燙水蛭（螞蟥）配方顆粒的位點(diǎn)特異性PCR鑒別△

胡力，袁媛，張輝，張?zhí)?，金艷，趙玉洋，蔣超

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；

2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；

3.華潤(rùn)三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 深圳 518029

水蛭是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版規(guī)定其為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman 或柳葉螞蟥W.acranulataWhitman 的干燥全體，夏、秋二季捕捉，用沸水燙死，曬干或低溫干燥。燙水蛭為取凈水蛭段，按《中國(guó)藥典》2020 年版炒法（通則0213），用滑石粉燙至微鼓起[1]。燙水蛭（螞蟥）經(jīng)過水提、濃縮、干燥、制粒成配方顆粒后，具有療效穩(wěn)定、規(guī)格統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)一致的優(yōu)勢(shì)。但由于加工后配方顆粒不再具備傳統(tǒng)性狀、顯微等鑒別特征，運(yùn)用傳統(tǒng)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定具有很大的局限性。與傳統(tǒng)鑒別方法相比，分子鑒定具有快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，目前已建立多種分子鑒定方法用于中藥材、中藥飲片[2-8]、中成藥的基原鑒定[9-12]。

DNA 作為遺傳信息的載體，具有信息量大、遺傳穩(wěn)定性高、化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)[13]，對(duì)于煎煮炮制后的中藥物種鑒定具有天然的優(yōu)勢(shì)。位點(diǎn)特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是基于單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)的一種基因分型方法，使用具有種屬特異性的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，僅目的物種可檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)PCR 產(chǎn)物是否存在，可進(jìn)行定性判斷。特異性PCR 鑒定已廣泛應(yīng)用于貴細(xì)藥材、冷背藥材、外來藥材及其提取液和配方顆粒的基原鑒定中[14-18]，尤其對(duì)配方顆粒進(jìn)行專屬性鑒別，有助于保證臨床用藥的安全性、有效性。本研究擬建立燙水蛭（螞蟥）配方顆粒PCR 鑒別方法，為規(guī)范燙水蛭（螞蟥）及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量提供檢測(cè)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Veriti? 型PCR 儀、GeneAmp 9700 型PCR 儀、Veriti? PRO 型PCR 儀（Applied Biosystems 公司）；TC-512 型PCR 儀（Techne 公司）；SYNGENE 型凝膠成像系統(tǒng)（Gene公司）。

1.2 試劑

Wizard?SV Genomic DNA Purification System（美國(guó)Promega 生物公司，批號(hào)：0000518550）；2×M5 PCR Mix（北京聚合美生物科技公司，批號(hào)：23DB0801）；2×TaqPCR Mix（金百特生物公司，批號(hào)：P0195）；SpeedSTAR HSTaqDNA 聚合酶、LATaqHS DNA 聚合酶、6×loading buffer（日本Takara公司，批號(hào)分別為AK81590A、AL22021A、R10201）；Trans2000 DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：R20222）；GelRed 核酸染料（北京蘭博利德公司，批號(hào)：R0010407）。

1.3 樣品

燙水蛭（螞蟥）、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供。燙水蛭（螞蟥）飲片（批號(hào)為2005001～2005015）經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院蔣超副研究員鑒定為燙水蛭（螞蟥）Whitmania pigraWhitman（表1）。以鑒定后燙水蛭（螞蟥）飲片制備了15 批燙水蛭（螞蟥）標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)為2005001Y～2005015Y），為了建立統(tǒng)一準(zhǔn)確的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)生產(chǎn)過程中的各個(gè)階段都進(jìn)行了樣品收集和制備，燙水蛭和水蛭相比經(jīng)過了炮制加工，為考察分子標(biāo)記對(duì)不同加工階段樣品的鑒定效果，制備了3 批配方顆粒中間體（批號(hào)為520901Y～520903Y），3 批配方顆粒成品（批號(hào)為2010001Y～2010003Y）。為了確保使用的分子鑒定標(biāo)記對(duì)不同加工階段樣品都有良好的鑒定效果，收集了3 批水蛭（螞蟥）飲片，取出一部分飲片制成燙水蛭（螞蟥）飲片，再將兩者制成相應(yīng)的3 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉用于生熟異治區(qū)分（表2）。收集7 批陰性樣品（包括《中國(guó)藥典》2020 年版中規(guī)定的燙水蛭的另外2 個(gè)來源）：1 批柳葉螞蟥W.acranulataWhitman、2 批水蛭Hirudo nipponicaWhitman、2 批海南山蛭Haemadipsa hainanaSong、2 批菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson（表3）作為常見混偽品?；靷纹酚芍袊?guó)中醫(yī)科學(xué)院蔣超副研究員鑒定。燙水蛭（螞蟥）對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121061-201305）。

