地黃飲子對(duì)缺血性腦卒中的血管新生作用及機(jī)制研究

王欣宇 孟維然 徐曉艷 李麗婭 閆 超 葉 蕾 宮健偉

1 濱州醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003;2 濰坊市中醫(yī)院 山東 濰坊 261000

腦卒中是臨床中老年人常見(jiàn)的一種腦血管疾病,同時(shí)也是當(dāng)前患者死亡的首要原因。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種,其中缺血性腦卒中患者數(shù)占腦卒中總數(shù)的80%[1]。缺血性腦卒中,又名腦梗死,其最基本的病理過(guò)程是局部缺血導(dǎo)致的腦組織供氧嚴(yán)重不足,常由與腦組織供血的相關(guān)動(dòng)脈血管發(fā)生閉塞引起。對(duì)于該病的臨床治療,西醫(yī)主要采取血管再通、改善腦循環(huán)、促進(jìn)血管及神經(jīng)再生以及置入動(dòng)脈支架等措施。其中藥物溶栓是目前最有效的治療方法,然而藥物溶栓受到缺血/再灌注損傷潛在損害的限制[2-3]。地黃飲子,為民間名方,其有效成分主要為熟地黃、山茱萸、巴戟天、肉蓯蓉、炮附子、石斛、肉桂、五味子、茯苓、麥冬、遠(yuǎn)志、石菖蒲、 生姜、大棗等。研究表明,地黃飲子具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、促腦血管組織重構(gòu)等作用,為腦卒中的治療提供了新方法[4-6]。

血管新生在恢復(fù)腦組織的氧供方面具有明確的作用[7]。血管新生是毛細(xì)血管網(wǎng)再生的一種,它是在原血管的解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行的,其主要實(shí)現(xiàn)方式是血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂與再生,使其功能與局部需要相適應(yīng)的生物學(xué)過(guò)程[8-9]。因此,血管新生與缺血性腦卒中之間聯(lián)系的分子機(jī)制值得更為深入的研究。在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中炎癥反應(yīng)與血管新生都屬于為抵抗損傷所形成的防御機(jī)制,兩者在腦缺血再灌注生理病理過(guò)程中關(guān)系密切。課題組前期從多角度驗(yàn)證了地黃飲子對(duì)腦缺血的腦保護(hù)作用[10]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)在腦缺血模型大鼠腦組織中,應(yīng)用地黃飲子可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的釋放和表達(dá),并且可以有效地促進(jìn)腦缺血再灌注模型大鼠腦組織缺血區(qū)域的血管新生[11]。然而地黃飲子促進(jìn)腦缺血血管新生的作用機(jī)制尚不明確。本研究采用氧糖剝離再灌注(oxygen glucose stripping reperfusion,OGD/R)細(xì)胞損傷模型和缺血/再灌注損傷大鼠模型,觀察地黃飲子促進(jìn)細(xì)胞增殖和對(duì)血管新生的作用,探討其對(duì)大腦保護(hù)作用的機(jī)制,為臨床應(yīng)用地黃飲子治療腦缺血疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 PC12細(xì)胞由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)買(mǎi)實(shí)驗(yàn)性SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,8周齡,體質(zhì)量控制在(250±50)g,由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為1107261911003054,許可證號(hào)為SCXK(魯)20190003。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 地黃飲子按原方比例(熟地黃、山茱萸、巴戟天、肉蓯蓉、炮附子、石斛、肉桂、五味子、茯苓各30 g,麥冬、遠(yuǎn)志、石菖蒲各15 g, 生姜3片、大棗2枚)配伍(山東省濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門(mén)診部中藥房)提供,藥物用10倍量和8倍量的水煎煮2次,每次1 h,合并水煎液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,于 4 ℃恒溫冰箱保存。水合三氯乙醛(北京百靈威科技有限公司),用生理鹽水配置為10%水合氯醛、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物公司)、Western blot凝膠試劑盒、彩虹marker(北京索萊寶科技有限公司)、鼠抗β-actin多克隆抗體(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)、兔抗PI3K單克隆抗體、兔抗p-PI3K多克隆抗體、兔抗AKT多克隆抗體、兔抗p-AKT多克隆抗體、兔抗eNOS多克隆抗體、兔抗p-eNOS單克隆抗體(艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司)、兔抗VEGF多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、青-鏈霉素混合液(100×)、無(wú)糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)、胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)、胰蛋白酶-EDTA消化液(南京康成生物園)、二甲基亞砜(永力學(xué)試劑有限公司)、EdU試劑盒 (北京全式金生物技術(shù)有限公司)、MTT試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(西班牙TELSTAR公司)、CO2培養(yǎng)箱、三氣培養(yǎng)箱(美國(guó)THERMO公司)、熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、高內(nèi)涵(美谷分子儀器(上海)有限公司)、電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(南京建成儀器公司)、離心機(jī)(上海博翎精銳設(shè)備有限公司)、高壓蒸汽滅菌器(松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社)、低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG Labtech)蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó) Bio-Rad 公司。

