荊條種子無菌萌發(fā)過程中污染菌的分離鑒定及抑菌劑篩選

李宇霞 王霞 張敏 邱悅 張?jiān)? 梁慧 梁麗琴 陳惠

摘要：荊條具有生態(tài)、觀賞、藥用及實(shí)用等方面的價(jià)值，但在荊條快速繁殖體系的建立中發(fā)現(xiàn)，種子在無菌萌發(fā)過程中污染率極高，達(dá)50%～75%。為降低荊條種子無菌萌發(fā)過程中的污染率，試驗(yàn)通過鑒定其主要污染菌株，篩選出有效抑菌劑，并利用組織分離法對(duì)污染菌進(jìn)行分離和純化；同時(shí)，通過光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)污染菌的分生孢子進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，然后采用真菌rDNA 基因的ITS 序列通用引物進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，最后選擇百菌清、代森錳鋅、多菌靈、氟嗎錳鋅4 種殺菌劑添加到PDA 培養(yǎng)基中進(jìn)行抑菌效果分析。結(jié)果表明，主要污染菌為種子表面附著的真菌，菌落呈絨狀黃綠色同心圓形，菌絲為有隔褐色分支狀菌，分生孢子為橄欖棕色、有隔、梭型；細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)鑒定表明，該污染菌為鏈格孢菌。抑菌研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60% 氟嗎錳鋅對(duì)鏈鉻孢菌的抑制效果最佳，菌落直徑最小。將60% 氟嗎錳鋅稀釋1 400 倍添加到荊條種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基（水瓊脂培養(yǎng)基）中，污染率明顯下降到5.5%。荊條種子無菌萌發(fā)中主要污染菌為鏈格孢菌，60% 氟嗎錳鋅對(duì)其抑制效果最佳。

關(guān)鍵詞：荊條種子；無菌萌發(fā)；污染真菌；鏈格孢菌；氟嗎錳鋅

中圖分類號(hào)：S793.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002?2481（2023）03?0249?08

荊條（Vitex negundo L. var. heterophylla（Franch.）Rehd）為馬鞭草科牡荊亞科的落葉灌木或小喬木，是黃荊的一個(gè)變種。荊條在我國(guó)分布較廣，從北到南的13 個(gè)省份均有分布，如遼寧、甘肅、山西、安徽、貴州等；日本也有分布[1]。荊條常生長(zhǎng)于山坡路旁，植株比較抗旱、耐寒，在惡劣的環(huán)境下也能生長(zhǎng)。由于荊條的根能夠分泌出將堅(jiān)固的巖石腐蝕分解成土壤的一種植物酸，因此，可作為水土保持的優(yōu)勢(shì)樹種，在山西可作為廢棄煤礦礦區(qū)植被恢復(fù)的優(yōu)選樹種，具有一定的生態(tài)價(jià)值。荊條還可以制作盆景，荊條的幼枝被用來編籃筐，枝葉用來驅(qū)蚊。

荊條花芳香味濃，是優(yōu)良的蜜源植物，荊條蜜含有益菌、活性酶、有機(jī)酸等，具有潤(rùn)腸通便、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)助消化等功能。荊條是重要的中草藥，其根、莖、葉、果實(shí)均可入藥，鮮葉治療風(fēng)寒感冒、急性胃腸炎等。其提取物在消炎[2]、鎮(zhèn)痛[3]、治療關(guān)節(jié)炎[4]、癌癥[5]以及婦科疾病[6]等方面有療效；還可用作抗氧化劑[7]、抗真菌劑[8]、驅(qū)蟲劑[9]，并具有抗病毒等作用[10]，基于荊條廣泛的生物學(xué)作用，研究人員對(duì)荊條的研究越來越廣泛和深入。