表1 15批燙水蛭（螞蟥）飲片信息

表2 燙水蛭（螞蟥）生熟異治樣品

表3 燙水蛭（螞蟥）陰性樣品

2 方法

2.1 DNA提取

使 用Wizard ? SV Genomic DNA Purification System 試劑盒依據(jù)說明書步驟提取。樣品模板DNA溶液提取完成后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物設(shè)計(jì)

通過對(duì)比燙水蛭（螞蟥）與同屬近源種及常見偽品的細(xì)胞色素C 氧化酶Ⅰ（COⅠ）序列選擇特異性片段設(shè)計(jì)燙水蛭（螞蟥）特異性PCR 鑒別引物，篩選出燙水蛭（螞蟥）的穩(wěn)定引物區(qū)間；在區(qū)間內(nèi)篩選獲得燙水蛭（螞蟥）的特異性SNP 位點(diǎn)，將燙水蛭（螞蟥）序列中的5?-TTTCCTCGTCTGAATAAC-3?特異性位點(diǎn)C 的前一位從A 替換為T，設(shè)計(jì)燙水蛭特異性鑒別引物TSZ-F 及TSZ-R，其中上游引物序列TSZ-F為5?-TTTCCTCGTCTGAATATC-3?，下游引物序 列TSZ-R 為5?-GAGATACGGAGTCTG ATAG-3?。預(yù)期PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為133 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3 PCR擴(kuò)增條件

取燙水蛭（螞蟥）飲片、燙水蛭（螞蟥）標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、燙水蛭（螞蟥）配方顆粒及混偽品DNA考察退火溫度（54、56、58、60 ℃）、PCR 循環(huán)數(shù)（32、34、36、38 個(gè)循環(huán)）、Taq酶種類（2×M5 PCR Mix、2×TaqPCR Mix、SpeedSTAR HSTaq和LATaqHS）、DNA模板量（75.0、37.5、15.0、6.0 ng）對(duì)PCR 鑒別結(jié)果穩(wěn)定性的影響。篩選出最適合的鑒別條件，對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR鑒別。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

3 PCR鑒別條件的確定與耐用性考察

3.1 退火溫度

使用燙水蛭（螞蟥）特異性鑒別引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用Veriti? PRO 型PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為2×M5 PCR Mix 12.5 μL、燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA 模板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR 參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)34 次（94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min，其中退火溫度分別設(shè)置為54、56、58、60 ℃。結(jié)果表明，在54 ℃時(shí)，燙水蛭（螞蟥）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒能在100～250 bp（約133 bp）處擴(kuò)增得單一明亮條帶，混偽品和陰性樣品在56～58 ℃時(shí)出現(xiàn)弱擴(kuò)增，隨著退火溫度升高，擴(kuò)增效率降低導(dǎo)致配方顆粒的條帶逐漸變暗甚至消失；60 ℃時(shí)配方顆粒條帶模糊不清，無法作為鑒別依據(jù)（圖1）。為避免產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，選擇PCR退火溫度為54 ℃。

圖1 退火溫度對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.2 循環(huán)次數(shù)考察

