凋亡的經(jīng)典通路，在MA 導(dǎo)致的神經(jīng)毒性中也發(fā)揮重要作用［51］。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p可增加α突觸核蛋白介導(dǎo)的DA神經(jīng)元損傷［52］，因此推測MA 誘導(dǎo)的miR-101a-3p 等表達水平失調(diào)，可能與DA 功能異常導(dǎo)致的神經(jīng)損傷密切相關(guān)。

Chen 課題組利用MA 誘導(dǎo)的行為敏化模型，通過RNA 測序，在小鼠NAc 腦區(qū)發(fā)現(xiàn)MA 介導(dǎo)的miRNA［53］、長鏈非編碼RNA［54］和mRNA［55］表達譜的變化，并提供了可能參與MA成癮的非編碼RNAmRNA 相互作用網(wǎng)絡(luò)［55］。該課題組進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-29c 表達水平在MA 誘導(dǎo)的行為敏化而非MA 單次給藥小鼠的NAc 腦區(qū)中顯著降低，過表達或抑制NAc中miR-29c的表達可增強或減弱MA誘導(dǎo)的行為敏化［56］。與此類似，在可卡因誘導(dǎo)的行為敏化小鼠NAc 中也發(fā)現(xiàn)miR-29 表達下調(diào)［57］。目前，miR-29c在神經(jīng)退行性疾病、腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病中的作用報道較多，認(rèn)為miR-29c 過表達可抑制炎癥和凋亡［58-59］，提示miR-29c 對MA 成癮的潛在治療價值。

1.2.2 調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞激活

已知MA 所致神經(jīng)損傷與膠質(zhì)細胞激活有關(guān)，其中小膠質(zhì)細胞激活參與大腦的神經(jīng)毒性或保護機制［45］。MA 暴露可導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞過度活化，產(chǎn)生大量的致炎因子進而誘發(fā)其死亡，而細胞凋亡和自噬在其中發(fā)揮重要作用［60］。Bcl-2 結(jié)合成分3（Bcl-2-binding component 3，BBC3），也稱P53 上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子（P53-up-regulated modulator of apoptosis，PUMA），是Bcl-2 家族中僅含BH3 結(jié)構(gòu)域的最常見的凋亡誘導(dǎo)劑。體外研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可直接靶向PUMA 并負(fù)性調(diào)節(jié)其表達，miR-143/PUMA 可通過調(diào)節(jié)凋亡和自噬間的相互作用，參與MA 暴露導(dǎo)致的小膠質(zhì)細胞存活率下降［61］。同時，miR-143/PUMA 可通過增加NOD 樣受體蛋白3 炎癥小體的激活，導(dǎo)致MA暴露下小膠質(zhì)細胞活化［62］。動物實驗研究結(jié)果也表明，抑制小鼠海馬腦區(qū)miR-143 表達可緩解MA 導(dǎo)致的腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞減少，此結(jié)果在miR-143 基因敲除小鼠上也得到證實。上述研究表明，miR-143 可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞炎癥和存活參與MA 介導(dǎo)的神經(jīng)毒性及成癮病理過程。

Peli1（Pellino1）可引起小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)炎癥的發(fā)生［63］。Yu 等［64］在離體和整體動物模型中均發(fā)現(xiàn)，miR-142a-3p 可直接靶向Peli1 參與MA 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，過表達的miR-142a-3p 可能通過下調(diào)Peli1 及其下游p38 絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB 炎性通路抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。上述研究表明，miRNA 在MA 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活、炎癥及凋亡中均發(fā)揮重要作用，但小膠質(zhì)細胞激活與MA成癮之間的關(guān)系尚需進一步研究。

另有報道，circHIPK2 作為miRNA 海綿結(jié)合并抑制內(nèi)源性miR-124 的活性，在轉(zhuǎn)錄后水平增加Sigma-1 受體的表達。在整體和離體水平均發(fā)現(xiàn)，抑制circHIPK2可通過增加miR-124及下調(diào)Sigma-1受體的表達，調(diào)控MA 介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而抑制星形膠質(zhì)細胞活化［65］。因此，miRNA 在MA 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞神經(jīng)毒性中均發(fā)揮重要作用，這為MA 所致神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷的治療提供了新策略。