目前，荊條主要依靠播種和移苗繁殖。對(duì)于荊條種子的萌發(fā)研究，大都采用種子浸種萌發(fā)法[11-13]。

關(guān)于荊條的組織培養(yǎng)研究，國(guó)內(nèi)外尚屬空白。由于落葉灌木自然繁殖率低，眾多研究者關(guān)注于其種子萌發(fā)的研究，如郭麗等[14]研究了不同消毒程序?qū)σ吧∑つ痉N子萌發(fā)的影響。關(guān)于荊條種子的無菌萌發(fā)還未見報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)，荊條種子經(jīng)常規(guī)消毒后，極易受到一種黃綠色真菌的污染，且污染率很高，致使荊條組織培養(yǎng)嚴(yán)重受阻。要進(jìn)行荊條的組織培養(yǎng)，第一步是無菌材料的建立，而荊條種子試管中無菌萌發(fā)是獲得無菌材料的有效途徑。

本研究首先比較了不同消毒程序的消毒效果，并對(duì)該污染真菌進(jìn)行分離、純化與細(xì)胞學(xué)觀察及分子生物鑒定，以確定污染菌的種類，并將百菌清、代森錳鋅、多菌靈、氟嗎錳鋅等抑菌劑添加到PDA 平板上觀察它們對(duì)污染真菌的抑制效果，最后挑選最佳的抑菌劑加進(jìn)荊條種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，觀察其抑菌效果，旨在為荊條快速繁殖體系的建立打下良好的基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

荊條種子于2017 年9、12 月采摘自山西省臨汾市堯都區(qū)野生荊條樹上。將種子在簸萁中反復(fù)揉搓，簸去宿存的花萼等雜物后，裝入塑料瓶，于4 ℃存儲(chǔ)。荊條種子千粒質(zhì)量為5.845 0 g，種子長(zhǎng)徑與短徑分別為3.000、2.563 mm。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

真菌培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，無菌種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS（Murashige and skoog）培養(yǎng)基（無糖，瓊脂8 g/L，pH 值5.8）。

真菌菌絲DNA 提取試劑為CTAB 改良液[15]；供試藥劑為75% 百菌清可濕性粉劑（利民化工股份有限公司）、80% 多菌靈可濕性粉劑（江蘇速達(dá)農(nóng)化科技有限公司）、80% 代森錳鋅可濕性粉劑（北京中衛(wèi)生物科技有限公司）、60% 氟嗎錳鋅可濕性粉劑（德國(guó)拜客（西安）作物保護(hù)股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 荊條種子3 種消毒程序消毒效果的比較 將去皮去雜后的荊條種子分別用3 種程序進(jìn)行消毒處理。

70% 乙醇消毒5 min→0.1% 升汞（吐溫-20，4～5 滴/L）消毒10 min→ 無菌水沖洗3～5 次；0.25%（m/V）洗衣粉（奇強(qiáng)牌無磷洗衣粉）水浸泡5 min→自來水沖洗7 min →70% 乙醇消毒5 min→0.1% 升汞（吐溫-20，4～5 滴/L）消毒10 min→無菌水沖洗3～5 次；0.25%（m/V）洗衣粉水浸泡5 min→自來水沖洗7 min→70% 乙醇消毒5 min→10% 的次氯酸鈉分別消毒10、20、30 min→無菌水沖洗3～5 次。

1.3.2 荊條種子附著菌的分離培養(yǎng)與光學(xué)顯微鏡觀察 將消毒處理后的荊條種子接種于含MS 培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中培養(yǎng)，每瓶接種15 粒，3 個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)條件：25 ℃，光周期12 h/12 h（光照/黑暗）。7～10 d 后培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃綠色的菌落，用接種針挑取邊緣菌絲于PDA 培養(yǎng)基中，進(jìn)行純化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。7 d 時(shí)觀察菌落、菌絲及孢子的形態(tài)、大小、顏色，并攝片（光學(xué)顯微鏡OLYMPUSB5X1型）。

1.3.3 荊條種子附著菌的分子生物學(xué)鑒定與進(jìn)化發(fā)育樹的構(gòu)建1.3.3.1 菌絲DNA 的提取 在超凈工作臺(tái)中，用無菌接種針刮取約300 mg 菌絲，置于1.5 mL 無菌EP 管中，將EP 管放置在冰上，菌絲材料用塑料研磨杵快速搗碎至勻漿。采取改良的CTAB 法提取真菌基因組DNA[15]。