1.5 造模方法

1.5.1 PC12細(xì)胞OGD造模方法 先用胰蛋白酶消化收集PC12細(xì)胞,根據(jù)種板所需總液體量,將細(xì)胞濃度稀釋至5×104/mL。在96孔板最外圍一周每孔加入200 μL PBS防止邊際效應(yīng),其余實(shí)驗(yàn)孔中加入細(xì)胞懸液,每孔100 μL,于細(xì)胞工作超凈臺(tái)中靜置穩(wěn)定10 min,種板后于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,貼壁結(jié)束后每孔換為無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)液100 μL,于三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,制備細(xì)胞OGD模型。

1.5.2 大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉再灌注損傷(bilateral common carotid artery occlusion reperfusion ischemic injury,BCCAO/R)模型的制備 SD大鼠術(shù)前禁食12 h。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,仰臥位固定,備皮后切開(kāi)頸前皮膚,暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈,并將其與迷走神經(jīng)分離,用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈30 min,造成大鼠急性腦缺血。30 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾再灌注30 min,30 min后再次用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈30 min,松開(kāi)后縫合結(jié)束模型制備。整個(gè)手術(shù)造模過(guò)程,均用浸有溫?zé)嵘睇}水的紗布覆蓋切口表面。

1.6 分組及給藥 PC12細(xì)胞設(shè)定組別為正常組(對(duì)照組和地黃飲子80 μg/mL組)和模型組(OGD/R模型組和OGD/R模型+地黃飲子80 μg/mL組)。雄性SD大鼠50只,飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,分別為假手術(shù)組,模型組,地黃飲子低、中、高劑量(8、16、32 g·kg-1)組,每組10只。

1.7 實(shí)驗(yàn)方法

1.7.1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率 分組處理結(jié)束后,將96孔板取出,給藥組每孔加入200 uL PBS潤(rùn)洗1遍以防止藥物著色的影響,然后加入新鮮的完全培養(yǎng)液200 μL 。在避光條件下所有實(shí)驗(yàn)孔每孔加入20 μL MTT液體,于37℃培養(yǎng)箱中孵育3 h。孵育結(jié)束后,在避光情況下,用移液器輕輕吸除各孔內(nèi)的液體,然后150 μL/孔DMSO排槍加入,振蕩器震蕩10 min,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值。

按照如上公式計(jì)算PC12細(xì)胞的增殖率,以地黃飲子的濃度為X軸,PC12細(xì)胞的增殖率為Y軸畫(huà)出線性回歸曲線。

1.7.2 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 消化離心收集細(xì)胞,在兩組6孔板中加入細(xì)胞懸液。24 h貼壁完成后,正常組于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。模型組換為無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)液于三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,建立細(xì)胞OGD/R模型。加藥完成后,靜置穩(wěn)定15 min,然后放回正常培養(yǎng)箱24 h。最后,于倒置顯微鏡下觀察,并用高內(nèi)涵拍照記錄。