分別選用32、34、36、38個(gè)循環(huán)進(jìn)行考察，選用Veriti? PRO 型PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為2×M5 PCR Mix 12.5 μL、燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA 模板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR 參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)（94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。結(jié)果表明，在32～38個(gè)循環(huán)時(shí)燙水蛭（螞蟥）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒在100～250 bp（約133 bp）處擴(kuò)增得單一明亮條帶，均能得到正確鑒別結(jié)果，36～38 個(gè)循環(huán)時(shí)混偽品和陰性樣品出現(xiàn)擴(kuò)增條帶（圖2）。為保證結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，選擇34個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR。

圖2 循環(huán)次數(shù)對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.3 不同Taq酶考察

為測(cè)試不同種類的Taq酶對(duì)燙水蛭（螞蟥）及其混偽品鑒別結(jié)果的影響，分別使用2×M5 PCR Mix、2×TaqPCR Mix、SpeedSTAR HSTaqDNA、LATaqHS DNA 聚合酶進(jìn)行測(cè)試。選用Veriti? PRO型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為Taq酶12.5 μL、燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA模板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)34 次（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。結(jié)果表明，除2×M5 PCR Mix 在100～250 bp（約133 bp）擴(kuò)增出單一明亮條帶外，使用其他Taq酶均未在100～250 bp 擴(kuò)增出目的條帶，因此選擇2×M5 PCR Mix作為最優(yōu)的Taq酶（圖3）。

圖3 不同Taq DNA聚合酶對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.4 DNA模板量考察

對(duì)25 μLPCR 體系中的模板DNA 用量進(jìn)行了考察，調(diào)整DNA 質(zhì)量濃度約15 ng·μL-1，選用Veriti?PRO 型PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為2×M5 PCR Mix 12.5 μL，燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，分別設(shè)置5.0、2.5、1.0、0.5 μL 的DNA 模板（DNA 量分別相當(dāng)于75.0、37.5、15.0、6.0 ng），ddH2O 的量分別為6.7、9.2、10.7、11.2 μL。PCR 參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)34 次（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。結(jié)果表明，DNA 模板量為0.5～5.0 μL均能在100～250 bp（約133 bp）擴(kuò)增出單一明亮條帶（圖4）。為防止模板質(zhì)量濃度過高產(chǎn)生假陽性或過低產(chǎn)生假陰性結(jié)果，選擇DNA 模板量為25 μL（約37.5 ng）。

圖4 DNA模板量對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.5 不同PCR儀考察

為測(cè)試不同PCR 儀對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒及其混偽品鑒別結(jié)果的影響，分別使用4 種PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為2×M5 PCR Mix 12.5 μL、燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA 模 板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR 參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)34 次（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。結(jié)果表明，使用Veriti? 型、GeneAmp 9700 型、Veriti? PRO 型PCR儀均可獲得正確的鑒定結(jié)果，而使用TC-512 型PCR儀未成功擴(kuò)增出條帶（圖5），表明進(jìn)行燙水蛭（螞蟥）配方顆粒PCR 鑒別時(shí)應(yīng)對(duì)擴(kuò)增溫度進(jìn)行微調(diào)，并進(jìn)行方法確認(rèn)。

圖5 不同PCR儀對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.6 引物用量考察

為測(cè)試不同引物用量對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒及其混偽品鑒別結(jié)果的影響，分別使用4個(gè)引物用量進(jìn)行擴(kuò)增，引物濃度為10 μmol·L-1。選用Veriti? PRO型PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為2×M5 PCR Mix 12.5 μL，分別設(shè)置0.2、0.4、0.6、0.8 μL（10 μmol·L-1）的燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別引物，DNA 模板2.5 μL，ddH2O 的量分別為9.6、9.2、8.8、8.4 μL。PCR 參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)34 次（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。結(jié)果表明，引物用量為0.2～0.8 μL 時(shí)正品均可獲得正確的鑒定結(jié)果，而引物用量>0.6 μL 時(shí)偽品出現(xiàn)雜帶（圖6）。為了防止引物濃度過高導(dǎo)致雜帶產(chǎn)生，選擇燙水蛭（螞蟥）配方顆粒PCR鑒別時(shí)引物濃度為10 μmol·L-1，用量為0.4 μL。