1.3.3.2 PCR 擴(kuò)增 采用真菌rDNA 基因ITS（InternalTranscribed Spacer）序列的通用引物ITS1（5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）? 和ITS2（5?-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3?）（北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：Taq DNA polymerase0.5 μL（合肥博美生物科技有限公司）；10×PCRbuffer 2.5 μL；dNTP mix（2.5 mmol/L） 2.0 μL（天根生物科技有限公司）；ITS1（10 μmol/L）與ITS2（10 μmol/L）各1 μL；DNA 模板1～10 ng，補(bǔ)充ddH2O 至25 μL。

PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，54 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，30 次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.3.3 測(cè)序及序列比對(duì)與分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將有目標(biāo)條帶的PCR 產(chǎn)物純化，送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序后的序列經(jīng)過人工校正后在NCBI 網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST 比對(duì)，尋找與其同源序列相似度達(dá)99% 的已知真菌的相關(guān)序列12 條，以鑒定污染真菌的分類地位。利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，然后采用最大簡(jiǎn)約法（Maximumparsimony，MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以自檢法（bootstrap）進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán)2 000 次，對(duì)污染荊條種子無菌萌發(fā)的真菌進(jìn)行鑒定。

1.3.4 種子表面附著菌的洗脫液與干種子掃描電鏡的觀察 將荊條種子約150 粒放入20 mL 蒸餾水中，加入1 滴吐溫-20，攪拌后，取1 滴溶液滴在干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡檢。同時(shí)，將干種子噴金后在掃描電鏡（JSM-7500F 型日本電子株式會(huì)社（JEOL））下觀察。

1.3.5 抑菌劑對(duì)鏈鉻孢菌抑制效應(yīng)的比較 將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200 g 馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，用2 層紗布過濾，加熱，加15 g 瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入20 g 蔗糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌20 min。將抑菌劑加入培養(yǎng)基中使其最終稀釋倍數(shù)分別為：80% 代森錳鋅700、800、900 倍；75%百菌清600、700、800 倍；80% 多菌靈800、1 200、1 600 倍；60% 氟嗎錳鋅1 200、1 400、1 600 倍，然后倒平板，待其冷卻后挑取單一菌落邊緣菌絲少許接菌，25～28 ℃培養(yǎng)7 d 后觀察，利用十字交叉法測(cè)定菌落直徑大小，求出各抑菌劑同一濃度下的菌落直徑的平均值，并將抑菌劑處理的平均菌落直徑和空白對(duì)照組對(duì)比，計(jì)算4 種抑菌劑的系列濃度對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)抑制率即抑菌率。

抑菌率=（（對(duì)照菌落直徑-原菌絲塊直徑）-（處理菌落直徑- 原菌絲塊直徑））/（對(duì)照菌落直徑-原菌絲塊直徑）×100% （1）

1.3.6 培養(yǎng)基中添加抑菌劑對(duì)荊條種子污染率的影響 采用第3 種消毒程序消毒后將種子接種于含稀釋1 400 倍和1 600 倍的氟嗎錳鋅于1/2 MS 無糖培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基上，置于（25±2）℃溫室，光周期為12 h/12 h（光照/黑暗），相對(duì)濕度為60%的條件下培養(yǎng)，每瓶接種4 粒，5 個(gè)重復(fù)，7～8 d 后觀察生長(zhǎng)情況，計(jì)算污染率和種子萌發(fā)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2結(jié)果與分析

2.1 荊條種子最佳消毒方法的選擇

為了確保荊條種子的無菌培養(yǎng)，采用3 種消毒程序?qū)ηG條種子（圖1-A）進(jìn)行消毒處理，并接種到MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果顯示（表1），10% 次氯酸鈉消毒劑處理程序3 隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)（10～30 min），污染率由75.00% 下降到了58.69%，但不如相應(yīng)地0.1% 升汞處理程序2；在0.1% 升汞消毒之前增加洗衣粉漂洗程序，可以顯著降低污染率，洗衣粉漂洗后水呈現(xiàn)黃綠色（圖2），說明種子表面的真菌孢子被洗脫了下來?？傊?，第2 種消毒程序最佳。

