五倍子配方顆粒的位點(diǎn)特異性PCR鑒別△

胡力，陳梓媛，趙玉洋，金艷，張輝，張?zhí)?，仝一丹，袁?，蔣超*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；

2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；

3.華潤(rùn)三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 深圳 518029

五倍子是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版規(guī)定其為漆樹(shù)科植物鹽膚木Rhus chinensisMill.、青麩楊R.potaniniiMaxim.或紅麩楊R.punjabensisStew.var.sinica（Diels）Rehd.et Wils.葉上的蟲(chóng)癭，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis（Bell）Baker 寄生而形成。秋季采摘，置沸水中略煮或蒸至表面呈灰色，殺死蚜蟲(chóng)，取出，干燥。按外形不同分為肚倍和角倍[1]。早期主要是依據(jù)直觀的形態(tài)學(xué)分類、倍子形態(tài)及致癭位置等對(duì)五倍子進(jìn)行分類[2-4]。與傳統(tǒng)鑒別方法主觀性較強(qiáng)的特點(diǎn)相比，分子鑒定穩(wěn)定、準(zhǔn)確、特異性好、不受生物發(fā)展階段與儲(chǔ)藏加工影響，結(jié)果較為客觀，受到研究者的廣泛關(guān)注，已建立多種中藥材及飲片的分子鑒定方法[5-15]，也有中成藥分子鑒定的報(bào)道[16-21]。特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定已廣泛應(yīng)用于中藥材提取液、中成藥、貴細(xì)藥材、配方顆粒的基原鑒定中[22-25]，為配方顆粒專屬性鑒別提供了解決方法，也提高了臨床用藥的安全性。

五倍子經(jīng)過(guò)水煎煮工藝加工為五倍子配方顆粒后，具有療效穩(wěn)定、規(guī)格統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)一致的優(yōu)勢(shì)，但因配方顆粒不再具備性狀、顯微等鑒別特征，導(dǎo)致基原鑒別更加困難[26]，需要建立針對(duì)五倍子配方顆粒合理、科學(xué)、快速、簡(jiǎn)便的檢驗(yàn)方法。本研究擬建立五倍子配方顆粒PCR 鑒別方法，為規(guī)范五倍子及其加工產(chǎn)品質(zhì)量提供檢測(cè)工具。

1 材料

1.1 儀器

Veriti ?型PCR 儀、GeneAmp 9700 型PCR 儀（Applied Biosystems 公 司）；PTC-100 型PCR 儀、SYNGENE 型凝膠成像系統(tǒng)（Gene 公司）；TC-512型PCR儀（上海Techne公司）。

1.2 試藥

五倍子藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司公司提供。17 批五倍子藥材（批號(hào)為1901001～1904017）經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為五倍子蚜Melaphis chinensis（Bell）Baker寄生而形成的蟲(chóng)癭（表1）。將已鑒定的五倍子藥材，按《中國(guó)藥典》2020 年版中五倍子飲片炮制要求敲開(kāi)外殼，刮凈內(nèi)部雜質(zhì)，炮制成相應(yīng)的17 批五倍子飲片（批號(hào)與藥材一致），制備了17 批五倍子標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)為1904001Y～1904017Y）、3 批配方顆粒成品（批號(hào)為1906001Y～1906003Y）。另收集了五倍子蚜同屬倍蛋蚜寄生形成的5 批蟲(chóng)癭（批號(hào)為DB2111005～DB2111009），經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院蔣超副研究員鑒定為倍蛋蚜Schlechtendalia peitanTsai et Tang 寄生而成的蟲(chóng)癭，用于檢測(cè)所建立方法的專屬性。五倍子對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：121078-201504）。

表1 17批五倍子藥材信息

Wizard?SV Genomic DNA Purification System（美國(guó)Promega 生物公司，批號(hào)：A2361）；2×M5 PCR Mix（北京聚合美生物科技公司，批號(hào)：MF164）；2×TaqPCR Mix（金百特生物公司，批號(hào)：P0195）；SpeedSTAR HSTaqDNA 聚合酶、LATaqHS DNA 聚合酶、6×loading buffer（日本Takara 公司，批號(hào)分別為RR070A、RR042A、9156）；Trans2K DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BM101）；GelRed 核酸染料（北京蘭博利德公司，批號(hào)：CR001）。