1.2.3 參與MA 誘導(dǎo)的血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）損傷

MA 可破壞BBB，但其造成BBB 完整性損傷的機制尚未完全闡明。對小膠質(zhì)細胞炎癥和凋亡發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的miR-143 在MA 濫用者血清及MA 被動給藥小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞、海馬、皮質(zhì)、Str 和中腦中的表達顯著增加［66］。已有研究報道，MA 與Sigma-1 受體直接作用可介導(dǎo)小鼠大腦DA神經(jīng)元中miR-143 水平升高。另據(jù)報道，miR-143可通過靶向PUMA 增加人腦內(nèi)皮細胞的通透性，同時降低緊密連接蛋白的表達，從而導(dǎo)致BBB 損傷；而降低miR-143 的表達，可通過上調(diào)PUMA、增加緊密連接蛋白的表達，對MA 誘導(dǎo)的BBB 損傷起保護作用［66］。此外，內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT）這一動態(tài)過程的損害也會導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細胞失去保護作用，引起B(yǎng)BB 損傷。以往研究發(fā)現(xiàn)，circHECW2 可通過競爭性結(jié)合miR-30d 促進自噬相關(guān)蛋白5（autophagy protein 5，ATG5）表達，調(diào)控EndoMT 過程；低濃度MA 處理導(dǎo)致的ATG5 上調(diào)是以非自噬的作用途徑影響EndoMT過程，參與BBB 完整性的調(diào)控［67］。該結(jié)果為闡明ATG5 在MA 誘導(dǎo)的EndoMT 中的非經(jīng)典作用提供了新的線索。綜上所述，miR-143 和miR-30d可通過調(diào)節(jié)腦微血管內(nèi)皮細胞參與MA 介導(dǎo)的BBB 損傷，這為miRNA 在MA 濫用等廣泛的神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病中腦血管損傷的潛在治療提供了線索。

1.3 miRNA在MA誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)損傷中的作用

MA 本身的藥理學(xué)特征增加了MA 使用導(dǎo)致HIV 感染的風(fēng)險［68］。已有研究表明，MA 使用與免疫系統(tǒng)改變及HIV 傳播和復(fù)制增加有關(guān)［69-70］，一些抗HIV miRNA 在HIV 潛伏期或在保護單核細胞/巨噬細胞等免受HIV-1 感染方面具有關(guān)鍵作用［71-73］，提示MA 可能通過調(diào)節(jié)miRNA 參與HIV 的感染和發(fā)展。

1.3.1 參與MA 暴露導(dǎo)致的巨噬細胞/單核細胞HIV感染

在MA 處理的巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)，具有抗HIV 作用的miRNA（如miR-28，miR-150，miR-223，miR-382 和miR-198）及內(nèi)源性Ⅰ型干擾素（干擾素α/β）等分子表達下調(diào)，這與巨噬細胞對HIV 感染的易感性增加以及病毒復(fù)制增強有關(guān)［74］。此外，在MA 處理的單核細胞中也觀察到相似的結(jié)果。MA 處理導(dǎo)致人單核細胞中抗HIV 相關(guān)miRNA（miR-28，miR-29a，miR-125b，miR-146a，miR-155，miR-223和miR-382 等）及干擾素-λ1 和抗病毒干擾素刺激基因等表達下調(diào)，從而損害抗HIV免疫，促進HIV在單核細胞中復(fù)制［75］。綜上所述，MA 處理導(dǎo)致的抗HIV 相關(guān)miRNA 表達下調(diào)，可能在MA 濫用者HIV感染和進程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