采用第1 種消毒程序?qū)ηG條種子消毒處理后，將種子接種培養(yǎng)7 d 后，發(fā)現(xiàn)錐形瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)出多個(gè)黃綠色菌落，菌落之間重疊嚴(yán)重，但采用第2 種消毒程序后，菌落數(shù)明顯減少，一個(gè)錐形瓶只長(zhǎng)出2～3 個(gè)污染菌的菌落，且該菌落也呈黃綠色，質(zhì)地均勻絨狀（圖1-B）。

2.2 荊條種子無菌萌發(fā)過程中污染真菌的進(jìn)一步分離純化培養(yǎng)與細(xì)胞學(xué)觀察

荊條種子表面真菌菌落、菌絲及分生孢子如圖3 所示。

挑取2.1 中圖1-B 荊條種子表面長(zhǎng)出的黃綠色真菌菌落邊緣的菌絲，經(jīng)PDA 平板純化培養(yǎng)，10 d后菌落直徑長(zhǎng)到6.3 cm×6.1 cm，菌落正面的顏色仍為黃綠色（圖3-A），反面為黑灰色（圖3-B）。菌落邊緣平整，質(zhì)地絨狀。該菌的菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察為有隔菌絲，褐色，菌絲直徑為7～8 μm（圖3-C），分生孢子呈橄欖棕色，有隔梭型，大小為35～40 μm×15～20 μm（圖3-D）。

2.3 荊條種子附著菌的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 荊條種子附著菌DNA 的PCR 擴(kuò)增 利用通用引物ITS1 和ITS2 序列擴(kuò)增污染真菌rDNAITS 序列，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像結(jié)果顯示，菌株ITS 序列的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)約650 bp，條帶清晰（圖4）。

2.3.2 菌株ITS 的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將2.3.1 中PCR 產(chǎn)物送至北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，序列利用DNAMAN 軟件進(jìn)行人工校正比對(duì)后，遞交NCBI 網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/），登錄號(hào)為MK229186，經(jīng)BLAST 序列比對(duì)，選取相似度為99% 的序列12 條，并以同科即孢腔菌科（Pleosporaceae）不同屬的枯葉格孢腔菌（Pleospora herbarum）作為外群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明（圖5），本試驗(yàn)菌MK229186 與Alternaria alternata 最鄰近，從而確定荊條種子無菌萌發(fā)過程中污染的真菌為半知菌綱鏈格孢屬的鏈格孢菌（Alternaria alternata）。

2.4 荊條種子洗脫液及干種子掃描電鏡觀察

在光學(xué)顯微鏡下，觀察荊條種子吐溫-20 洗脫液，發(fā)現(xiàn)每滴洗脫液中有若干個(gè)手雷狀的分生孢子，其形態(tài)與分離純化的污染菌的分生孢子（圖3-D）一致。掃描電鏡下觀察到干種子表面有梭形的分生孢子和分支狀的菌絲（圖6），再此證明鏈格孢菌確實(shí)是荊條種子表面的附著菌。

2.5 4 種抑菌劑對(duì)鏈鉻孢菌的毒力測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用Excel 軟件，將抑菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成以10 為底的對(duì)數(shù)x，查抑菌率與概率值換算表，將抑菌率轉(zhuǎn)換為抑菌概率值y。根據(jù)抑菌劑質(zhì)量濃度x和抑菌概率值y，應(yīng)用SPSS 軟件，分析得出4 種抑菌劑的毒力回歸方程y＝ax+b，以及相關(guān)系數(shù)和抑菌劑有效抑制中濃度（EC50）[16]，結(jié)果如表2 所示。

