時差成像系統(tǒng)對復(fù)蘇周期單囊胚移植妊娠結(jié)局的影響

姜建喜 孫洪亮 劉春嬌 王雁林 李清春

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 山東 濱州 256603

近年來興起的時差成像系統(tǒng)(time-lapse imaging, TLI)能對胚胎發(fā)育情況進行全程監(jiān)控,可提供大量的胚胎發(fā)育信息,為胚胎篩選提供了新的可能。這項技術(shù)的優(yōu)點是可以記錄胚胎動態(tài)發(fā)育的全過程,無需反復(fù)打開培養(yǎng)箱,為胚胎發(fā)育提供更加穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境[1]。本研究創(chuàng)新性地將同周期同患者的受精卵隨機置于時差成像系統(tǒng)和桌面培養(yǎng)箱中進行卵裂期胚胎培養(yǎng),并對集合培養(yǎng)形成的囊胚首次復(fù)蘇周期移植臨床結(jié)局進行了對比分析,探討時差成像系統(tǒng)培養(yǎng)和篩選胚胎的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2020年7月至2022年1月間,選取在本中心接受體外受精(in vitro fertilization,IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治療的患者,共113個周期,將同一周期同一患者獲得的受精卵隨機分成兩組進行卵裂期胚胎培養(yǎng),實驗A組(113周期) 為受精卵置于時差成像系統(tǒng)中,對照B組(113周期)為受精卵置于桌面培養(yǎng)箱中;進一步對上述兩組無新鮮周期移植、并第一次行復(fù)蘇周期單囊胚移植(第五天優(yōu)質(zhì)囊胚)的患者分組比較,實驗C組(42周期)來源于實驗A組的患者,對照D組(33周期)來源于對照B組的患者。排除因素:成熟卵子數(shù)(MII卵數(shù))<5 個;行補救卵胞漿內(nèi)單精子注射(rescue-intracytoplasmic sperm injection,R-ICSI)。

1.2 實驗方法

1.2.1 胚胎培養(yǎng) 本中心全部患者采用常規(guī)促排卵方案,注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)36 h后行卵泡穿刺術(shù),將獲得的卵冠丘復(fù)合物(oocyte coroma cumulus complex,OCCC)置于G-IVF培養(yǎng)液中等待受精。注射hCG后39～40 h進行常規(guī)受精或ICSI,精卵共孵育4～5 h后脫顆粒。ICSI后的卵子隨機轉(zhuǎn)移至含G-1的35 mm培養(yǎng)皿液滴中和含G-1的Culture Coin專用培養(yǎng)皿中;而常規(guī)受精后的卵子繼續(xù)置于含G-IVF的四孔皿中過夜,受精后約18 h評估原核,再將受精卵隨機轉(zhuǎn)移至兩種培養(yǎng)皿中。G-1培養(yǎng)皿置于桌面培養(yǎng)箱(COOK公司)培養(yǎng),含G-1的Culture Coin專用培養(yǎng)皿置于時差成像系統(tǒng)(ESCO公司)中培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境均為37℃、6%CO2、5%O2。

1.2.1.1 時差成像系統(tǒng)培養(yǎng) 本研究使用ESCO Miri TL時差成像系統(tǒng),圖像采集頻率為10 min/次,每小時進行一次7個等焦距平面掃描。培養(yǎng)采用14孔Culture Coin專用培養(yǎng)皿,每孔均有標(biāo)記。第3天對胚胎進行常規(guī)形態(tài)學(xué)評分,待胚胎移植或冷凍后,將剩余胚胎移出,移入含G-2的35 mm培養(yǎng)皿液滴中進行集合培養(yǎng),置于桌面培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至第5～6天,對囊胚進行常規(guī)形態(tài)學(xué)評級。

1.2.1.2 桌面培養(yǎng)箱培養(yǎng) 第3天對胚胎處理方式及囊胚培養(yǎng)方式同時差成像系統(tǒng)。

1.2.2 胚胎評分標(biāo)準(zhǔn) 受精后第3天(D3)對卵裂期胚胎進行形態(tài)學(xué)評分,根據(jù)分裂速度和碎片比例分為4個等級,分別為:Ⅰ級,胚胎發(fā)育速度正常,卵裂球大小、數(shù)目均等,胞質(zhì)均勻、無空泡,碎片不超過5%;Ⅱ級,胚胎發(fā)育速度正常,卵裂球大小、數(shù)目均等或大致均等,胞質(zhì)均勻、無空泡,碎片6%～20%;Ⅲ級,胚胎發(fā)育速度大致正常,卵裂球大小、數(shù)目均勻或不均勻,胞質(zhì)有少量空泡,碎片21%～50%;Ⅳ級,胚胎發(fā)育速度異常,卵裂球大小、數(shù)目不均等,胞質(zhì)不均勻、有大量空泡,碎片大于50%。以上Ⅰ、Ⅱ級胚胎統(tǒng)稱為優(yōu)質(zhì)胚胎,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級胚胎統(tǒng)稱為可利用胚胎。