1.7.3 EdU染色檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞率 按照不同實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞,完成后進(jìn)行EdU染色。EdU工作液發(fā)揮作用后,PBS 1 mL潤(rùn)洗細(xì)胞2遍,再固定15 min。固定結(jié)束,用配比好的細(xì)胞通透液于室溫環(huán)境通透時(shí)間15 min。向兩組6孔板中每孔加入染色工作液1.2 mL,于室溫環(huán)境避光條件處理30 min。再向兩組6孔板每孔加入1.2 mL Hoechst反應(yīng)液,于室溫環(huán)境避光條件處理15 min。最后,將6孔板放于熒光倒置顯微鏡下觀察,并用高內(nèi)涵拍照記錄。

1.7.4 Western blot法檢測(cè)蛋白水平 用含有蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白,采用BCA法測(cè)量蛋白濃度。蛋白變性后,恒壓 SDS-PAGE,半干法轉(zhuǎn)膜PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h,Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜,Ⅱ抗室溫孵育1 h,每一步孵育后均使用TBST洗膜15 min×3 次。ECL發(fā)光檢測(cè),用Image J軟件測(cè)量圖像灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 地黃飲子對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響 MTT法通過(guò)增殖率的計(jì)算,結(jié)果顯示,在正常培養(yǎng)條件下,與對(duì)照組相比,不同濃度的地黃飲子(10、20、40、80、160、320、640 μg/mL)劑量組增殖率顯著升高(P<0.05 或P<0.01)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,篩選出給藥濃度為80 μg/mL,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度地黃飲子處理24 h后PC12細(xì)胞活力的變化(n=3)

2.2 OGD/R模型對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響 MTT法檢測(cè)細(xì)胞OGD/R模型增殖率,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,2、4、6、8 h模型組增殖率顯著降低(P<0.05或P<0.01)。OGD損傷時(shí)間與細(xì)胞增殖率呈反比,OGD損傷時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞增殖率逐漸降低,OGD/R模型損傷了細(xì)胞的活力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,最終篩選OGD損傷時(shí)間為4 h,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同OGD損傷時(shí)間對(duì)PC12細(xì)胞細(xì)胞活力的變化(n=3)

2.3 地黃飲子對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):正常組細(xì)胞形態(tài)呈梭型,與對(duì)照組比較,地黃飲子80 μg/mL組細(xì)胞數(shù)量增多;與正常組比較,模型組細(xì)胞形態(tài)皺縮,細(xì)胞數(shù)量減少,其中OGD/R模型組細(xì)胞形態(tài)明顯皺縮,細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見(jiàn)圖3。

圖3 顯微鏡下觀察地黃飲子對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

2.4 地黃飲子對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響 EdU染色顯示細(xì)胞增殖能力。與對(duì)照組比較,地黃飲子80 μg/mL組藍(lán)色、黃色熒光數(shù)量增加,EdU陽(yáng)性率占比增加(P<0.05,P<0.01)。與正常組比較,模型組藍(lán)色熒光、黃色熒光減少,EdU陽(yáng)性率占比減少(P<0.05,P<0.01),與OGD/R模型組比較,OGD/R模型+地黃飲子80 μg/mL組藍(lán)色、黃色熒光明顯減少,EdU陽(yáng)性率占比減少明顯,P<0.01。見(jiàn)圖4。

A. PC12細(xì)胞EdU染色熒光圖像;B. PC12細(xì)胞EdU染色熒光定量圖(n=3)。

2.5 地黃飲子對(duì)PC12細(xì)胞通路相關(guān)蛋白的影響 Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,地黃飲子80 μg/mL組PI3K、AKT、eNOS蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與對(duì)照組比較,OGD/R模型組PI3K、AKT、eNOS蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,p-AKT蛋白表達(dá)降低(P<0.05),p-PI3K、p-eNOS蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與OGD/R模型組比較,OGD模型組+地黃飲子80 μg/mL組PI3K、AKT、eNOS蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