由表2 可知，4 種抑菌劑對(duì)荊條種子宿生菌鏈格孢菌的生長(zhǎng)都具有一定的抑制作用，但抑菌效果有較明顯的差異，藥效各不相同。4 種抑菌劑的毒力效果具有明顯差異，由強(qiáng)到弱排序依次為60%氟嗎錳鋅>80% 多菌靈>80% 代森錳鋅>75% 百菌清，因此，初步篩選60% 氟嗎錳鋅為有效防控荊條種子宿生菌鏈格孢菌污染的最佳藥劑。

2.6 培養(yǎng)基中添加抑菌劑對(duì)荊條種子污染率及萌發(fā)率的影響

為了進(jìn)一步降低荊條種子萌發(fā)過程中的污染率和提高萌發(fā)率，試驗(yàn)將水引發(fā)2 d 回干1 d 的荊條種子經(jīng)最佳消毒程序消毒后分別接種于含有稀釋1 600 倍和1 400 倍氟嗎錳鋅的1/2 MS 無糖培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基中，溫度為（25±2）℃ ，光周期12 h/12 h 下培養(yǎng)，7 d 后統(tǒng)計(jì)污染率以及萌發(fā)率，結(jié)果如圖7 所示。由圖7 和表3 可知，對(duì)照組污染嚴(yán)重，培養(yǎng)基上種子周圍有發(fā)黑的菌落，水瓊脂培養(yǎng)基菌落顏色比1/2 MS 無糖培養(yǎng)基上的淺，污染率也低，添加氟嗎錳鋅的2 種培養(yǎng)基不僅表現(xiàn)為污染率顯著降低，而且觀察到種子萌發(fā)。表明添加氟嗎錳鋅不僅可以顯著降低污染率，而且顯著促進(jìn)種子萌發(fā)，其中，添加60% 氟嗎錳鋅可濕性粉劑稀釋1 400 倍在水瓊脂培養(yǎng)基上的種子污染率能降低到5.5%。

3結(jié)論與討論

3.1 洗衣粉水浸泡對(duì)荊條種子無菌萌發(fā)的影響

為了在試管中進(jìn)行荊條種子的無菌萌發(fā)獲得無菌苗，本研究采用了3 種外植體消毒程序，結(jié)果表明，第2 種消毒程序效果最佳，關(guān)鍵步驟是荊條種子消毒前先用0.25% 洗衣粉水浸泡5 min，然后流水沖洗7 min，接著用70% 乙醇浸泡5 min，0.1%升汞（吐溫-20，4～5 滴/L）浸泡10 min，無菌水沖洗3～5 次進(jìn)行消毒。結(jié)果表明，真菌污染率由75.57%下降到了47.14%。其原因可能是由于增加了0.25%洗衣粉水浸泡時(shí)間和流水沖洗的時(shí)間，洗衣粉中的去污劑有效成分SDS，能將包裹在荊條種子表面的霉菌孢子清除一大部分，有效降低培養(yǎng)過程中的真菌污染率。延長(zhǎng)洗衣粉水處理時(shí)間可能效果會(huì)更佳，還有待進(jìn)一步改進(jìn)。此外，在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，污染率與取材的時(shí)間和地點(diǎn)也有一定關(guān)系，如12 月取材比9 月采集的污染率高，這可能是荊條種子在樹上多掛2～3 個(gè)月，期間雨淋次數(shù)增加，導(dǎo)致真菌孢子載量增加。此外，從山坳處生長(zhǎng)的荊條樹上采集的種子比開闊地帶生長(zhǎng)的荊條樹上采集的種子污染率高，可能是由于山坳處的潮濕環(huán)境有利于霉菌的繁殖使荊條種子表面載有的真菌孢子量大的緣故。

3.2 鏈格孢菌對(duì)荊條種子無菌萌發(fā)及其他植物的影響

為了探明引起荊條種子無菌萌發(fā)污染的真菌種類，本研究挑取了荊條種子周圍的黃綠色真菌菌絲對(duì)其進(jìn)行了分離純化培養(yǎng)，并提取其菌絲DNA，采用真菌rDNA 序列及ITS 序列的特異引物ITS1與ITS2，對(duì)其進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)公司測(cè)序后，在NCBI 網(wǎng)站經(jīng)同源序列比對(duì)并構(gòu)建了該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定和光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，確定了荊條種子表面附著菌為鏈格孢菌。同時(shí)，本研究將荊條種子用吐溫-20 洗脫液置于光學(xué)顯微鏡下觀察，以及掃描電鏡下對(duì)干種子表面進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，引起荊條種子無菌萌發(fā)極難去除的污染菌為鏈格孢菌。