1.3.2 參與MA暴露導(dǎo)致的CD4+T細胞HIV感染

臨床研究表明，MA 濫用會導(dǎo)致CD4+T 細胞耗竭、炎癥和免疫激活，從而促進HIV 感染和疾病進展［76］。采用MA100 μmol·L-1處理CD4+T 細胞，發(fā)現(xiàn)通過Sigma-1 受體信號通路激活CD4+T 細胞，可增加miR-34c-5p 表達及NF-κB 等轉(zhuǎn)錄激活，從而增強HIV-1 復(fù)制［77］。此外，MA 可誘導(dǎo)CD4+T 細胞中白細胞介素1β 和miR-146a 表達升高，miR-146a可能通過降低腫瘤壞死因子受體關(guān)聯(lián)因子6表達而靶向關(guān)鍵的先天免疫途徑，介導(dǎo)MA 暴露所致的HIV-1復(fù)制增加［78］。然而，MA對CD4+T細胞中HIV-1復(fù)制的影響尚存在爭議。Mantri 等［79］報道，MA 1～50 mmol·L-1對CD4+T細胞中HIV-1復(fù)制影響較小，而當(dāng)MA濃度＞100 mmol·L-1（100～1000 mmol·L-1）時，可濃度依賴性抑制CD4+T 細胞中HIV-1 復(fù)制，同時上調(diào)CD4+T細胞中抗HIV-1相關(guān)miRNA（miR-125b，miR-150 和miR-28-5p）的表達，并認(rèn)為MA對HIV 復(fù)制產(chǎn)生相反的結(jié)果可能是由于MA 使用與HIV-1 之間相互作用的復(fù)雜性，我們推測可能由于MA 濃度的不同導(dǎo)致MA 影響HIV 復(fù)制的差異。因此，在體外研究MA 對HIV 的作用時，需增加MA 濃度范圍并使用更多類型的細胞。

2 臨床研究

目前臨床上對于MA 成癮（依賴）的診斷，公認(rèn)且使用最廣泛的依據(jù)是《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊（第五版）》，其將MA 濫用與依賴定義為更加中性的MUD，但其診斷仍依賴于主觀報告和癥狀評估，缺乏客觀的生物標(biāo)志物。由于循環(huán)體液中miRNA 具有較好的穩(wěn)定性和特異性，因此在疾病發(fā)生的早期階段即可觀察到其失調(diào)。此外，非臨床研究已表明，miRNA 在MA 成癮進程的各階段均具有重要調(diào)節(jié)作用，提示循環(huán)體液miRNA 作為MA 成癮的非侵入性生物標(biāo)志物具有潛在應(yīng)用價值。因此，目前臨床上關(guān)于miRNA 在MA 成癮中作用的研究主要集中在血液miRNA 作為MA 成癮診斷及精神癥狀等潛在生物標(biāo)志物的研究。

Zhao 等［80］在124 例MUD 患者和正常對照人群血漿中首次發(fā)現(xiàn)MUD 患者miRNA 的差異表達譜。進一步驗證發(fā)現(xiàn)，miR-181a，miR-15b，miRlet-7e 和miR-let-7d 表達顯著降低，且miRNA 表達水平與過去幾個月內(nèi)MA 使用頻率呈負(fù)相關(guān)，提示上述miRNA 可能在MA 成癮病理過程中發(fā)揮重要作用。Zhang 等［81］進一步發(fā)現(xiàn)，MUD 患者血清中miR-181a 下降的同時，AMPA 受體GulR2 亞基表達上調(diào)，并在細胞水平表明miR-181a 直接調(diào)控GRIA2 的表達，提示其可能在MA 介導(dǎo)的異常突觸可塑性中發(fā)揮重要作用。由于MA 成癮患者會伴隨類似精神分裂等精神病樣癥狀，他們進一步在伴有精神癥狀的MUD患者中檢測了上述miRNA的表達變化，發(fā)現(xiàn)miR-181a 表達上調(diào)，miR-15b，miR-let-7e 和miR-let-7d 表達下調(diào)。此外，miR-181a 基因rs10760371 位點基因多態(tài)性與MA 濫用伴隨精神癥狀相關(guān)，但表達數(shù)量性狀位點分析發(fā)現(xiàn)，rs10760371 位點并不調(diào)節(jié)miR-181a 的表達水平［82］。由于物質(zhì)使用障礙是一種復(fù)雜腦疾病，受遺傳和環(huán)境等多種因素影響，關(guān)于miRNA基因多態(tài)性參與MA 成癮易感性方面的研究，未來需要在更大的臨床樣本中探究。值得注意的是，血液中miR-181a 的表達水平在不同MA 使用人群中也出現(xiàn)了極大的差異，這種差異可能由于使用MA 人群伴隨不可避免的煙、酒、藥物等使用，或者由于MA 使用嚴(yán)重程度不同伴隨不同程度的共病所致。因此，為明確miR-181a在MA成癮中的作用，需采用更大規(guī)模的臨床樣本進行深入研究。