A. PI3K和p-PI3K、AKT和p-AKT、eNOS和p-eNOS蛋白條帶;B.PI3K和p-PI3K蛋白檢測(cè)結(jié)果定量分析;C. AKT和p-AKT蛋白檢測(cè)結(jié)果定量分析;D. eNOS和p-eNOS蛋白檢測(cè)結(jié)果定量分析。

2.6 地黃飲子對(duì)大鼠腦組織通路相關(guān)蛋白及VEGF表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示,地黃飲子中劑量組p-PI3K蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01),p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)升高(P<0.05),地黃飲子低、高劑量組p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織VEGF表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,地黃飲子各劑量組大鼠腦組織VEGF表達(dá)升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

A.PI3K和p-PI3K、AKT和p-AKT、eNOS和p-eNOS、VEGF蛋白條帶;B.VEGF蛋白檢測(cè)結(jié)果定量分析;C.AKT和p-AKT蛋白檢測(cè)結(jié)果定量分析;D.PI3K和p-PI3KT蛋白檢測(cè)結(jié)果定量分析;E.eNOS和p-eNOS蛋白檢測(cè)結(jié)果定量分析。

3 討論

缺血性腦卒中因致殘率高且發(fā)病急,已然成為現(xiàn)代社會(huì)中老年人不可避免的健康隱患。腦卒中的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,且影響因素眾多,治療效果也不理想。通過(guò)藥物溶栓或者手術(shù)取栓實(shí)現(xiàn)局部血管再灌注,可以減緩阻塞程度,但由于再通時(shí)間短暫且不能根治,導(dǎo)致再灌注損傷,造成更嚴(yán)重的后果。采用地黃飲子從腦卒中的病理機(jī)制出發(fā),從根本上解決腦卒中的危害。從促血管新生的角度出發(fā),構(gòu)建血液循環(huán)通路,從而減輕腦卒中局部血流受阻的影響。

血管新生是指根據(jù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)方式形成新的血管的一種生物學(xué)過(guò)程[12]。血管新生的調(diào)控因子與通路多種多樣,其中胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K) /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(amino acid threonine protein kinase,AKT)[13]通路是目前研究較明確的缺血后促進(jìn)血管新生的機(jī)制之一。PI3K 可以使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化[14]。PI3K細(xì)胞外活化信號(hào)來(lái)源于多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物,如VEGF等[15]。PI3K與AKT之間的鏈接涉及磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(Phosphatidylinositol 4,5-diphosphate,PIP2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-二磷酸(Phosphatidylinositol 3,4,5-diphosphate,PIP3)2個(gè)代謝物。首先PI3K加一個(gè)3位磷酸基團(tuán)后使PIP2磷酸化為PIP3,PIP3充當(dāng)?shù)诙攀箤⒘姿峒〈家蕾?lài)性蛋白激酶-1(phosphoinositidedependen tkinase-1,PDK1)和AKT聚集到細(xì)胞膜上[16]。AKT被認(rèn)為是PI3K/AKT信號(hào)通路的中樞介質(zhì),是PI3K的下游靶點(diǎn)。接下來(lái)PDK1、PDK2分別磷酸化AKT蛋白上的不同位點(diǎn)Thr308和Ser473,AKT激活啟動(dòng)發(fā)揮效益[17]。AKT進(jìn)一步通過(guò)磷酸化最終導(dǎo)致一些下游靶標(biāo)如內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endotheLiaL nitric oxidesynthase,eNOS)的磷酸化的發(fā)生,進(jìn)而參與血管新生[18]。另一方面,PI3K/AKT通路的激活又刺激VEGF的表達(dá)升高。地黃飲子對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)的PI3K、AKT和eNOS總蛋白的表達(dá)并沒(méi)有明顯的影響。但是研究發(fā)現(xiàn)OGD/R細(xì)胞模型損傷下p-PI3K、p-AKT和p-eNOS蛋白表達(dá)降低,同時(shí)正常組地黃飲子給藥處理以及OGD/R模型組地黃飲子給藥處理后p-PI3K、p-AKT和p-eNOS蛋白表達(dá)升高,地黃飲子促進(jìn)了PI3K、AKT和eNOS磷酸化蛋白的表達(dá)。與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相同,地黃飲子對(duì)大鼠腦組織中的PI3K、AKT和eNOS總蛋白的表達(dá)并沒(méi)有明顯的影響,但是在腦缺血再灌注模型損傷下p-PI3K、p-AKT和p-eNOS蛋白表達(dá)降低,同時(shí)地黃飲子低、中高劑量給藥處理后p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白以及VEGF表達(dá)逐漸升高,這提示地黃飲子促進(jìn)了PI3K、AKT和eNOS磷酸化以及VEGF的表達(dá)。綜上所述,地黃飲子發(fā)揮促腦缺血再灌注血管新生的作用。

