渤海灣7種蝦虎魚科魚類COI基因序列特征及分子分類研究

房恩軍　郭彪　鄭德斌　張 雪　王碩　王宇

摘? ? 要：為獲得渤海灣天津海域常見蝦虎魚線粒體條形碼序列及系統(tǒng)分類信息，采集渤海灣7種蝦虎魚樣本，通過形態(tài)初步鑒定物種，并提取DNA進(jìn)行線粒體COI基因部分序列擴(kuò)增測序，用系統(tǒng)進(jìn)化分析及分子鑒定軟件MEGA對渤海灣常見12種蝦虎魚COI基因部分片斷進(jìn)行序列特征分析及分子分類分析。擴(kuò)增得到7種蝦虎魚COI基因片斷，分析得到其平均GC含量低于AT含量，堿基在密碼子位置分布中具有偏向性，且GC含量最高為第2位堿基，與多種魚類COI基因堿基特點(diǎn)相似。基因密碼子堿基變異率為19.4%，轉(zhuǎn)換顛換比為1.3。遺傳距離分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析理清了渤海灣天津海域12種主要蝦虎魚的系統(tǒng)分類及進(jìn)化關(guān)系。遺傳距離顯示，矛尾刺蝦虎魚（Amblychaeturichthys hexanema）和斑尾復(fù)蝦虎魚（Synechogobius ommaturus）為同種魚。蝦虎魚COI編碼基因密碼子高變異率可能與其良好的環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：渤海灣蝦虎魚；線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基（COI）；系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號：Q917.4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.09.006

Sequence and Molecular Classification of COI Gene of Seven Species of Goby from the Bohai Bay

FANG Enjun，GUO Biao，ZHENG Debin，ZHANG Xue，WANG Shuo，WANG Yu

（Tianjin Fisheries Research Institute，? Center for Marine Ranching Engineering Science Research of Tianjin，Tianjin 300221， China）

Abstract： In order to clarify the mitochondrial barcode sequence and taxonomic information of common goby fish in Tianjin area of Bohai Bay， seven species of goby fish were collected from Bohai Bay， identified by morphology， and DNA was extracted for amplification and sequencing of mitochondrial COI gene fragments. Phylogenetic analysis and molecular identification software MEGA were used to analyze the sequence characteristics and molecular classification of COI gene fragments of 12 common goby species in Bohai Bay. Seven COI gene fragments of Goby were amplified and sequenced， the average GC content was lower than AT content， the base had a bias in the codon position distribution， and the highest GC content was the second base， which was similar to the COI gene base of many fishes. The codon base variation rate was 19.4%， and the ratio of transitions to transversions was 1.3. Phylogenetic distance analysis and phylogenetic tree analysis clarified the phylotaxonomic and evolutionary relationships of 12 major goby species in Tianjin area of Bohai Bay. Genetic distance indicated that Amblychaeturichthys hexanema and Synechogobius ommaturus were the same species. The high codon variation rate of codon encoding gene in Goby may be related to its good environmental adaptability.

Key words： Goby of the Bohai Bay; cytochrome oxidase subunit I （COI） gene; phylogenetic analysis

渤海灣是一個(gè)淺水淤泥質(zhì)半封閉海灣，歷史上餌料豐富，基礎(chǔ)條件優(yōu)越，是渤海魚類的產(chǎn)卵場。近年來，由于圍填海工程、水域污染和過度捕撈等因素的影響，漁業(yè)資源的生存環(huán)境惡化，影響了其生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能，漁業(yè)資源衰退，小型化、低值化問題突出，種類和數(shù)量也在減少。年度調(diào)查表明，天津海域產(chǎn)卵場逐漸退化，與歷史調(diào)查數(shù)據(jù)相比，渤海灣魚類浮游生物的豐度和多樣性顯著減少，經(jīng)濟(jì)魚類漁獲和產(chǎn)卵量也逐漸減少[1-2]。而蝦虎魚由于環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，繁殖力強(qiáng)和生命周期短等特點(diǎn)[3]，其資源量穩(wěn)定增加，已逐漸代替其他經(jīng)濟(jì)魚類，成為渤海灣天津海域春季休漁期前魚類群落及仔稚魚的優(yōu)勢種，在海洋食物網(wǎng)中發(fā)揮著重要的作用。但是蝦虎魚種類繁多，且有關(guān)仔稚魚的形態(tài)相近，相關(guān)資料較少，鑒定難度大，準(zhǔn)確性難以保證，蝦虎魚仔稚魚鑒定也是世界難點(diǎn)和是魚類早期資源研究的重要內(nèi)容。