目前，僅有1 篇報道采用MA 濫用者腦組織樣本研究MA 介導(dǎo)的miRNA 表達譜的變化［83］。研究采用PCR 微陣列篩選了HIV 陽性MA 濫用者和匹配對照者的額葉皮質(zhì)尸檢組織中的miRNA 差異表達，發(fā)現(xiàn)miR-9等神經(jīng)元特異性miRNA 表達顯著升高。進一步在體外細胞水平證明，HIV 和MA 處理可誘導(dǎo)miR-9升高，其可能通過調(diào)控KCNMA1剪接變體影響DA能神經(jīng)元遞質(zhì)的釋放，從而在MA濫用者神經(jīng)適應(yīng)性改變及HIV在物質(zhì)成癮者易感性中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。此外，與對照組相比，在海洛因和MA 濫用者血清中均發(fā)現(xiàn)顯著升高的miRNA，其中miR-9-3p僅在MA濫用者血清中顯著增加，對MA濫用的預(yù)測展現(xiàn)出較好的預(yù)測效度（ROC曲線下面積為0.743）。上述研究提示，改變后的血清miRNA可能被用作識別不同種類的物質(zhì)濫用和成癮的客觀生物標(biāo)志物，用于診斷和治療的輔助工具。

已知MA 濫用導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷，研究者在19 例MA 依賴患者中發(fā)現(xiàn)Stroop 任務(wù)完成的缺陷，影像學(xué)顯示他們右側(cè)顳下回有更高的激活和白質(zhì)體積增大［84］。此外，與健康對照相比，MA 依賴患者血漿中炎癥相關(guān)因子如腫瘤壞死因子α 等含量增加，但參與各種程序性細胞死亡機制（如細胞凋亡和自噬等）的循環(huán)標(biāo)志蛋白水平及已報道參與細胞凋亡相關(guān)miRNA（miR-15，miR-16，let-7a，miR-103，miR-107，miR-181a 和miR-143 等）無顯著變化，提示MA 可激活炎癥而非程序性細胞死亡相關(guān)通路。值得注意的是，在MA 依賴患者中上述參與細胞凋亡相關(guān)的miRNA表達變化雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但均有升高趨勢，因此尚需擴大臨床樣本量對上述結(jié)果進行進一步驗證。

3 細胞外囊泡miRNA在MA成癮中的作用

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）主要包括外泌體和微囊泡。大多數(shù)細胞均可分泌EV，并可攜帶供體細胞來源的蛋白質(zhì)、miRNA 和脂質(zhì)等，作為一種新型的細胞間交流方式，在細胞間通訊中發(fā)揮重要作用。EV 可透過BBB，因此在CNS 疾病的診斷中具有潛在意義。近年來研究開始關(guān)注EV，特別是EV 中的miRNA 在成癮性物質(zhì)中的作用［85］，但EV 中的miRNA 在MA 成癮中的報道較少。

3.1 可能作為外周與中樞信息交流的載體

最早的1 篇報道采用大鼠MA 誘導(dǎo)的條件性位置偏愛模型，發(fā)現(xiàn)MA 組大鼠血清外泌體miRNA 和海馬組織miRNA均發(fā)生差異表達，其表達譜雖不盡相同，但生物信息學(xué)分析顯示差異表達的miRNA調(diào)控的靶基因主要集中在神經(jīng)元信息傳遞和突觸傳遞上，且有3 個miRNA（miR-181a-5p，miR-200a-3p 和miR-375-3p）在大鼠血清外泌體和海馬組織中的變化趨勢相同［25］，提示外泌體可能作為中樞與外周miRNA 交流的特異性生物載體，介導(dǎo)MA 成癮在中樞和外周系統(tǒng)持續(xù)發(fā)生。

