多司馬酯的含量測(cè)定方法探討

付永超

（未名生物醫(yī)藥有限公司，福建 廈門 361009）

多司馬酯（Dosmalfate，又名地奧明七硫酸氫酯鋁）是香葉木甙七硫酸酯的堿式鋁鹽，屬于含鋁的黃酮類化合物，是天然植物成分地奧司明經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造合成的胃黏膜保護(hù)劑，臨床上用于預(yù)防和治療非甾體抗炎藥所致的消化道黏膜損傷[1]。該藥由西班牙Faes公司創(chuàng)制，于2000年首次在西班牙上市。國內(nèi)由湘北威爾曼制藥股份有限公司于2005年上市。

多司馬酯為淡黃色粉末，無臭，幾乎無味，有引濕性。該物質(zhì)在水、甲醇或氯仿中幾乎不溶，在稀鹽酸溶液中易溶，在1 mol/L氫氧化鈉溶液中溶解。多司馬酯英文名稱Dosmalfate[INN]，CAS號(hào)為122312-55-4，分子式為C28H61Al16O79S8，分子量為2 349.96，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單一方法難以準(zhǔn)確測(cè)定并客觀描述其含量，該文采用容量法、高效液相色譜法綜合測(cè)定鋁、硫和香葉木甙七硫酸酯3個(gè)不同官能團(tuán)，使多司馬酯含量測(cè)定結(jié)果更精確，達(dá)到質(zhì)量控制更精準(zhǔn)的目的。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

多司馬酯樣品為實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)分別為001、002和003；鹽酸為市售分析純；硫酸為市售分析純；硝酸為市售分析純；氯化鋇為市售分析純；氯化鎂為市售分析純；氯化銨為市售分析純；三乙醇胺為市售分析純；鉻黑T為市售試劑；氨水為市售分析純；醋酸為市售分析純；醋酸銨為市售分析純；EDTA為市售分析純；二甲酚橙為市售試劑；氯化鋁為市售分析純；乙腈為市售TEDIA色譜純；三乙胺為市售分析純；氟化鈉為市售分析純；香葉木甙七硫酸酯鈉鹽為市售試劑；儀器為島津LC-10A，7725i進(jìn)樣閥（20 μL定量管），紫外檢測(cè)器；Agilent1100，四元梯度泵，柱溫箱，脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器；UV-2501PC紫外分光光度計(jì)。

1.2 研究對(duì)象

研究對(duì)象為多司馬酯化學(xué)結(jié)構(gòu)中的鋁、硫和香葉木甙七硫酸酯3個(gè)官能團(tuán)。

1.2.1 鋁

該物質(zhì)含鋁，鋁是該物質(zhì)主要藥效基團(tuán)之一，是制酸力的主要來源，是重要的質(zhì)量指標(biāo)，現(xiàn)版中國藥典收載鋁的單方復(fù)方藥物有多個(gè)，包括硫糖鋁、氫氧化鋁以及復(fù)方鋁酸鉍片等。其測(cè)鋁的方法都大同小異，以EDTA法測(cè)定，該物品沿用藥典成熟方法，并經(jīng)過驗(yàn)證，其指示劑變色敏銳。

1.2.2 硫

該物質(zhì)含硫，硫的含量也是重要的質(zhì)量指標(biāo)之一，只有生成硫酸酯（鹽）后才能聯(lián)結(jié)上氫氧化鋁，從而發(fā)揮藥效，中國藥典的硫糖鋁中測(cè)定硫的含量，該物質(zhì)也根據(jù)藥典成熟方法測(cè)定硫，測(cè)定原理為絡(luò)合滴定法，硫酸與加入的氯化鋇形成沉淀，過量的鋇以EDTA絡(luò)合滴定，在氯化鋇中加入氯化鎂用以指示終點(diǎn)。反應(yīng)方程如公式（1）～公式（3）所示。

