基于生信分析對阿爾茨海默病炎癥相關(guān)關(guān)鍵基因的篩選及鑒定

司蕊豪，劉羽茜，朱仲康，王旭，侯文曉，趙丹玉

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院1.生物化學(xué)教研室；2.生理學(xué)教研室；3.組織與胚胎學(xué)教研室，沈陽 110847）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種常見的慢性神經(jīng)退行性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，截至2020 年9 月，全球約有5 000 萬AD 患者[1]。由于人口老齡化的加劇，預(yù)計到2050 年AD 病例數(shù)將增至1.52 億[2]。AD 的主要臨床表現(xiàn)為記憶力減退和認(rèn)知功能障礙，主要病理特征為β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積、tau 蛋白過度磷酸化、神經(jīng)纖維纏結(jié)等[3]。大量研究表明，在AD 發(fā)病過程中，各種炎癥及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在不同的大腦區(qū)域中異常表達(dá)，并且與疾病進(jìn)展顯著相關(guān)[4-5]。因此，研究炎癥相關(guān)基因（inflammation-related genes，IRGs）的表達(dá)對于診斷與防治AD 尤為重要。本文旨在通過生信分析鑒定AD 過程中與IRGs 相關(guān)的特征基因，分析特征基因所富集的生物學(xué)途徑，篩選并鑒定關(guān)鍵基因，為AD 的臨床診斷和治療提供潛在的靶點。

1 對象與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取及差異表達(dá)IRGs 的篩選 通過GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）搜索“Alzheimer”并且下載GSE144459[6-7]（GPL21163 Agilent-074809SurePrint G3 Mouse GE v2 8x60K Microarray 數(shù)據(jù)更新至Aug 25，2020）和GSE135999[8]（GPL21810 Agilent -074809 SurePrint G3 Mouse GE v2 8x60K Microarray[Feature Number version]數(shù)據(jù)更新至Aug 28，2021）中的AD 模型小鼠海馬和正常小鼠海馬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。使用limma[9]包分別分析兩個數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因（differentially expre ssed genes，DEGs）。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05。并 使 用ggplot2[10]對DEGs 進(jìn)行可視化。然后在NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Gene 子數(shù)據(jù)庫中搜索關(guān)鍵詞“Inflammatory”及“Musmusculus”獲得IRGs。運用在線韋恩圖工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/） 對上述獲得的差異表達(dá)基因（DEG1、DEG2）與NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得IRGs 取交集并獲得差異表達(dá)IRGs。

1.2 差異表達(dá)IRGs 的功能富集分析 基于GO 及KEGG 數(shù)據(jù)庫，使用clusterProfiler[11]包對差異表達(dá)IRGs 進(jìn)行功能富集分析，并對富集結(jié)果進(jìn)行可視化。GO 富集分析包含生物過程、分子功能、細(xì)胞組成。本研究中篩選條件為P<0.05，count≥1。選取排名前15 的信號通路探索差異表達(dá)IRGs 的生物學(xué)功能。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及候選基因篩選

1.3.1 差異表達(dá)IRGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò) 為探究差異表達(dá)IRGs 之間是否存在互作關(guān)系，利用STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）對106 個差異表達(dá)IRGs 進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。置信度為0.4（Confidence=0.4），去除離散的蛋白。用Cytoscape 軟件對蛋白網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行美化，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)中候選基因篩選-cytoHubba 利用cytoHubba 插件來篩選PPI 中的關(guān)鍵節(jié)點。根據(jù)nodes在網(wǎng)絡(luò)中的屬性進(jìn)行排名。以MCC、DMNC、MNC、DEGREE、EPC 5 種算法分別進(jìn)行排序，然后對5 種算法的TOP30 基因取交集，獲得候選基因。

1.4 特征基因的篩選及鑒定

1.4.1 LASSO 回歸分析篩選特征基因 本研究以GSE144459（Healthy=16，AD=16）作為訓(xùn)練集，以GSE135999（Healthy=6，AD=7）作為驗證集，來進(jìn)行LASSO 回歸分析。設(shè)置參數(shù)為：family ="binomial"，type.measure="class"；LASSO 分 析 工 具 為R 語 言glmnet[12]包，以lambda 最小值取0.000 時的模型為最佳診斷模型。

