基于整合藥理學(xué)及正交試驗優(yōu)選助孕I號直腸導(dǎo)入方的提取工藝研究

黃金珠，袁強(qiáng)華，周航，劉莉，夏宛廷▲，曾倩▲

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072；3.成都中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137）

補(bǔ)腎活血“助孕I號方” （國家發(fā)明專利：ZL2014 1 0390113.7）是國家重點學(xué)科成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)婦科團(tuán)隊不孕方向?qū)W術(shù)帶頭人、四川省名中醫(yī)曾倩主任醫(yī)師基于中醫(yī)“腎主生殖”藏象理論結(jié)合三十余年臨證經(jīng)驗，以補(bǔ)腎活血法所立助孕臨床協(xié)定方。該方由《攝生眾妙方》五子衍宗丸化裁而成，由續(xù)斷、丹參、菟絲子、枸杞子、覆盆子、山藥、絲瓜絡(luò)、山楂8味藥組成。補(bǔ)腎精佐以活血，補(bǔ)中有行，諸藥合用共奏補(bǔ)腎填精，活血通絡(luò)之功效。直腸導(dǎo)入法能有效避免肝腸循環(huán)，增加盆腔局部血藥濃度，是治療婦科疾病效優(yōu)、直接的給藥途徑。研究團(tuán)隊?wèi)?yīng)用助孕I號方水煎藥液直腸導(dǎo)入治療腎虛血瘀不孕癥/輔助生殖技術(shù)失敗患者數(shù)千例（年使用2 000余次），結(jié)果顯示可有效改善子宮內(nèi)膜容受性、提高自然妊娠率及臨床妊娠率。

水煎提取是中藥復(fù)方臨床應(yīng)用最為傳統(tǒng)及廣泛的形式，中藥復(fù)方水煎煮提取有效性需得到充分驗證，現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑工藝研究常以多種成分含量或提取率為評價指標(biāo)，并結(jié)合現(xiàn)代數(shù)據(jù)分析方法來優(yōu)選提取工藝參數(shù)，但由于缺乏相應(yīng)的藥效學(xué)試驗驗證，導(dǎo)致處方的開發(fā)應(yīng)用出現(xiàn)偏差［1］。本研究以處方的臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，再結(jié)合現(xiàn)代藥物制劑研究的定量分析及藥理研究手段，將有利于中藥復(fù)方制劑研究的標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)而促進(jìn)中藥臨床經(jīng)驗方向的成果轉(zhuǎn)化?；谂R床應(yīng)用基礎(chǔ)，以水為提取溶媒，首先采用HPLC-MS/MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測篩選本方核心活性成分；再采用正交試驗法，以丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量及干膏率為指標(biāo)進(jìn)行綜合加權(quán)評分，確定本方的最佳水提工藝參數(shù)；再以腎虛血瘀-子宮內(nèi)膜容受性不良（RDBS-PER）模型大鼠的藥效學(xué)試驗驗證助孕I號直腸導(dǎo)入方水提物的療效，為下一步研究開發(fā)提供依據(jù)，研究思路框架見圖1。

圖1 研究思路框架

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC色譜儀（Agilent 1260），Agilent；電子天平（BP211D型），Sartorius；數(shù)控超聲波提取器（KH-250B型），昆山和創(chuàng)；數(shù)字控溫電熱套（98-1-C型），電熱恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ型），泰斯特；恒溫培養(yǎng)箱（YZB/USA1802-2009型），Thermo；高速低溫臺式離心機(jī)（型號：5424R），Eppendorf；酶標(biāo)儀（Synergy H1MF型），BioTek；顯微鏡（ECLIPSE Ci型），日本尼康株式會社等；數(shù)字切片掃描儀（VS200型），OLYM-PUS。

1.2 實驗動物

購買無特定病原體動物（SPF）級SD雌性大鼠，體質(zhì)量（220±10）g，共80只，SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量 （240±10）g（用于交配實驗），實驗動物購買合格證號：SCXK（川）2020-030，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2020-124。實驗方案符合動物實驗倫理要求，動物倫理審批號：2019DL-006。