20世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)外科學(xué)家發(fā)現(xiàn)線粒體一些短的基因（如細(xì)胞色素氧化酶第一亞基（COI）基因、12s rRNA、細(xì)胞色素B（Cty B）等）進(jìn)化速率快且相對保守，其中COI基因5'端650 bp片斷可有效區(qū)分種間物種，可作為物種分類的DNA條形碼（DNA Barcoding），隨后與之配套的數(shù)據(jù)庫也日趨完善，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、法醫(yī)學(xué)、食品質(zhì)量控制等領(lǐng)域，也為魚類浮游生物種類的分子鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)[4-9]。

蝦虎魚亞目（Gobioidei）有兩千余種蝦虎魚，腹鰭合成一個(gè)吸盤，是鱸形目中最大的一個(gè)類群。蝦虎魚多為小型底棲魚類，主要以小型底棲甲殼動物為食，在渤海灣生態(tài)系統(tǒng)中能量流動和物質(zhì)循環(huán)中有重要作用，是底層食物鏈的關(guān)鍵物種[10]。根據(jù)渤海魚類生物學(xué)記載， 渤海灣天津海域歷史上能采集到的蝦虎魚有12種左右[11]，其中拉氏狼牙蝦虎魚（Odontamblyopus rubicundus）、斑尾腹蝦虎魚（Synechogobius ommaturus）具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。除了小頭櫛孔蝦虎魚。常見的蝦虎魚的線粒體（COI）基因片斷均能在數(shù)據(jù)庫中獲取。但是蝦虎魚形態(tài)多變、各地名稱不統(tǒng)一等原因，需要通過擴(kuò)增進(jìn)一步明確序列信息。本研究選擇渤海灣常見7種蝦虎魚類作為研究對象，通過獲取線粒體（COI）基因序列分析比較其序列變異情況，進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及遺傳分析，從而為魚類DNA條形碼庫及魚類浮游生物的鑒定積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為渤海海洋食物網(wǎng)的研究和穩(wěn)定，為渤海灣蝦虎魚資源保護(hù)和合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品來源于2018年春季和夏季渤海灣水域地籠或拖網(wǎng)采樣，參照《渤海魚類生物學(xué)》共鑒定出矛尾刺蝦虎魚（Amblychaeturichthys hexanema）、裸頸縞蝦虎魚（Tridentiger Nudicervicus）、矛尾蝦虎魚（Chaeturichthys stigmatias）、紅狼牙蝦虎魚（Odontamblyopus rubicundus）、彈涂魚（Periophthalmus modestus）、鐘馗蝦虎魚（Triaenopogon barbatus）、小頭櫛孔蝦虎魚（Ctenotrypauchen microcephalus）7種7個(gè)蝦虎魚[11]。樣本用95%的乙醇混合保存后取魚鰭。

1.2 DNA提取

采用酚-氯仿法提取DNA，取魚尾鰭0.5 g放入1.5 mL的離心管中，將魚鰭剪碎后加入裂解液和蛋白酶渦旋混勻，離心后于56 ℃消化3 h，酚-氯仿抽提后2倍無水乙醇沉淀，75%乙醇洗滌吹干后以ddH2O溶解，4 ℃冰箱保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