鏈格孢菌通常是植物常見的致病菌，可引起多種農(nóng)作物產(chǎn)生輪斑病、黑斑病、褐斑病等[17-20]。在組織培養(yǎng)過程中常見的污染菌分為2 類，一類為細(xì)菌，主要為芽孢桿菌屬和假單胞菌屬；另一類為真菌，有芽枝霉（Cladosporium spp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillum spp）和酵母等[21]。荊條種子無菌萌發(fā)中發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌在其他物種組培污染菌中還鮮有報(bào)道。

3.3 60% 氟嗎錳鋅對(duì)鏈格孢菌的抑制作用

為了進(jìn)一步控制荊條種子無菌萌發(fā)過程中的污染，本研究進(jìn)行了平板抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，60%氟嗎錳鋅、75% 百菌清、80% 多菌靈、80% 代森錳鋅分別稀釋不同的倍數(shù)，對(duì)鏈格孢菌菌絲均有抑制效果，最高抑菌率分別為100%、82.88%、82.19%和47.95%。4 種抑菌劑中75% 百菌清抑菌效果最差，抑菌率在41.10%～47.95%；高樹廣等[22]測(cè)定了5 種殺菌劑對(duì)芝麻鏈格孢菌的抑制效果，張曉翔等[23]測(cè)定了8 種殺菌劑對(duì)牡丹花鏈格孢菌的毒力，結(jié)果均表明，百菌清對(duì)鏈格孢菌的抑制效果最差，與本研究所得結(jié)果相一致。75% 多菌靈較好，抑菌率在58.90%～82.88%，80% 代森錳鋅抑菌率在60.96%～82.19%，抑菌效果較好。且75% 多菌靈和80% 代森錳鋅的EC50大于80% 多菌靈的致死中濃度EC50，毒力較強(qiáng)，但藺經(jīng)等[24]、王春明等[25]的研究結(jié)果表明，鏈格孢菌對(duì)多菌靈的敏感性更低，與本研究結(jié)果相反，推測(cè)可能是因?yàn)殒湼矜呔纳硇》N之間寄主不同，藥劑的生產(chǎn)公司不同，測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)差異。氟嗎錳鋅可濕性粉劑是氟嗎啉與代森錳鋅的復(fù)合制劑。已有研究表明，氟嗎錳鋅對(duì)葡萄、馬鈴薯和番茄上的卵菌綱，尤其是霜霉科和疫霉屬菌有殺菌效力。水瓊脂培養(yǎng)基上的荊條種子周圍污染菌落顏色比1/2 MS 培養(yǎng)基上的菌落顏色淺，可能是1/2 MS 培養(yǎng)基中的無機(jī)營(yíng)養(yǎng)有利于真菌的菌絲生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，60% 氟嗎錳鋅稀釋1 400～1 600 倍對(duì)鏈鉻孢菌的抑菌率為100%，且有利于荊條種子的試管萌發(fā)獲得無菌苗。

綜上所述，在分離、純化荊條種子污染菌的基礎(chǔ)上，經(jīng)細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)鑒定污染菌為鏈格孢屬的一種真菌，通過抑菌試驗(yàn)篩選出最佳抑菌劑為培養(yǎng)基中添加60% 氟嗎錳鋅稀釋倍數(shù)為1 400～1 600 倍，可有效降低荊條種子的污染率，并獲得無菌試管苗，為荊條的無性快速繁殖體系的建立打下良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志：第四十二

卷，第一分冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1993：145-146.

Editorial Committee of Chinese Flora，Chinese Academy of Sciences.

Flora of China[M]. Beijing：Science Press，1993：145-146.