1.4.2 鑒定特征基因并繪制受試者工作特征（ROC）曲線 將篩選得到的特征基因輸入文件進(jìn)行主成份分析（principle component analysis，PCA），以確定對疾病及正常小鼠的區(qū)分能力。使用pROC[13]包繪制每個特征基因的ROC 曲線，判斷特征基因在AD 中的預(yù)測診斷能力。ROC 曲線下面積（AUC）的值一般在0.5~1.0 之間。在0.5~0.7 時預(yù)測診斷準(zhǔn)確性較低，在0.7~0.9 時具有一定的預(yù)測診斷意義，在0.9 以上越接近于1.0，說明其預(yù)測診斷效果越好。

1.5 LASSO、SVM 、GSVA 分類器構(gòu)建 分別以GSE144459 及GSE135999 作為訓(xùn)練集和驗證集，采用LASSO、SVM、GSVA 3 種不同的算法分別計算8個特征基因，使用R 語言pROC 包繪制訓(xùn)練集及驗證集的ROC 曲線，并計算AUC，一般AUC 值越大，說明預(yù)測的結(jié)果較為準(zhǔn)確，對應(yīng)的分類器具有較高的分類意義。

1.6 特征基因功能網(wǎng)絡(luò) 為進(jìn)一步探索特征基因（adj.P<0.05）所靶向的通路及其發(fā)揮的功能，本研究使用clusterProfiler 包對其進(jìn)行基于GO 和KEGG 的富集分析。并繪制特征基因與通路的網(wǎng)絡(luò)圖并且對富集結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7 特征基因的表達(dá)驗證 用AD 相關(guān)的數(shù)據(jù)集GSE122063（AD=56，Control=44）驗證8 個特征基因（Fcgr2b、Cd14、Fcgr4、Fcgr1、Lyz2、Fcgr3、Ly86 及Themis2）。采用秩和檢驗和R 語言ggplot2 包對特征基因的表達(dá)進(jìn)行分析和可視化。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá) IRGs 的篩選 用limma 包篩選GSE135999 數(shù)據(jù)集AD/WT 小鼠海馬組織中共存在2 101 個差異表達(dá)基因（DEG1），其中920 個上調(diào)基因，1 181 個下調(diào)基因；GSE144459 數(shù)據(jù)集AD/WT小鼠海馬組織中共存在9 239 個差異表達(dá)的基因（DEG2），其中3 883 個上調(diào)基因，5 256 個下調(diào)基因。如圖1A、1B 所示。對上述獲得的差異表達(dá)基因（DEG1、DEG2）與NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得IRGs 取交集，以獲得差異表達(dá)的IRGs。結(jié)果共獲得90 個上調(diào)表達(dá)IRGs，16 個下調(diào)表達(dá)IRGs ，如圖1C、D 所示。

圖1 差異表達(dá)的IRGs 的篩選Fig 1 Screening of differentially expressed IRGs

2.2 功能富集分析結(jié)果 為探索差異表達(dá)IRGs 的生物學(xué)功能，本研究對106 個差異表達(dá)IRGs 進(jìn)行KEGG 功能富集分析后，使用氣泡圖對TOP15 通路進(jìn)行展示（圖2A）。得到差異表達(dá)IRGs 參與了金黃色葡萄球菌感染、中性粒細(xì)胞外陷阱形成、破骨細(xì)胞分化、吞噬體、Toll 樣受體、FcγR 介導(dǎo)吞噬作用、趨化因子等信號通路。此外對106 個差異表達(dá)IRGs 進(jìn)行GO 分析，發(fā)現(xiàn)在BP 中這些基因參與細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)、單核細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞增殖、白細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面。在CC 中與溶酶體、吞噬囊泡、膜微區(qū)、膜筏、炎癥體復(fù)合體等顯著相關(guān)。在MF 中與G 蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合、免疫球蛋白結(jié)合、Toll 樣受體結(jié)合、CCR 趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物學(xué)功能相關(guān)（圖2B）。