1.2.3 囊胚評級 受精后第5～6天對囊胚進行評級,根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵化將囊胚的發(fā)育分為6期,其中3期及以上囊胚根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目進行分級,分為A、B、C 3級,將3期及3期以上評分為AA、AB、BA、BB的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚,將3期及3期以上評分為AA、AB、BA、BB、BC的囊胚定義為可利用囊胚。內(nèi)細(xì)胞團及滋養(yǎng)層細(xì)胞不同時含C的囊胚均冷凍保存。

1.2.4 囊胚冷凍、復(fù)蘇和移植 所有可用囊胚使用商品化的冷凍和復(fù)蘇液,按照試劑盒說明書進行囊胚的冷凍和復(fù)蘇。分析納入研究的113周期患者冷凍囊胚復(fù)蘇情況,選擇第一次行復(fù)蘇周期第五天(D5)單優(yōu)質(zhì)囊胚移植的患者進行分組,最終實驗C組納入42周期,對照D組納入33周期。所有復(fù)蘇周期均采用人工周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜。復(fù)蘇后囊胚轉(zhuǎn)入G-2培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h后等待移植。入組要求:第一次復(fù)蘇胚胎移植、移植1枚第5天囊胚、囊胚評級≥4 BB;截止到2022年1月25日。

1.3 觀察指標(biāo) 主要的觀察指標(biāo)為2PN卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率。2PN卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN數(shù)×100%;D3優(yōu)質(zhì)胚胎率=D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%;囊胚形成率=3期及3期以上囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數(shù)×100%;可利用囊胚形成率=可利用囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數(shù)×100%;臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;流產(chǎn)率=早期自然流產(chǎn)患者數(shù)/臨床妊娠患者數(shù)×100% 。臨床妊娠是以移植后5 w通過超聲檢查探及宮內(nèi)孕囊為標(biāo)準(zhǔn)。早期自然流產(chǎn)是指臨床妊娠12 w之前的妊娠丟失。

2 結(jié)果

2.1 新鮮周期實驗室指標(biāo)的比較 同一患者同一周期受精卵隨機分組培養(yǎng),根據(jù)不同受精方式和年齡進行分層比較,結(jié)果顯示,A組和B組在2PN卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率方面比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1、2、3。因為 ICSI方案、年齡>35歲的僅有2周期,所以兩組間未進行統(tǒng)計學(xué)分析。

表1 IVF方案、年齡≤35歲,A組和B組患者實驗室指標(biāo)的比較/%

表2 IVF方案、年齡>35歲,A組和B組患者實驗室指標(biāo)的比較 /%

表3 ICSI方案、年齡≤35歲,A組和B組患者實驗室指標(biāo)的比較/%

2.2 復(fù)蘇周期妊娠結(jié)局的比較 對納入研究的75個復(fù)蘇周期患者進行隨訪,實驗C組與對照D組患者年齡、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度及流產(chǎn)率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。但實驗C組臨床妊娠率和著床率顯著高于對照D組,P<0.05,見表4。

表4 C組和D組患者一般情況及妊娠結(jié)局的比較/%

3 討論

生理狀態(tài)下,胚胎在體內(nèi)處于恒溫、恒濕、低氧、避光的環(huán)境,為了模擬體內(nèi)胚胎的培養(yǎng)環(huán)境,良好穩(wěn)定的培養(yǎng)箱對體外胚胎培養(yǎng)至關(guān)重要。目前大多數(shù)中心仍然采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)箱,可為配子和胚胎發(fā)育提供理想的溫度、濕度和氣體濃度[2]。然而,由于需要頻繁打開培養(yǎng)箱評估胚胎發(fā)育情況,使得胚胎長期暴露于培養(yǎng)箱外,會改變胚胎培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度及氣體濃度。時差成像培養(yǎng)系統(tǒng)的引入,使胚胎觀察和評分無需再將胚胎從培養(yǎng)箱中取出,從而在胚胎發(fā)育期間保持穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境[3]。