經(jīng)過驗(yàn)證，指示劑變色敏銳，終點(diǎn)易觀察，精密度符合要求。

1.2.3 香葉木甙七硫酸酯

美國藥典（USP）中的硫糖鋁以高效液相色譜法測(cè)定無水蔗糖八硫酸酯，從科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)性考慮，多司馬酯也應(yīng)以高效液相色譜法測(cè)定，證明甙的硫酸酯結(jié)構(gòu)存在，從而證明多司馬酯的正確含量，且含硫酸酯的甙是強(qiáng)陰離子，具有很好的療效，是有效基團(tuán)，應(yīng)予測(cè)定。

1.3 研究方法

1.3.1 鋁的測(cè)定方法

取樣品約1 g，精密稱定，置200 mL量瓶中，加稀鹽酸10 mL溶解后，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取20 mL，加氨試液中和至恰析出沉淀，再滴加稀鹽酸至沉淀溶解為止，加醋酸-醋酸銨（pH6.0）20 mL，再精密加乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05 mol/L）25 mL，煮沸3 min～5 min，放冷至室溫，加二甲酚橙指示液1 mL，用鋅滴定液（0.05 mol/L）滴定至溶液由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，并將滴定的結(jié)果用空白實(shí)驗(yàn)校正。每1 mL乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05 mol/L）相當(dāng)于1.349 mg的鋁。根據(jù)分子式測(cè)算，其鋁含量限度理論值為18.37%。

1.3.2 硫的測(cè)定方法

取該物品約1 g，精密稱定，置燒杯中，加硝酸溶液（1→2）10 mL、水10 mL，緩緩煮沸10 min，加氨試液至堿性后再多加5 mL，煮沸1 min，放冷，移至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用干燥濾紙濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL逐滴加1 mol/L鹽酸溶液至恰呈酸性后，再多加3滴，精密加氯化鋇-氯化鎂溶液（取氯化鋇6 g與氯化鎂5 g，加水溶解并稀釋至500 mL）10 mL，搖勻，放置片刻，加氨-氯化銨緩沖液（pH10.0）15 mL，三乙醇胺（1→2）5 mL與鉻黑T指示劑少量，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05 mol/L）滴定，并將滴定的結(jié)果用空白實(shí)驗(yàn)校正。每1 mL乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05 mol/L）相當(dāng)于1.603 mg的硫。根據(jù)分子式測(cè)算，其硫含量限度理論值為10.92%。

1.3.3 香葉木甙七硫酸酯的測(cè)定方法研究

1.3.3.1 預(yù)試驗(yàn)

1.3.3.1.1 色譜柱的選擇

USP中硫糖鋁使用的色譜柱是測(cè)糖的專用柱，考慮國內(nèi)的國情難以借鑒，經(jīng)過篩選，該文采用十八烷基鍵合硅膠柱。

1.3.3.1.2 流動(dòng)相的選擇

選擇了各種體系的流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)峰型、分離度以及塔板數(shù)等指標(biāo)，最終選定流動(dòng)相為乙腈-水溶液（三乙胺0.28 mL/100 mL，冰乙酸調(diào)pH約7.5）（15∶85）。

1.3.3.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)該物品在流動(dòng)相中的UV掃描結(jié)果確定最大吸收峰處330 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.3.1.4 樣品前處理

根據(jù)中國藥典測(cè)定硫糖鋁中鋁的含量方法，將該物質(zhì)用醋酸-醋酸銨緩沖溶液（pH6.0）溶解后，加入過量的乙二胺四乙酸二鈉溶液（0.05 mol/L），使鋁絡(luò)合。

擬用的方法：取該物質(zhì)細(xì)粉約50 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加醋酸-醋酸銨緩沖溶液（pH6.0）8 mL使溶解，必要時(shí)可微熱或超聲處理，再加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（0.05 mol/L）10 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，作為待測(cè)溶液。

該方法可行，但是在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)這樣處理的樣品對(duì)色譜柱的損傷較大，多次進(jìn)樣后，色譜峰拖尾嚴(yán)重，因此該文對(duì)處理方法進(jìn)行改進(jìn)。改為取本品細(xì)粉約50 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加醋酸-醋酸銨緩沖溶液（pH6.0）8 mL使其溶解，必要時(shí)可以微熱或超聲處理，再加入氟化鈉溶液（2%）10 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為待測(cè)溶液。