［2］ XU J M，HU B C，YUAN L，et al. Labdanes and megastigmanes

from Vitex negundo var. heterophylla[J]. Fitoterapia，

2019，137：104265.

［3］ DHARMASIRI M G，JAYAKODY J C，GALHENA G，et al.

Anti-inflammatory and analgesic activities of mature fresh leaves

of Vitex negundo[J]. Journal of Ethnopharmacology，2003，87

（2/3）：199-206.

［4］ JING R，BAN Y，XU W，et al. Therapeutic effects of the total

lignans from Vitex negundo seeds on collagen-induced arthritis

in rats[J]. Phytomedicine，2019，58：152825.

［5］ AWALE S，LINN T Z，LI F，et al. Identification of chrysoplenetin

from Vitex negundo as a potential cytotoxic agent against

PANC-1 and a panel of 39 human cancer cell lines（JFCR-39）

[J]. Phytotherapy Research，2011，25（12）：1770-1775.

［6］ VISHWANATHAN A S，BASAVARAJU R. A review on Vi?

tex negundo L.：a medicinally important plant[J]. Environmental

Science，2010，3（1）：30-42.

［7］ KULKARNI R R，VIRKAR A D，D?MELLO P. Antioxidant

and antiinflammatory activity of Vitex negundo[J]. Indian Journal

of Pharmaceutical Sciences，2008，70（6）：838-840.

［8］ SATHIAMOORTHY B，GUPTA P，KUMAR M，et al. New

antifungal flavonoid glycoside from Vitex negundo[J]. Bioorganic

& Medicinal Chemistry Letters，2007，17（1）：239-242.

［9］ KARUNAMOORTHI K，RAMANUJAM S，RATHINASAM

Y R. Evaluation of leaf extracts of Vitex negundo L.（Family：

Verbenaceae） against larvae of Culex tritaeniorhynchus and repellent

activity on adult vector mosquitoes[J]. Parasitology Research，

2008，103（3）：545-550.

［10］ SUNDARAM R，NARESH R，SHANTHI P，et al. Antihyperglycemic

effect of iridoid glucoside，isolated from the leaves

of Vitex negundo in streptozotocin-induced diabetic rats with

special reference to glycoprotein components[J]. Phytomedicine，

2012，19（3/4）：211-216.

［11］ 邱悅，李依蓉，張敏，等. 野生荊條種子休眠原因及兩個(gè)采摘

時(shí)期萌發(fā)條件的探究[J]. 植物學(xué)研究，2019（5）：416-423.

QIU Y，LI Y R，ZHANG M，et al. Study on the reasons of dormancy

of wild Vitex negundo var. heterophylla seeds and the

germination conditions of two picking periods[J]. Botanical Research，

2019（5）：416-423.

［12］ 李義強(qiáng)，宋桂龍，郭宇. 水浸與赤霉素處理對(duì)荊條種子萌發(fā)影

響研究[J]. 種子，2012，31（3）：10-13.

LI Y Q，SONG G L，GUO Y. Study on effect of water immersion

and gibberellin treatments on seed germination of Vitex ne?

gundo var. heterophylla[J]. Seed，2012，31（3）：10-13.

［13］ 張寧，張壯，張瑋康，等. 濃硫酸浸種對(duì)荊條種子發(fā)芽率的影

響[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（12）：143-146.

ZHANG N，ZHANG Z，ZHANG W K，et al. Effects of soaking

seeds with concentrated sulfuric acid on seed germination

rate of vitex[J]. Modern Agricultural Science and Technology，

2018（12）：143-146.

［14］ 郭麗，索素敏，徐明輝. 組織培養(yǎng)中不同消毒處理對(duì)野生薄皮

木種子萌發(fā)的影響[J]. 分子植物育種，2022，20（4）：1325-1330.

GUO L，SUO S M，XU M H. Effects of different disinfection

treatments on seed germination of wild Leptodermis oblonga

bge. in tissue culture[J]. Molecular Plant Breeding，2022，20

（4）：1325-1330.