在上海生工合成Ward[12]文獻(xiàn)中魚類COI通用引物：FishF1（5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGG

CAC-3'），? FishR1（5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAG

AATCA-3'）。

組建一個(gè)25 μL PCR反應(yīng)體系：

模板DNA? ? ? ?2.0 μ ddHO? ? ? ? ? ? 6.5 μlPremix Taq? ? ? 12.5 μL引物? ? ? ? ? ? ? ? 各2.0 μL

PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?/p>

95 ℃? ? ? ? ?2 min

95 ℃變性40 s92 ℃退火1 min72 ℃延伸1 min? ? ? ? ? ?35個(gè)循環(huán)

72 ℃延伸5 min

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳15～20 min，凝膠電泳成像儀檢測后送至上海歐易生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物為擴(kuò)增引物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

從BOLD數(shù)據(jù)庫中獲取鱸形目的石首魚科黃姑魚（Nibea albiflora）、馬鲅科的四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）、鰈形目的舌鰨科短吻紅舌鰨（Cynoglossus joyneri）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）共4種魚類的同源序列作為外群，同時(shí)從NCBI和BOLD數(shù)據(jù)庫下載天津可能存在的蝦虎魚序列，結(jié)合測序序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（表1）。對所獲得的序列利用MEGA進(jìn)行多序列比對，人工核查后，用“Statistics”程序計(jì)算序列堿基組成、遺傳顛換值、變異位點(diǎn)、密碼子偏向性等。不同個(gè)體間的遺傳距離用“Distance”程序下的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算。用Modeltest檢測出最適合的核苷酸序列分析模型后采用鄰位連接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹Bootstrap置信值重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 渤海灣7種蝦虎魚的COI基因序列特征

將擴(kuò)增測序得到的COI序列進(jìn)行blast比對，相似度大于98%的即為同一種，比對結(jié)果支持形態(tài)鑒定結(jié)果。多序列比對得到652 bp共有序列，證實(shí)COI可以用作物種鑒定條形碼[8]。

堿基特征分析得到7種蝦虎魚的COI基因部分序列符合硬骨魚類G+C含量（44.6%）小于A+T含量（55.4%）的特點(diǎn)[14]。密碼子的堿基使用頻率存在一定的偏向性，平均GC含量最高為第2位堿基（55.50%），4種堿基在第1、2、3位密碼子分布含量都不平均。本研究中COI基因密碼子變異情況表明，共有不變位點(diǎn)（522個(gè)）多于變異位點(diǎn)（126個(gè)），轉(zhuǎn)換位點(diǎn)（71個(gè)）多于顛換位點(diǎn)（55個(gè)），轉(zhuǎn)換與顛換比為1.3，其中第1位堿基變異位點(diǎn)最多，第3位最少。

2.2 蝦虎魚科12種魚類的種間遺傳距離

12種蝦虎魚的種間遺傳距離平均值為0.21。矛尾刺蝦虎魚和斑尾復(fù)蝦虎魚的種間遺傳距離最小（0.014），小于0.02的臨界值[13]，應(yīng)為同種蝦虎魚，斑尾復(fù)蝦虎魚和紋縞蝦虎魚種間遺傳距離最大（0.435）。

2.3 蝦虎魚科魚類的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹

系統(tǒng)樹顯示，7種蝦虎魚中，紅狼牙蝦虎魚與矛尾刺蝦虎魚距離較遠(yuǎn)，小頭櫛孔蝦虎魚和彈涂魚聚為一支，矛尾刺蝦虎魚和斑尾復(fù)蝦虎魚聚為一支，紋縞蝦虎魚和暗縞蝦虎魚遺傳距離較近。

3 討論與結(jié)論

3.1 7種渤海灣蝦虎魚類的COI基因序列特點(diǎn)