該方法根據(jù)氟化鈉在pH5～pH6溶液中與Al3+結(jié)合能力比乙二胺四乙酸二鈉強(qiáng)，因此將乙二胺四乙酸二鈉溶液換成氟化鈉溶液絡(luò)合鋁離子。試驗(yàn)證明該方法處理的樣品色譜峰對(duì)稱性較好，拖尾因子小于1.1，保留時(shí)間適宜，適合多司馬酯的香葉木甙七硫酸酯母環(huán)測(cè)定（如圖1所示）。

圖1 多司馬酯HPLC色譜圖

1.3.3.2 擬定的方法

1.3.3.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱為十八烷基鍵合硅膠柱（ODS），規(guī)格為4.6mm×250mm，粒徑為5 μm。檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。流動(dòng)相為乙腈-水溶液（三乙胺0.28 mL/100 mL，冰乙酸調(diào)pH約為7.5）（15∶85）為流動(dòng)相。重復(fù)進(jìn)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）應(yīng)小于1.5%。理論塔板數(shù)按香葉木甙七硫酸酯峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。各組分峰與主峰分離度應(yīng)符合要求[2]。

1.3.3.2.2 對(duì)照品準(zhǔn)備

該物品采用中間體，即香葉木甙七硫酸酯的鈉鹽（C28H25O36S7Na7，分子量為1 322.86）為對(duì)照品。對(duì)照品的精制方法為甲醇重結(jié)晶；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：HPLC測(cè)定含量為99.0%以上（面積歸一化法），有關(guān)物質(zhì)小于0.5%（HPLC），S%為17.0%以上（滴定法）。該物質(zhì)以C28H25O36S7（分子量為1 161.93）的含量作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)照品用的是香葉木甙七硫酸酯鈉鹽C28H25O36S7Na7（分子量為1 322.86），因此HPLC測(cè)得的是香葉木甙七硫酸酯鈉鹽的含量，折算成香葉木甙七硫酸酯需乘以0.878（1 161.93/1 322.86）。取無水香葉木甙七硫酸酯鈉對(duì)照品約15 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加醋酸—醋酸銨緩沖液（pH6.0）4 mL使其溶解，再加入2%氟化鈉溶液5 mL，加水至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

1.3.3.2.3 供試樣品制備

取樣品細(xì)粉約50 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加醋酸-醋酸銨緩沖溶液（pH6.0）8 mL使溶解，必要時(shí)可以微熱或超聲處理，再加入氟化鈉溶液（2%）10 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為待測(cè)溶液。

1.3.3.2.4 測(cè)定方法

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中含相當(dāng)于香葉木甙七硫酸酯鈉（C28H25Na7O36S7）的量，再乘以0.878即得。

2 結(jié)果

2.1 鋁的測(cè)定結(jié)果

方法學(xué)的精密度試驗(yàn)，同一實(shí)驗(yàn)員以同一批樣品（001）在同一條件下重復(fù)測(cè)定6次，記錄測(cè)得結(jié)果（見表1），其RSD=0.22%，數(shù)據(jù)顯示該試驗(yàn)方法精密度良好。加樣回收率試驗(yàn)，每20 mL樣品溶液中添加灼燒至恒重的氧化鋁（Al2O3）51 mg，相當(dāng)于鋁27 mg，依法測(cè)定6次，測(cè)得的回收率結(jié)果數(shù)據(jù)記錄見表2，顯示平均回收率為99.50%，RSD為0.61%，回收率滿足要求且精密度好。

表1 鋁含量測(cè)定精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 鋁含量測(cè)定加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，該方法測(cè)定結(jié)果精密度、準(zhǔn)確度高，顯色明顯，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，速度快，分析成本不高，適合用于多司馬酯含量測(cè)定。對(duì)多個(gè)不同批號(hào)的樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 3批樣品鋁含量測(cè)定結(jié)果