本研究運(yùn)用了大鼠模型模擬疾病的發(fā)生。大鼠腦缺血再灌注模型一直是人腦卒中損傷模型研究中的常用疾病模型[19-23]。在體實(shí)驗(yàn)?zāi)X缺血再灌注模型的制備中,齊磊等[24]使用改良線栓法研究丙泊酚對(duì)腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用以及PKA/CREB通路進(jìn)行了驗(yàn)證。方曉艷等[25]使用結(jié)扎法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。但是由于老鼠品系、個(gè)人解剖手法等的影響[26],模型制備的靈活度、成功率以及穩(wěn)定性存在較大的差異。本研究在令狐艷等[27]夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈方法的基礎(chǔ)上調(diào)整了動(dòng)脈夾閉、再灌注時(shí)間為30 min進(jìn)行大鼠腦缺血再灌注模型的制備。該方式靈活高效的同時(shí)又保證較高的成功率與大鼠存活率,為進(jìn)一步觀察地黃飲子對(duì)大鼠腦缺血再灌注的干預(yù)作用奠定基礎(chǔ)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,本研究通過(guò)改變細(xì)胞的培養(yǎng)條件,將高糖完全培養(yǎng)基換為無(wú)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基,正常培養(yǎng)箱換為三氣培養(yǎng)箱對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行OGD細(xì)胞缺氧缺糖模型的制備。氧糖剝奪OGD模型近年來(lái)被用于細(xì)胞水平的人腦卒中損傷模型研究中[28]。李麗麗等[29]通過(guò)對(duì)PC12細(xì)胞建立OGD損傷模型發(fā)現(xiàn)知母須根總皂苷對(duì)OGD損傷下PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究中首先進(jìn)行了不同OGD造模時(shí)間的研究。研究發(fā)現(xiàn)2 h OGD造模時(shí)間下細(xì)胞基本無(wú)損傷,恢復(fù)正常培養(yǎng)條件后,細(xì)胞迅速恢復(fù);8 h及以上OGD造模時(shí)間下細(xì)胞損傷嚴(yán)重,恢復(fù)正常培養(yǎng)條件后,細(xì)胞難以進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性,選擇地黃飲子給藥濃度為80 μg/mL與4 h OGD造模時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本研究從促血管新生層面對(duì)地黃飲子治療缺血性腦卒中及腦保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討,取得了較為滿意的結(jié)果。下一步將在此研究基礎(chǔ)上,從構(gòu)建血管和神經(jīng)細(xì)胞再生等相關(guān)信號(hào)通路等更深層次開(kāi)展研究,以期揭示地黃飲子治療缺血性中風(fēng)的深刻內(nèi)涵,為臨床上合理應(yīng)用地黃飲子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。