COI基因部分序列第2位堿基的GC含量最高，與石首魚科COI基因堿基特征一致[5]，與于亞男長江口蝦虎魚科魚類COI基因堿基特征不一致等[15]。第3位堿基的GC含量比較恒定，而第1位堿基則因種類不同而呈現(xiàn)含量差異，第1位堿基能否作為不同種類區(qū)分的特征也需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量做深入的研究。本研究中7種蝦虎魚的密碼子堿基使用存在一定偏向性，但與李明暉等[16]研究結(jié)果不一致。由于其與基因長度、堿基組分、翻譯起始效應(yīng)、基因的表達(dá)水平等多種因素有關(guān)[16-17]，需要系統(tǒng)地對蝦虎魚亞目不同地理群體的該基因密碼子堿基使用情況進(jìn)行分析再下結(jié)論，或者精確到不同科屬的具體情況來進(jìn)行探討。7種蝦虎魚的COI基因顛換大于轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換/顛換值（R）值為1.3小于2，且第1位堿基承擔(dān)著主要選擇壓力，表明蝦虎魚可能通過高度基因突變實(shí)現(xiàn)快速進(jìn)化，從而增強(qiáng)其抗逆性和適應(yīng)性[9，18]。

3.2 COI基因在渤海灣天津海域蝦虎魚科魚類分類中的應(yīng)用

蝦虎魚的COI基因的種間和種內(nèi)遺傳距離相差20倍以上，可作為天津海域蝦虎魚科魚類分子分類的條形碼和仔稚魚分子鑒定的依據(jù)[13]。

在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，12種蝦虎魚節(jié)點(diǎn)支持率較高，除了刺蝦虎魚屬、晴尾蝌蚪蝦虎魚與其他蝦虎魚遺傳距離較遠(yuǎn)，其他蝦虎魚均聚為一大類。于亞男等[14]研究成果也出現(xiàn)了有的蝦虎魚先與外群聚在一起，之后再與其他蝦虎魚相聚的現(xiàn)象。該基因條形碼可以很好地區(qū)分不同種，但對于不同科或更大的分類界元的效果不太明顯。由于有的蝦虎魚比較稀有、難以采集，本研究采集樣品有限，需要加大樣本量進(jìn)一步優(yōu)化進(jìn)化樹。形態(tài)學(xué)上，孔蝦虎魚和拉氏狼牙蝦虎魚具有相似的體型、體色、眼睛高度退化等特點(diǎn)，有些科學(xué)家將它們歸為近盲蝦虎魚亞科，這與進(jìn)化樹分類結(jié)果比較一致。但是它們遺傳距離大于0.2，確定是不同的種。本研究中，背眼蝦虎魚科的彈涂魚與近盲蝦虎魚亞科的小頭櫛孔蝦虎魚聚為一支，相關(guān)研究也證實(shí)他們親緣關(guān)系較近，具體還需加大樣本進(jìn)行確認(rèn)。

本研究得出，矛尾刺蝦虎魚和斑尾復(fù)蝦虎魚為同一物種，種間遺傳距離僅為0.014，小于 Hebert等[13]提出的臨界值0.020；進(jìn)化樹上，節(jié)點(diǎn)支持率達(dá)到100%聚為一支。

縞蝦虎魚是蝦虎魚科的一個(gè)屬，渤海常見的有鐘馗蝦虎魚（髭縞蝦虎魚）、紋縞蝦虎魚、裸頸縞蝦虎魚等。本研究中所有的縞蝦虎魚遺傳距離較近，與已知分類結(jié)果一致。晴尾蝌蚪蝦虎魚由于頭部形態(tài)特征與其他蝦虎魚相差較大，從形態(tài)上很好區(qū)分，與其他蝦虎魚科屬遺傳距離較遠(yuǎn)。

由于蝦虎魚種類眾多，變異較大，其鑒定除了分子鑒定還需結(jié)合形態(tài)學(xué)和生態(tài)地理分布等因素，也可以結(jié)合其他條形碼基因綜合分析其進(jìn)化、地理分布及系統(tǒng)分類等。

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