1.3 藥材、試劑與樣品

1.3.1 中藥飲片與對照品

酒續(xù)斷 （批號：1901043），丹參 （批號：1905089），鹽大菟絲子（批號：1811023），鹽覆盆 子 （批 號：1903029）， 枸 杞 子 （批 號：1904004），山藥（批號：1903077），山楂（批號：1903043），絲瓜絡(luò)（批號：1903056），上述飲片均購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司，符合《中國藥典》2020年版相關(guān)規(guī)定；丹酚酸B（Salvianolic Acid B）對照品 （批號：111562-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：94.1%）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ（Dipsacoside VI）對照品（批號：111685-201707，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：90.9%），上述對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.3.2 試劑

雌二醇（E2）、孕酮（P）、D2聚體（D-Dimer）的ELISA試劑盒（貨號F15321、F16576、F15820，均購于上海西唐）；E-鈣黏蛋白（E-cad），兔多克隆抗體，1∶100（濃度），ER63312，華安生物；IGFBP-1，兔克隆抗體，1∶50（濃度），ER1091-37，華安生物；蘇木精染色液；伊紅染色液；戊二醛；PBS；PMA；Fix＆Perm Kit固定破膜劑；Flow cytometry Staining buffer；流式染色緩沖液。

2 方法

2.1 HPLC-MS/MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)預(yù)測篩選助孕I號方活性成分

成分獲?。哼x取助孕I號方按臨床常用煎煮方法提取后，取50 mg于2.0 mL離心管中，加800μL 80%甲醇，65 HZ，渦旋振蕩充分混勻；4℃超聲30 min；于－20℃靜置1 h；于4℃，12 000 rpm下離心15 min（離心力×3 000 g）；移取200μL上清，加入內(nèi)標(biāo)0.14 mg/mL二氯苯丙氨酸5μL，混勻后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中。使用LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行檢測。色譜分離條件：柱溫為40℃；流速0.3 mL/min；流動相組成A：水+0.05%甲酸，B：乙腈；進(jìn)樣量：5μL，自動進(jìn)樣器溫度4℃。質(zhì)譜檢測參數(shù)：正模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0 KV；毛細(xì)管溫度：350℃；S-Lens RF Level，30%。負(fù)模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.2 KV；毛細(xì)管溫度：350℃；S-Lens RF Level，60%。通過Analysis Base File Converter軟件將LC-MS獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ABF格式，MS-DIAL 4.60軟件預(yù)處理，包括峰提取、去噪音、反卷積，峰對齊，導(dǎo)出CSV格式的原始數(shù)據(jù)矩陣。提取的峰信息與mz Valult數(shù)據(jù)庫及參考文獻(xiàn)進(jìn)行比對，對匹配結(jié)果進(jìn)行參數(shù)過濾：Area≥30 000 000，mzCloud Best Match≥85。

網(wǎng)絡(luò)預(yù)測：通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選不孕癥靶點，通過Swiss Target prediction數(shù)據(jù)庫、BATMAN預(yù)測數(shù)據(jù)庫以及本草組鑒數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻(xiàn)檢索，預(yù)測助孕I號方對不孕癥靶點進(jìn)行匹配評估，通過Cytoscape構(gòu)建“方藥-成分-靶點-疾病”預(yù)測網(wǎng)絡(luò)。

2.2 丹酚酸B與川續(xù)斷皂苷含量測定

2.2.1 色譜條件

安捷倫SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：以乙腈（A）－0.2%磷酸溶液（B）梯度進(jìn)行洗脫 （0～8 min，5%A；8～18 min，5%→11%A；18～35 min，11%→13%A；35～45 min，13%→20%A；45～60 min，20%→21%A；60～65 min，21%→22%A；65～75 min，22%A；75～80 min，22%→30%A；80～90 min，30% →35% A；后 運 行5 min）；檢 測 波 長：212 nm；流速：1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量：5μL；柱溫箱：20℃。

2.2.2 丹酚酸B與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品混合溶液的制備

（1）對照品儲備溶液制備 精密稱取對照品丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ21.24 mg、19.28mg，分別轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品儲備溶液。（2）對照品混合溶液制備 精密吸取丹酚酸B與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品儲備溶液各1 mL，置10 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即可。