圖2 差異表達(dá)IRGs 功能富集分析Fig 2 Functional enrichment analysis of differentially expressed IRGs

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及候選基因篩選

2.3.1 差異表達(dá)IRGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò) 利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）對106 個差異表達(dá)IRGs進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到98 個蛋白的互作網(wǎng)關(guān)系，包括98 個節(jié)點，815 條邊。然后用Cytoscape 插件對蛋白網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行美化，如圖3。圖中綠色表示下調(diào)表達(dá)，紅色表示上調(diào)表達(dá)，顏色越深，上調(diào)/下調(diào)的越明顯。

圖3 差異表達(dá)IRGs的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 3 PPI networks for differential expression of IRGs

2.3.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)中候選基因篩選-cytoHubba 基于cytoHubba 插件中的算法，對5 種算法的TOP30 基因取交集，獲得17 個候選基因。分別是Tyrobp、Fcgr3、Fcgr2b、Fcgr1、C1qa、Cd14、Cd86、Ctss、Irf8、Cd68、Fcgr4、Ccl4、Lyz2、Ly86、Clec7a、Ccl3、Themis2。然后使用UpSetR[14]包進(jìn)行可視化，得到UpSet 圖，如圖4。

圖4 MCC、DMNC、MNC、DEGREE、EPCTOP30 基因交集Upset 圖Fig 4 MCC，DMNC，MNC，DEGREE，EPC TOP30 gene intersection Upset diagram

2.4 特征基因的篩選及鑒定

2.4.1 特征基因的篩選 用LASSO 回歸對訓(xùn)練集GSE144459（Healthy=16，AD=16）和驗證集GSE135999（Healthy=6，AD=7）進(jìn)行分析，得到基因系數(shù)的圖形和交叉驗證的誤差圖。如圖5，以lambda 最小值取0.000 時的模型為最佳診斷模型，可見LASSO 回歸分析篩選得到由8 個基因構(gòu)成的診斷模型，分別為Fcgr2b、Cd14、Fcgr4、Fcgr1、Lyz2、Fcgr3、Ly86 及Themis2。

圖5 LASSO 回歸分析篩選特征基因Fig 5 Selection of characteristic genes by LASSO regression analysis

2.4.2 鑒定特征基因并繪制ROC 曲線 對8 個特征基因進(jìn)行PCA 分析得出無論是在GSE135999還是GSE144459 中，特征基因均可較好的區(qū)分AD組和正常組（圖6）。此外，通過繪制特征基因的ROC 曲線（圖7） 可知每個基因的AUC 值均在0.7以上，由此說明特征基因?qū)D 具有較強的預(yù)測能力。

圖6 特征基因?qū)颖镜腜CAFig 6 PCA of characteristic gene pair samples

圖7 特征基因的鑒定Fig 7 Identification of characteristic genes

2.5 LASSO、SVM、GSVA 分類器構(gòu)建 由LASSO模型（圖8A）中可以看出，訓(xùn)練集及驗證集的AUC均大于等于0.8；SVM 模型中（圖8B）訓(xùn)練集及驗證集的AUC 值均為1；GSVA 模型中（圖8C）中訓(xùn)練集及驗證集的AUC 值均在0.9 以上。由此說明3 種模型均為較好的分類器，對AD 具有較高的預(yù)測能力，因此這8 個基因可作為AD 的特征基因。

圖8 LASSO、SVM、GSVA分類器的ROC 曲線Fig 8 ROC curve of LASSO，SVM，GSVA classifiers

2.6 特征基因功能網(wǎng)絡(luò) 在生物過程方面，共獲得151 個Terms，特征基因與抗原刺激的急性炎癥反應(yīng)、B 細(xì)胞介導(dǎo)免疫的調(diào)節(jié)、免疫球蛋白介導(dǎo)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)等功能相關(guān)（圖9A）。在分子功能方面，共獲得9 個Terms，主要與酰胺結(jié)合、β-淀粉樣蛋白結(jié)合、水解酶活性、免疫受體活性、溶菌酶活性等功能相關(guān)（圖9B）。在細(xì)胞組成方面，共獲得7 個Terms，與高爾基體順面內(nèi)胞漿網(wǎng)、質(zhì)膜外側(cè)固有成分、膜微區(qū)、膜筏等功能相關(guān)（圖9C）。此外特征基因參與了急性髓系白血病、FcγR-介導(dǎo)吞噬作用、利什曼病、中性粒細(xì)胞外陷阱形成、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肺結(jié)核等疾病相關(guān)通路（圖9D）。