以往研究發(fā)現(xiàn)，使用MA 會同時造成CNS 和心血管系統(tǒng)損傷［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可參與CNS 和心血管系統(tǒng)疾病的信息交流［86-87］，提示外泌體可能在MA 介導(dǎo)的中樞和外周疾病的持續(xù)發(fā)生中起到重要調(diào)節(jié)作用。鉤藤堿是一個在MA 成癮及心腦血管保護中均發(fā)揮重要作用的生物堿［88-89］。研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿處理的心肌細胞的外泌體可抑制MA誘導(dǎo)的小鼠條件性位置偏愛形成，并改善MA所致小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)損傷，即產(chǎn)生與鉤藤堿直接給藥相同的藥理學(xué)作用；且鉤藤堿處理的心肌細胞外泌體可能是通過攜帶下調(diào)的miR-183-5p 從而上調(diào)海馬神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 表達改善MA 成癮［90］，表明外泌體miRNA 可能是鉤藤堿同時改善MA 處理導(dǎo)致的中樞與外周癥狀的溝通媒介。上述研究雖未直接證明外泌體miRNA 在MA 導(dǎo)致的中樞和外周系統(tǒng)損傷中存在直接聯(lián)系，但提示在MA 成癮狀態(tài)下確存在中樞與外周外泌體之間的信息交流，為進一步針對MA 成癮及其外周共病的研究及治療提供新的思路。

3.2 在MA成癮診斷中的潛在作用

近年來研究開始關(guān)注將EV 中miRNA 作為MA濫用和成癮狀態(tài)診斷的潛在生物標(biāo)志物。在臨床研究中，Sandau等［91］首次揭示女性MA濫用者血漿EV 中miRNA 表達譜的變化。與健康對照相比，共發(fā)現(xiàn)169 個差異表達的miRNA，其中3 個miRNA（miR-301a-3p，miR-328-5p 和miR-628-5p）的表達水平與MA 臨床使用特征具有相關(guān)性，靶點預(yù)測提示主要參與心血管疾病和神經(jīng)炎癥。Kim 等［92］報道，MA 戒斷患者血漿EV 中miR-137 表達顯著降低，且其不受MA戒斷時間、MA累積使用時間、吸煙狀況、抑郁或抗抑郁治療的影響，提示其可能作為穩(wěn)定的MA戒斷狀態(tài)生物標(biāo)志物。此外，血漿EV中miR-137 表達與年齡相關(guān)，健康對照者呈年齡依賴性降低，而MA 戒斷患者則呈年齡依賴性增加，因此，血漿EV中miR-137在青年MA濫用患者中具有更好的診斷效果。另外，在非人靈長類動物和嚙齒動物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，MA 暴露期間EV 中miR-29a-3p 表達顯著升高［93］。暴露MA 的靈長類動物腦源性EV 和小膠質(zhì)細胞中miR-29a-3p 升高，且伴隨炎癥發(fā)生和神經(jīng)元損傷；使用抗炎藥物AV411 可降低MA 自身給藥大鼠的覓藥行為重建，降低miR-29a 表達，從而減輕炎癥，改善突觸損傷。此外，該研究還在臨床MUD患者中發(fā)現(xiàn)，miR-29a可能作為一種生物標(biāo)志物用于監(jiān)測MUD患者的神經(jīng)損傷。