2.2.3 全方供試品溶液制備

（1）全方藥液制備 按處方比例稱取鹽大菟絲子等8味飲片220.38 g，加7倍水煎煮2次（第一次多加1倍吸水量，浸泡40 min），每次煎煮30 min，過濾，濾液減壓濃縮至2000 mL，2℃～8℃冷藏，備用；（2）全方供試品溶液制備 精密吸取全方藥液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇至約23 mL，超聲處理10 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾膜（PTFE，0.45μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液

按處方比例，稱取缺丹參組方飲片200.17 g、缺川續(xù)斷組方飲片180.12 g，按“2.2.3（2）”項下方法制得陰性供試品溶液。

2.3 干膏率測定

精密吸取藥液50 mL（V取液量），分別置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中（m），水浴蒸干，于105℃干燥3小時，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量（M），計算干膏率。

2.4 水提正交試驗

采用L9（34）正交試驗法對加水量、煎煮時間及煎煮次數(shù)等主要影響因素進(jìn)行考察篩選，采用L9（34）正交試驗法優(yōu)選本方水提工藝。按處方比例取全方中藥飲片9份（約220 g/份），浸泡30 min，按表1進(jìn)行操作，濾過，濾液減壓濃縮至2 000 mL（V總藥液量）；按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項下色 譜條件測定丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量；照“2.3”項下方法測定干膏率。

表1 水提L9（34）正交因素－水平設(shè)計表

2.5 腎虛血瘀PER動物模型建立及助孕I號方藥效學(xué)試驗驗證方法

2.5.1 腎虛血瘀-子宮內(nèi)膜容受性不良大鼠模型（RDBS-PER）建立

RDBS-PER方案綜合參照課題組前期預(yù)實驗及相關(guān)文獻(xiàn)方法［2-3］建立，空白組予同等體積0.9%氯化鈉注射液假干預(yù)處理。模型組大鼠毛發(fā)枯槁無光澤，懶動反應(yīng)遲鈍，大便稀軟等，光鏡下觀察模型大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜上皮菲薄，上皮細(xì)胞數(shù)目明顯減少、內(nèi)膜間質(zhì)排列緊密且紊亂，較空白組螺旋微、細(xì)、小動脈偏少，炎癥浸潤嚴(yán)重，提示RDBS-PER模型構(gòu)建成功。

2.5.2 干預(yù)及標(biāo)本獲取

大鼠經(jīng)陰道涂片篩選動情前期時入組，分為空白組、模型組、助孕I號方低劑量組（簡稱助低組）、中劑量組（簡稱助中組）、高劑量組（簡稱助高組）以及對照組（每組n＝10只），羥基脲造模開始當(dāng)日同時予以助孕I號方干預(yù)：分別予以低劑量（0.65 g/mL）、中劑量（1.30 g/mL）、高劑量（2.60 g/mL）直腸導(dǎo)入［4］連續(xù)10 d，對照組予阿司匹林［5］（4.81mg/Kg·d）進(jìn)行干預(yù)。第11天開始，各組篩選動情期大鼠雌雄交配，次日早晨進(jìn)行陰道涂片，以發(fā)現(xiàn)陰栓或者光鏡下查見精子視為妊娠第1天（1.0 dpc）。于6.0 dpc上午予以0.3%戊巴比妥鈉麻醉后固定，取外周血上清液進(jìn)行ELISA檢測，取左側(cè)上1/2段子宮組織存入4%甲醛中進(jìn)行HE染色，下1/2段置于戊二醛固定，掃描電鏡（SEM）檢測；將右側(cè)子宮組織存于甲醛中進(jìn)行免疫組化監(jiān)測。

2.5.3 助孕藥效學(xué)觀察指標(biāo)

觀察各組大鼠6.0 dpc一般狀態(tài)，麻醉后迅速剖離子宮，觀察子宮形態(tài)并進(jìn)行著床點計數(shù)；按曹蕾等方法［6］進(jìn)行胞飲突評分和內(nèi)膜容受性判斷；采用ELISA法檢測各組大鼠外周血雌二醇（E2）、孕酮（P）、D2聚體表達(dá)水平；免疫組化法檢測各組大鼠子宮組織中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1（IGFBP-1）、E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）相對蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 利用HPLC-MS聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)預(yù)測篩選助孕I號方核心成分