圖9 特征基因功能網(wǎng)絡(luò)Fig 9 Characteristic gene function network

2.7 特征基因的表達(dá)驗證 如圖10 所示，8 個特征基因中的5 個基因（Fcgr2b、Cd14、Fcgr1、Fcgr3、Ly86）在AD 腦組織中表達(dá)上調(diào)且有統(tǒng)計學(xué)意義。因此可作為AD 發(fā)展過程中與炎癥相關(guān)的關(guān)鍵基因。

圖10 5 個特征基因在相關(guān)的GSE122063 數(shù)據(jù)集的腦組織樣本中的表達(dá)Fig 10 Expression of five characteristic genes in brain tissue samples from the associated GSE122063 dataset

3 討論

AD 是最常見且發(fā)病率最高的癡呆類型，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為全球公共衛(wèi)生重點之一，同時也是造成老年人死亡的第三主要病因[2]。目前尚未找到有效治愈的藥物或方法。臨床上被診斷具有輕度認(rèn)知障礙的AD 患者其病情往往已經(jīng)進(jìn)展到了較晚的階段，此時發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷，不能通過保護(hù)神經(jīng)或清除Aβ沉積來治愈，這也是目前AD 治療效果不理想的重要原因[15]。因此，早期診斷以及尋找有效的治療靶點對AD 的防治具有重要的意義。大量研究表明，神經(jīng)炎癥在AD 發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。本研究通過生物信息學(xué)分析方法鑒定出Fcgr2b、Cd14、Fcgr1、Fcgr3、Ly86 為AD 神經(jīng)炎癥過程中的關(guān)鍵基因，為AD 的機制研究及診斷治療提供新的思路。

神經(jīng)炎癥在AD 發(fā)生中涉及Aβ 的生成、神經(jīng)元丟失、氧化應(yīng)激等多方面病理過程。作為腦內(nèi)固有免疫細(xì)胞的小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。AD 發(fā)病早期，在炎癥因子和Aβ 等病理產(chǎn)物的作用下，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮趨化和吞噬作用對病理物質(zhì)進(jìn)行清除，并減輕炎癥。然而隨著疾病的逐漸加重，小膠質(zhì)細(xì)胞被持續(xù)刺激導(dǎo)致過度激活，其趨化和吞噬能力嚴(yán)重受損，對病理產(chǎn)物的清除能力下降，使得Aβ 大量積聚，此時促炎因子白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α 等產(chǎn)生持續(xù)增多，抑炎因子分泌減少，神經(jīng)炎癥不斷加重，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷[16]。AD 發(fā)病初期神經(jīng)炎癥的原因目前尚未完全闡明。在本研究中，KEGG 富集分析結(jié)果提示AD 神經(jīng)炎癥的發(fā)生與金黃色葡萄球菌感染、中性粒細(xì)胞外陷阱形成、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、FcγR 介導(dǎo)吞噬作用、Toll 樣受體等信號通路相關(guān)。GO 富集分析結(jié)果提示AD 的發(fā)生與白細(xì)胞遷移、炎癥的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞增殖、對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)、對外部刺激反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能相關(guān)。因此研究神經(jīng)炎癥機制對AD 的診斷及防治具有至關(guān)重要的意義。