2 方法

2.1 DNA提取

使 用Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒依據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟提取。樣品模板DNA溶液提取完成后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)比五倍子蚜蟲(chóng)及同屬近源種倍蛋蚜蟲(chóng)的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）序列選擇特異性片段設(shè)計(jì)五倍子特異性PCR鑒別引物，其中上游引物序列WBZ-F 為5?-CCCCCTCAATTATTTGATCTAT AG-3?,下游引物序列WBZ-R 為5?-GGACATAATGAA AATGAGCAACTAC-3?。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為138 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3 PCR擴(kuò)增條件

取五倍子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒及混偽品DNA，考察以下方面對(duì)PCR 鑒別結(jié)果穩(wěn)定性的影響：1）退火溫度分別為51、53、55、57 ℃；2）PCR 循環(huán)次數(shù)分別為36、38、40、42 個(gè)循環(huán)；3）Taq酶種類為2×TaqPCR Mix、SpeedSTAR HSTaq、2×M5 PCR Mix和LATaqHS；4）DNA 模板量分別為30、15、6、3 ng。篩選出最適鑒別條件，對(duì)五倍子配方顆粒進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR 鑒別。PCR 產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR鑒別條件的確定與耐用性考察

3.1.1 退火溫度 使用五倍子特異性鑒別引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別設(shè)置退火溫度51、53、55、57 ℃，結(jié)果表明退火溫度為51～55 ℃時(shí)，五倍子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒能擴(kuò)增得約138 bp 的亮帶（圖1），混偽品在55～57 ℃時(shí)出現(xiàn)弱擴(kuò)增與雜帶，產(chǎn)生假陽(yáng)性條帶，57 ℃時(shí)出現(xiàn)配方顆粒條帶缺失。選擇PCR退火溫度為53 ℃。

圖1 退火溫度對(duì)五倍子配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.1.2 循環(huán)次數(shù) 分別選用36、38、40、42個(gè)循環(huán)進(jìn)行考察，結(jié)果表明在36～42 個(gè)循環(huán)時(shí)五倍子（角倍）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒能擴(kuò)增得約138 bp的亮帶，均能得到正確鑒別結(jié)果，40～42個(gè)循環(huán)時(shí)混偽品和陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增（圖2）。為保證結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，避免混偽品假陽(yáng)性結(jié)果，選擇36個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

圖2 PCR循環(huán)次數(shù)對(duì)五倍子配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.1.3 不同Taq酶 為測(cè)試不同種類的Taq酶對(duì)五倍子及其混偽品鑒別結(jié)果的影響，分別使用2×M5 PCR Mix、2×TaqPCR Mix、SpeedSTAR HSTaqDNA、LATaqHS DNA 聚合酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示由于活力不同，不同Taq酶的擴(kuò)增條帶亮度存在差異，且使用SpeedSTAR HSTaqDNA 聚合酶的部分偽品產(chǎn)生了假陽(yáng)性條帶（圖3，泳道7、8），使用LATaqHS 聚合酶也出現(xiàn)假陽(yáng)性條帶（圖3，泳道4、5）。使用其他2 種DNA 聚合酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶強(qiáng)弱雖存在差別，但不影響對(duì)結(jié)果的判讀，其中使用2×M5 PCR Mix 可獲得更明亮條帶，故選擇2×M5 PCR Mix作為最優(yōu)的Taq酶。

圖3 不同Taq DNA聚合酶對(duì)五倍子配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.1.4 DNA 模板量 對(duì)25 μL PCR 反應(yīng)體系中的模板DNA 用量進(jìn)行了考察，調(diào)整DNA 質(zhì)量濃度為約6 ng·μL-1，分別設(shè)置3、6、15、30 ng 的DNA 模板（DNA 用量分別為0.5、1.0、2.5、5.0 μL），結(jié)果表明當(dāng)模板量為1.0～5.0 μL 時(shí)均能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，而質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性條帶的出現(xiàn)，見(jiàn)圖4。為防止模板質(zhì)量濃度過(guò)高產(chǎn)生假陽(yáng)性或過(guò)低產(chǎn)生假陰性的錯(cuò)誤鑒別結(jié)果，選擇在25 μL 的PCR體系中加入模板DNA 1 μL（6 ng·μL-1）。

圖4 DNA模板量對(duì)五倍子配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

根據(jù)以上結(jié)果，確定五倍子配方顆粒PCR鑒別的條件為反應(yīng)體系包括2×M5 PCR Mix 12.5 μL，五倍子配方顆粒鑒別引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，無(wú)菌雙蒸水9.2 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)36次（94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。