圖6 引物用量對(duì)燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

根據(jù)以上結(jié)果，確定燙水蛭（螞蟥）配方顆粒PCR 鑒別的條件為PCR 體系為25 μL，包括2×M5 PCR Mix 12.5 μL、燙水蛭（螞蟥）配方顆粒鑒別引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA 模板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)34次（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。

3.7 專屬性考察

使用所建立的燙水蛭（螞蟥）配方顆粒PCR 鑒定方法對(duì)燙水蛭（螞蟥）飲片、配方顆粒、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及其混偽品進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，燙水蛭飲片，標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉和配方顆粒成品均能在100～250 bp（約133 bp）擴(kuò)增出單一明亮條帶，7 批混偽品均無條帶（圖7）。

圖7 燙水蛭（螞蟥）專屬性考察

3.8 適用性考察

使用所建立的燙水蛭配方顆粒PCR 鑒定方法對(duì)15 批水蛭（螞蟥）飲片進(jìn)行適用性考察（圖8）。結(jié)果表明，15 批水蛭（螞蟥）飲片均能得到正確的鑒定結(jié)果。對(duì)15 批燙水蛭（螞蟥）飲片、15 批燙水蛭（螞蟥）飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、3 批燙水蛭（螞蟥）配方顆粒中間體、3 批燙水蛭（螞蟥）配方顆粒、3 批水蛭（螞蟥）飲片、3 批燙水蛭（螞蟥）飲片、3 批水蛭（螞蟥）飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、3 批燙水蛭（螞蟥）飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉進(jìn)行適用性考察，凝膠電泳圖譜結(jié)果與燙水蛭對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100～250 bp存在單一DNA 條帶，空白對(duì)照無條帶（圖9）。

圖8 15批水蛭（螞蟥）飲片適用性考察

圖9 燙水蛭配方顆粒適用性考察

4 結(jié)語

藥源調(diào)查和全面的樣品采集是建立準(zhǔn)確、可靠PCR鑒別方法的前提。燙水蛭（螞蟥）配方顆粒經(jīng)過了高溫水煮、干燥、制粒等一系列制備工藝，DNA高度降解，且加工后喪失性狀與顯微鑒別特征，傳統(tǒng)的鑒定手段無法滿足燙水蛭配方顆粒鑒定的需求。

配方顆粒經(jīng)過加工后，DNA 降解程度較大，留存的DNA片段較小，在進(jìn)行特異性PCR鑒別時(shí)，主要依據(jù)存在變異的短小片段進(jìn)行特異性PCR 鑒別。相較于原藥材，在進(jìn)行配方顆粒PCR 擴(kuò)增時(shí)，退火溫度不能過高，過高的退火溫度會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，加之配方顆粒的DNA 質(zhì)量濃度較低會(huì)導(dǎo)致配方顆粒擴(kuò)增條帶逐漸變暗甚至消失。此外，配方顆粒也需要較高的PCR 循環(huán)來保證目的條帶的產(chǎn)生。上述因素使得對(duì)配方顆粒PCR 鑒別的引物特異性要求較高，在篩選引物時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增效果好、條帶明亮清晰、陰性樣品無目的條帶的引物。

使用本研究建立的特異性PCR 方法對(duì)多批水蛭（螞蟥）飲片、燙水蛭（螞蟥）飲片、燙水蛭（螞蟥）標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及燙水蛭（螞蟥）配方顆粒等進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明，63 批樣品均在100～250 bp 見單一特異性鑒別條帶。專屬性考察結(jié)果表明，燙水蛭（螞蟥）正品飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒均在100～250 bp 見單一特異性鑒別條帶，水蛭另外2 個(gè)來源及偽品均無條帶。以上結(jié)果表明，本研究建立的燙水蛭（螞蟥）特異性鑒別方法對(duì)配方顆粒具有良好的適用性及專屬性，可為燙水蛭（螞蟥）藥材及其配方顆粒等加工產(chǎn)品提供相應(yīng)的檢測(cè)工具，為完善燙水蛭（螞蟥）的質(zhì)量控制體系、保障其臨床應(yīng)用提供依據(jù)，也為其他中藥品種的配方顆粒鑒別方法研究提供參考。