2.2 硫的測(cè)定結(jié)果

方法學(xué)的精密度試驗(yàn)，同一實(shí)驗(yàn)員以同一批樣品（001）在同一條件下重復(fù)測(cè)定6次，記錄測(cè)得結(jié)果（見表4），其RSD=0.60%，數(shù)據(jù)顯示該試驗(yàn)方法精密度良好。

表4 硫含量測(cè)定精密度試驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率試驗(yàn)，每20 mL樣品溶液中添加相當(dāng)于硫32 mg的香葉木甙七硫酸酯，依法測(cè)定6次，測(cè)得的回收率結(jié)果數(shù)據(jù)記錄見表5，顯示平均回收率99.64%，RSD為0.61%，回收率滿足要求且精密度好。

表5 硫含量測(cè)定加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，測(cè)定硫的方法測(cè)定結(jié)果精密度、準(zhǔn)確度好，顯色明顯，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，速度快，分析成本不高，適合用于多司馬酯含量測(cè)定。對(duì)多個(gè)不同批號(hào)的樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6 3批樣品硫含量測(cè)定結(jié)果

2.3 香葉木甙七硫酸酯的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密稱取對(duì)照品香葉木甙七硫酸酯鈉鹽39.6 mg于25 mL量瓶中，加適量水溶解后，用溶劑（含醋酸-醋酸銨緩沖溶液（pH6.0）16%，氟化鈉溶液（2%）20%的水溶液）稀釋至刻度，從中精密吸取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL及5.0 mL于10 mL量瓶中，用上述溶劑稀釋至刻度，進(jìn)樣量20 μL。進(jìn)樣量與峰面積的線性關(guān)系見表7，顯示線性關(guān)系良好。

表7 線性關(guān)系考察結(jié)果

Y=-100431+164628X

r=1.000

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取同一份樣品連續(xù)測(cè)定6次，記錄測(cè)定結(jié)果見表8，顯示RSD為0.2%，該方法精密度高。

表8 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 加樣回收（準(zhǔn)確度）試驗(yàn)

在樣品中加入香葉木甙七硫酸酯，使用既定方法測(cè)定，測(cè)得回收試驗(yàn)結(jié)果見表9，顯示回收率平均為99.61%，RSD為0.62%，均在可接受范圍內(nèi)。

表9 加樣回收（準(zhǔn)確度）試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 定量限

根據(jù)信噪比10∶1為0.21 μg。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取待測(cè)溶液，室溫放置8 h，并在該時(shí)間段內(nèi)的0 h、1 h、2 h、4 h和8 h取樣測(cè)定，顯示峰面積變化不大，待測(cè)液穩(wěn)定，見表10。

表10 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

綜上所述，經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，該方法測(cè)定結(jié)果精密度、準(zhǔn)確度好，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，適合用于多司馬酯含量測(cè)定。

2.3.6 樣品測(cè)定

取3批供試品按照既定方法測(cè)定，結(jié)果見表11。

表11 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語

多司馬酯用于胃、十二指腸潰瘍的治療，臨床需求廣泛，其分子量大于2 000，含有多個(gè)不同基團(tuán)，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使用單一方法難以準(zhǔn)確測(cè)定并客觀描述其含量，該文針對(duì)其3個(gè)主要特征基團(tuán)鋁、硫和香葉木甙七硫酸酯，采用容量法測(cè)定鋁、硫，使用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定香葉木甙七硫酸酯母環(huán)，考察了容量法的精密度、回收率和HPLC法的線性關(guān)系、精密度、加樣回收率以及穩(wěn)定性，并對(duì)3批樣品進(jìn)行測(cè)定。在多司馬酯含量測(cè)定中，3種方法互相驗(yàn)證，使結(jié)果更精確、更客觀，達(dá)到質(zhì)量控制更精準(zhǔn)的目的。試驗(yàn)結(jié)果證明，該方法可行。該文為準(zhǔn)確測(cè)定多司馬酯的含量提供了理論依據(jù)。