3.3 用于識別MA成癮或其他物質(zhì)成癮

最近的研究還關(guān)注了不同類型的成癮性物質(zhì)引起EV 中miRNA 表達的變化。Li 等［94］比較了MA與氯胺酮誘導(dǎo)的條件性位置偏愛大鼠模型血清外泌體miRNA 表達譜的變化，在MA 誘導(dǎo)的條件性位置偏愛大鼠血清外泌體中發(fā)現(xiàn)276 個上調(diào)的miRNA和25 個下調(diào)的miRNA；而氯胺酮誘導(dǎo)的條件性位置偏愛大鼠血清外泌體中僅發(fā)現(xiàn)267 個下調(diào)的miRNA，其有10個miRNA（miR-128-3p，miR-133a-3p，miR-152-3p 和miR-181a-5p 等）在上述2 個模型中均發(fā)生改變。KEGG 分析顯示，這些共同變化的miRNA調(diào)控的靶基因主要富集在囊泡轉(zhuǎn)運及DA能和GABA能突觸調(diào)節(jié)上，提示外泌體miRNA既可反映不同種類成癮性物質(zhì)的差異，又可反映物質(zhì)成癮的共性。此外，Chen 等［95］比較了伴隨抑郁和焦慮癥狀的MA 依賴患者和海洛因依賴患者血漿外泌體miRNA 表達譜的變化。結(jié)果表明，與對照組相比，在MA 依賴或海洛因依賴患者中分別發(fā)現(xiàn)34 和19 個差異表達的外泌體miRNA，其中有15 個在MA 和海洛因依賴患者中均發(fā)生變化。生物信息學(xué)分析顯示，上述miRNA 主要富集在神經(jīng)和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，表明外泌體miRNA 在不同成癮性物質(zhì)調(diào)節(jié)中的特性和共性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，MA依賴患者中外泌體miR-16-5p，miR-129-5p，miR-363-3 和miR-92a-3p 表達的變化與焦慮及抑郁嚴(yán)重程度評分均呈負(fù)相關(guān)。前期研究表明，約40% MA 使用者會產(chǎn)生不同程度的抑郁和焦慮等精神癥狀［96］。上述研究提示，外泌體miRNA 具有作為MA 成癮導(dǎo)致精神癥狀生物標(biāo)志物的潛力，可能為MA 成癮相關(guān)精神癥狀的監(jiān)測和治療提供線索。

4 結(jié)語

目前miRNA 在MA 成癮中作用的研究主要集中在動物和細胞水平，發(fā)現(xiàn)在獎賞通路各關(guān)鍵腦區(qū)均存在若干差異表達的miRNA，其可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)損傷和免疫系統(tǒng)等參與MA 成癮及其所致?lián)p害的發(fā)生發(fā)展。但遺憾的是，目前研究采用的成癮相關(guān)動物模型主要集中在被動給藥、行為敏化和條件性位置偏愛。因此，后續(xù)研究應(yīng)著重采用更符合成癮臨床特征的自身給藥模型進行進一步研究，以明確miRNA 參與MA 成癮的神經(jīng)生物學(xué)機制，為臨床診斷及干預(yù)的研究提供堅實的基礎(chǔ)。在臨床水平，即針對于MA 濫用者，目前研究還較少，多集中在血液miRNA作為其診斷和狀態(tài)生物標(biāo)志物的潛能方面。相信隨著研究的深入以及在更大規(guī)模的臨床樣本中進行驗證，血液中miRNA有望填補臨床上物質(zhì)使用障礙診斷生物標(biāo)志物的空白。

近年來，由于EV 可透過BBB 并攜帶供體細胞來源的生物活性物質(zhì)，越來越多的研究開始關(guān)注EV 內(nèi)含物特別是miRNA 在CNS 疾病中的作用。目前關(guān)于EV 中miRNA 在MA 成癮中的研究還相對不足，處于初級階段。EV 的miRNA 與循環(huán)miRNA相似但更穩(wěn)定，在MA 成癮狀態(tài)標(biāo)志物及鑒定成癮性物質(zhì)種類的診斷上體現(xiàn)其優(yōu)勢。此外，EV 中的miRNA 可作為中樞和外周之間信息傳遞的載體，這為MA 長期使用導(dǎo)致外周其他系統(tǒng)如心血管、肝、腎等損傷的機制研究及干預(yù)藥物的研發(fā)提供了新的方向，值得關(guān)注。隨著研究的深入，對MA 成癮的神經(jīng)生物學(xué)機制將會有更深入的闡述，并為MA 成癮的診斷和治療提供新的策略。