研究表明，F(xiàn)c 片段結(jié)合受體（fcreceptors，F(xiàn)cRs）能夠與IgG 的Fc 部分相結(jié)合。根據(jù)其不同的親和力，F(xiàn)cRs 可分為激活型受體和抑制型受體。其中Fcgr1、Fcgr3 為激活型受體，F(xiàn)cgr2b 是唯一的抑制型受體[17]。激活型受體在與免疫復(fù)合物（immune complex，IC）交聯(lián)后，Src 家族激酶（src family kinase，SFK）使免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）上的酪氨酸殘基磷酸化，募集脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK），介導(dǎo)信號的激活從而調(diào)控下游分子表達(dá)[18]。Fcgr1、Fcgr3 廣泛存在于人和小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中。AD 狀態(tài)下，兩者在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量增加。小膠質(zhì)細(xì)胞在激活型受體的作用下，對Aβ 的吞噬能力增強[19。Fcgr2b 雖然不含ITAM 基序，但其含有免疫受體酪氨酸抑制基序（Immunoreceptor tyrosinebased inhibition motif，ITIM），能夠通過其攜帶的ITIM 基序來拮抗激活型受體所引起的促進(jìn)吞噬、釋放炎性介質(zhì)等信號，轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制型信號[20]。有研究提出Fcgr2b 可能通過調(diào)控吞噬作用來參與心肌缺血再灌注損傷的病理過程[21]。此外，F(xiàn)cgr2b 是寡聚體Aβ的受體，寡聚體Aβ 會導(dǎo)致在原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中Fcgr2b 聚集增多[22]。Fcgr2b 過表達(dá)則會介導(dǎo)Aβ對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[19]?？傊現(xiàn)cgr1、Fcgr3、Fcgr2b 在神經(jīng)炎癥AD 中的具體機制仍需要進(jìn)一步研究。本研究通過對GSE135999 和GSE144459 數(shù)據(jù)集差異表達(dá)的IRGs 分析表明，在AD 小鼠海馬中，F(xiàn)cgr1、Fcgr3、Fcgr2b 均為上調(diào)基因，在外部數(shù)據(jù)集GSE122063 中人腦組織中得以驗證，并且有較高的診斷效能，因此可能成為AD 發(fā)病過程中神經(jīng)炎癥相關(guān)的關(guān)鍵基因。

Cd14 作為白細(xì)胞分化抗原的一種，主要分布在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面[23]，其生物學(xué)活性主要表現(xiàn)在識別并結(jié)合脂多糖復(fù)合物。Cd14 作為脂多糖受體，可以參與并調(diào)控脂多糖性細(xì)胞反應(yīng)[24]。研究報道，多種損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）可以作用于Cd14，促進(jìn)炎性細(xì)胞分泌促炎因子[22]。Cd14 還作用于RNA 剪接、轉(zhuǎn)運，參與蛋白酶體蛋白質(zhì)的分解過程。Cd14 也被證實與AD 的發(fā)病相關(guān)，其作用機制可能是小膠質(zhì)細(xì)胞表面激活的Cd14 促進(jìn)細(xì)胞攝取Aβ，同時調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，改變腦內(nèi)的炎癥，影響AD 的發(fā)生、發(fā)展[25]。本研究結(jié)果表明Cd14 在AD 小鼠的海馬以及人腦組織中均表現(xiàn)為上調(diào)基因，與之前學(xué)者研究一致[25]。

Ly86 基因所編碼的蛋白質(zhì)為MD-1，它與RP105（Toll 樣受體家族蛋白）相結(jié)合形成免疫復(fù)合物RP105/MD-1，在B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)[26]。有研究猜測Ly86 可能參與免疫功能異常相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)過程[27]。已證實Ly86 基因的DNA 甲基化在肥胖、胰島素抵抗和炎癥中發(fā)揮重要作用[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，MD-1 基因敲除可有效緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪組織炎癥及胰島素抵抗。感染等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)因素可誘導(dǎo)血清和尿液中MD-1 的產(chǎn)生[29]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ly86 在AD 小鼠的海馬和人腦組織中均為上調(diào)基因，其機制還有待研究。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)分析篩選出與AD 炎癥相關(guān)的8 個特征基因，其中5 個關(guān)鍵基因（Fcgr2b、Cd14、Fcgr1、Fcgr3、Ly86）可能成為AD潛在的診斷和治療靶點，其作用機制有待進(jìn)一步探究。本文為探索AD 神經(jīng)炎癥發(fā)生、發(fā)展的分子機制、診斷和治療提供了依據(jù)。