［15］ 李煥宇，付婷婷，張?jiān)?，? 5 種方法提取真菌基因組DNA 作

為PCR 模板效果的比較[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，33（16）：

28-35.

LI H Y，F(xiàn)U T T，ZHANG Y，et al. Effect comparison of five

methods to extract fungal genomic DNA as PCR templates[J].

Chinese Agricultural Science Bulletin，2017，33（16）：28-35.

［16］ 馮連榮，彭儒勝，周宏民，等. 楊樹上一株鏈格孢菌的分離、鑒

定及室內(nèi)防治藥劑篩選[J]. 西部林業(yè)科學(xué)，2018，47（6）：

106-111.

FENG L R，PENG R S，ZHOU H M，et al. Isolation and identification

of a strain of Alternaria alternata on Populus Russki

and screening of fungicides[J]. Journal of West China Forestry

Science，2018，47（6）：106-111.

［17］ DENG J X，LI M J，PAUL N C，et al. Alternaria brassicifolii

sp. nov. isolated from Brassica rapa subsp. pekinensis in Korea

[J]. Mycobiology，2018，46（2）：172-176.

［18］ DENG J X，CHO H S，PAUL N C，et al. A novel Alternaria

species isolated from Peucedanum japonicum in Korea[J]. Mycobiology，

2014，42（1）：12-16.

［19］ 常纓，王義權(quán)，強(qiáng)勝. 鏈格孢菌菌株致病性及其遺傳差異性

[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2005，11（4）：486-489.

CHANG Y，WANG Y Q，QIANG S. Pathogenicity and genetic

diversity of Alternaria alternata strains[J]. Chinese Journal of

Applied and Environmental Biology，2005，11（4）：486-489.

［20］ 崔迪，王繼華，陳捷，等. 鏈格孢屬真菌對(duì)農(nóng)作物的危害[J]. 哈

爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21（4）：87-91.

CUI D，WANG J H，CHEN J，et al. The danger of alternaria

to the crops[J]. Natural Science Journal of Harbin Normal University，

2005，21（4）：87-91.

［21］ 方麗，王連平，茹水江，等. 植物組培過程中污染微生物種類

及其季節(jié)性的變化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（2）：284-287.

FANG L，WANG L P，RU S J，et al. Varieties and seasonal

characters of pollution microflora in plant tissue culture[J].

Acta Agriculturae Zhejiangensis，2013，25（2）：284-287.

［22］ 高樹廣，徐博涵，李偉峰，等. 殺菌劑對(duì)芝麻鏈格孢的毒力測(cè)

定[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，2016（6）：162-164.

GAO S G，XU B H，LI W F，et al. Toxicity determination of

fungicides to Alternaria sesame[J]. Bulletin of Agricultural Science

and Technology，2016（6）：162-164.

［23］ 張曉翔，劉微，范文忠. 不同藥劑對(duì)牡丹花鏈格孢菌葉斑病病

菌的室內(nèi)毒力[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：5286，5301.

ZHANG X X，LIU W，F(xiàn)AN W Z. Laboratory toxicity of different

fungicides against Paeonia suffruticosa Alternaria leaf spot

[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，2013，41（12）：

5286，5301.

［24］ 藺經(jīng)，楊青松，李曉剛，等. 嘧霉胺對(duì)梨黑斑病菌（Alternaria

alternata）的毒力及其藥效評(píng)價(jià)[J]. 植物保護(hù)，2009，35（4）：

162-163，167.

LIN J，YANG Q S，LI X G，et al. Evaluation of the fungitoxicity

of pyrimethanil against Alternaria alternata on pears[J].

Plant Protection，2009，35（4）：162-163，167.

［25］ 王春明，韓青梅，黃麗麗，等. 3 種殺菌劑對(duì)小麥黑胚病菌的毒

力測(cè)定及病害防治作用[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科

學(xué)版），2006，34（7）：55-60.

WANG C M，HAN Q M，HUANG L L，et al. Control of 3

fungicides against wheat black point in vitro and in vivo[J].

Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and

Forestry（Natural Science Edition），2006，34（7）：55-60.