3.1.5 不同PCR 儀 為測(cè)試不同PCR 儀對(duì)五倍子配方顆粒及其混偽品鑒別結(jié)果的影響，分別使用4 種PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明Veriti ?型、GeneAmp 9700 型、TC-512 型、PTC-100 型PCR 儀均可獲得正確的鑒定結(jié)果，而GeneAmp 9700 型PCR 儀部分偽品出現(xiàn)微弱擴(kuò)增條帶，表明進(jìn)行五倍子配方顆粒PCR 鑒別時(shí)應(yīng)對(duì)PCR 擴(kuò)增溫度進(jìn)行微調(diào)，并進(jìn)行方法確認(rèn)（圖5）。

圖5 不同PCR儀對(duì)五倍子配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.1.6 不同引物量 為測(cè)試不同引物濃度對(duì)五倍子配方顆粒及其混偽品鑒別結(jié)果的影響，分別使用4個(gè)引物濃度進(jìn)行擴(kuò)增，使用的引物濃度為10 μmol·L-1，結(jié)果表明引物量為0.6 μL 以下時(shí)均可獲得正確的鑒定結(jié)果，而引物量為0.8 μL時(shí)偽品及空白出現(xiàn)假陽(yáng)性條帶，為了防止引物量過(guò)高導(dǎo)致假陽(yáng)性條帶產(chǎn)生，出現(xiàn)錯(cuò)誤鑒別結(jié)果。選擇五倍子配方顆粒PCR鑒別時(shí)引物量為0.4 μL（10 μmol·L-1），見(jiàn)圖6。

圖6 不同引物量對(duì)五倍子配方顆粒鑒別結(jié)果的影響

3.2 專屬性考察

用本研究建立的五倍子配方顆粒PCR 鑒定方法對(duì)五倍子藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉和配方顆粒及其混偽品進(jìn)行鑒定，結(jié)果五倍子藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉和配方顆粒均能擴(kuò)增出與對(duì)照藥材一致的特異性鑒別條帶，混偽品及偽品標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、配方顆粒均無(wú)條帶（圖7、圖8）。

圖7 使用五倍子配方顆粒鑒別方法鑒別五倍子及其混偽品

圖8 使用五倍子配方顆粒鑒別方法鑒別五倍子及其加工混偽品

3.3 適用性考察

使用本方法對(duì)17 批固定五倍子藥材、17 批五倍子標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉和3 批五倍子配方顆粒成品進(jìn)行鑒定，以驗(yàn)證本方法的適用性，結(jié)果表明所有樣本PCR 供試品與五倍子對(duì)照藥材的電泳圖譜相應(yīng)的位置上均可擴(kuò)增獲得約138 bp 單一特異性鑒別條帶，空白對(duì)照無(wú)條帶（圖9）。

圖9 五倍子配方顆粒適用性考察

4 討論

《中國(guó)藥典》2020 年版收載了51 味動(dòng)物藥，其中五倍子和冬蟲(chóng)夏草都是通過(guò)寄生這一途徑產(chǎn)生的。相比于冬蟲(chóng)夏草，五倍子是五倍子蚜蟲(chóng)在多個(gè)寄主植物上寄生而形成的蟲(chóng)癭?！吨袊?guó)藥典》2020 年版中對(duì)五倍子的鑒別主要是依靠傳統(tǒng)性狀鑒別及薄層色譜鑒別等方式，對(duì)于經(jīng)加工處理后失去了性狀特征的五倍子制品，如提取物、配方顆粒等，需要建立一個(gè)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的鑒定方法，專屬性鑒定五倍子中的五倍子蚜源性成分是建立五倍子配方顆粒鑒別方法的關(guān)鍵。

五倍子配方顆粒經(jīng)過(guò)了高溫水煮、干燥、制粒等一系列制備工藝，DNA 高度降解，成品中留存DNA 片段較短、含量較低。使用本研究建立的特異性PCR 方法對(duì)多批五倍子藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒等進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，37 批樣品均在100～250 bp 見(jiàn)單一特異性鑒別條帶。以上結(jié)果表明本研究建立的五倍子特異性鑒別方法對(duì)配方顆粒具有良好的適用性，可為五倍子藥材及其配方顆粒等加工產(chǎn)品提供相應(yīng)的檢測(cè)工具，完善了五倍子的質(zhì)量控制體系，為其臨床應(yīng)用提供了保障，也可為其他中藥品種的配方顆粒鑒別提供參考。