多數(shù)研究認(rèn)為,與傳統(tǒng)培養(yǎng)箱相比,時差成像系統(tǒng)的應(yīng)用有利于胚胎發(fā)育和改善妊娠結(jié)局[4-8],但其他研究[9-12]認(rèn)為兩者之間并無顯著差異。目前多數(shù)研究為回顧性分析,旨在比較傳統(tǒng)培養(yǎng)箱和時差成像系統(tǒng)兩組間培養(yǎng)效果的差異。本研究將同一患者同一周期的受精卵隨機置于兩種培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),有效地控制了患者的基本情況,消除了兩組間基線資料的差異,對兩組間培養(yǎng)效果進行了前瞻性的分析。另外,本研究根據(jù)不同受精方式和不同年齡進行分層分析,發(fā)現(xiàn)兩組間2PN卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率方面均無統(tǒng)計學(xué)差異。王世凱等[13]研究認(rèn)為,TL組(time-lapse 培養(yǎng)組)的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于CO組(常規(guī)培養(yǎng)組)(45.21% vs 41.92%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但兩組間在2PN卵裂率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。高洋等[14]研究認(rèn)為TLI系統(tǒng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)間的2PN卵裂率、囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率比較無顯著性差異。這兩個研究均未按照受精方式和年齡的不同進行詳細(xì)的分層分析,可能造成研究結(jié)果的偏倚。紀(jì)冰等[15]將TLI培養(yǎng)的473個IVF周期和同期行常規(guī)培養(yǎng)的347個IVF周期作為研究對象,每組中按年齡分為<37歲組和≥37歲組,比較兩組間卵裂率和優(yōu)質(zhì)囊胚率等均無差異,與本研究的研究思路相似,研究結(jié)論一致。

由于納入研究的113個周期患者新鮮胚胎移植病例數(shù)較少,也為了減少新鮮胚胎周期卵巢刺激、血激素水平[16]及內(nèi)膜因素[17]的干擾,本研究對這些患者的復(fù)蘇周期胚胎移植情況進行了隨訪,并且將研究對象限定為:第一次復(fù)蘇周期移植、單個優(yōu)質(zhì)D5囊胚。充分考慮到了凍胚移植次數(shù)、移植胚胎數(shù)目、移植胚胎天數(shù)、移植胚胎形態(tài)等混雜因素對結(jié)果的影響,降低了研究偏倚。本研究發(fā)現(xiàn),實驗C組臨床妊娠率和種植率顯著高于對照D組(83.33% vs 60.61%),而流產(chǎn)率間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與高洋等[14]的研究結(jié)論較為一致。

本研究創(chuàng)新之處在于將同一患者同一周期的胚胎隨機分組培養(yǎng),前瞻性的研究并按照受精方式和年齡分層分析兩組間培養(yǎng)效果的差異。另外,復(fù)蘇囊胚移植周期中,限定了移植次數(shù)、移植胚胎數(shù)目、移植胚胎天數(shù)、移植胚胎形態(tài)等因素,盡量減少混雜因素的干擾,使兩組間妊娠結(jié)局比較更具有可信性。

本研究也存在不足之處,首先,為了比較兩種不同培養(yǎng)體系在同一胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)下,培養(yǎng)效果及妊娠結(jié)局方面的差異,本研究時差成像系統(tǒng)胚胎評分仍采用形態(tài)學(xué)評分的方法,未同時結(jié)合胚胎發(fā)育動力學(xué)參數(shù)篩選胚胎,未能發(fā)揮出該系統(tǒng)在胚胎發(fā)育動力學(xué)、卵裂模式分析等方面的優(yōu)勢。其次,本研究中時差成像系統(tǒng)僅進行了卵裂期胚胎培養(yǎng),囊胚培養(yǎng)全部在桌面培養(yǎng)箱中進行,并按照同一來源胚胎同一液滴集合培養(yǎng),這也可能會對結(jié)果分析產(chǎn)生影響。再次,本研究納入的樣本數(shù)較少,下一步在積累足夠數(shù)量病例的前提下,逐步構(gòu)建本實驗室的胚胎評價體系和移植胚胎模型,便于快速有效的選擇胚胎。

綜上所述,時差成像系統(tǒng)確實能提供較為穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境,并能對胚胎進行動態(tài)評估,提高胚胎的優(yōu)選和鑒別能力,可能改善患者的妊娠結(jié)局。