通過HPLC-MS結(jié)合數(shù)據(jù)庫篩選出助孕I號方11個活性成分（圖2A-B，表2），對篩選出來的成分進(jìn)行活性成分作用靶點預(yù)測，將不孕癥靶點與復(fù)方預(yù)測靶點進(jìn)行交集，共獲得58個共同作用靶點，通過Cytoscape構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2C）發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷皂苷VI（17個潛在調(diào)控靶點，以下簡略）、山奈酚 （17）、丹酚酸B（15）、隱丹參酮（12）、山楂酸（6）等成分對不孕癥靶點具有良好的調(diào)控作用，此外，結(jié)合中藥復(fù)方質(zhì)量標(biāo)記物（Q-marker）五原則，考慮成分的獨特性、有效性、質(zhì)量傳遞及配伍環(huán)境，排除廣泛存在的非特異性成分，課題組選擇助孕I號方中的丹酚酸B和川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)行下一步研究。

圖2 助孕I號方活性成分鑒定及網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

3.2 丹酚酸B與川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測定方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 專屬性試驗

分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液及各陰性供試品溶液5 μL，注入HPLC，照“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖 （圖3）。結(jié)果顯示，缺丹參、缺川續(xù)斷陰性供試品圖譜中丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ無干擾峰出現(xiàn)，且丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ分離度大于1.5，結(jié)果表明兩種待測成分專屬性良好。

圖3 專屬性試驗色譜圖

3.2.2 線性范圍

分別精密吸取“2.2.2（1）”項下丹酚酸B對照品儲備溶液與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品儲備溶液1、1、1、3、1、2 mL，分 別 置100、50、25、50、10、10 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，作為6種不同濃度的丹酚酸B與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品混合溶液；精密吸取上述6種濃度的對照品混合溶液各5μL，注入HPLC，照“2.2.1”項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

表3 助孕I號方2種成分的回歸方程及線性范圍

表4 正交試驗結(jié)果

表5 方差分析表

表6 各組大鼠外周血D2聚體、雌孕激素表達(dá)及子宮組織IGFBP-1、E-Cadherin表達(dá)（±s，n＝6）

表6 各組大鼠外周血D2聚體、雌孕激素表達(dá)及子宮組織IGFBP-1、E-Cadherin表達(dá)（±s，n＝6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別外周血雌二醇（E2）/pg·mL－1孕酮（P）/ng·mL－1 D2聚體/ng·mL－1子宮組織IGFBP－1/平均光密度E－Cadherin/平均光密度空白組 67.63±4.48 5.18±0.45** 154.76±45.57**0.23±0.01 0.19±0.03模型組 23.63±1.00 3.76±0.94 245.88±14.09 0.2±0.01 0.25±0.01助低組 41.62±17.72** 4.21±0.80** 242.55±41.63 0.21±0.01 0.25±0.02助中組 67.63±12.12** 4.69±0.67 175.2±57.92* 0.21±0.01 0.22±0.01助高組 57.70±11.34* 4.18±1.45 212.55±31.63 0.21±0.01 0.23±0.01陽性組 71.62±17.72** 5.58±0.45**232.55±46.63 0.22±0.01 0.24±0.02

3.2.3 精密度試驗

精密吸取“2.2.2（2）”項下丹酚酸B與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品混合溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，照“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均峰面積依此為3 523.0、415.8，RSD依此為0.81%、0.21%，表明儀器精密度良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取 “2.2.2（2）”項下供試品溶液5μL，分別于0、4、8、12、24 h注入HPLC，照“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均峰面積依此為1 551.1、318.0，RSD依此為0.88%、1.00% ，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 重復(fù)性試驗

精密吸取“2.2.3”項下全方藥液10 mL，共6份，置25 mL量瓶中，照“2.2.3（2）”項下方法制備成供試品溶液，精密吸取5μL，注入HPLC，照“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均峰面積依此為1 545.8、317.8，RSD 依此為1.36%、0.88%，表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.6 加樣回收試驗

精密吸取“2.2.3”項下全方藥液（每mL含丹酚酸B 0.1 806 mg、川續(xù)斷皂苷Ⅵ0.264 5 mg）5 mL，共9份，分別置50mL量瓶中，均分為3組，每組分別加入丹酚酸B與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品混合溶液（每mL含丹酚酸B 0.450 2 mg、川續(xù)斷皂苷Ⅵ0.657 0 mg）1、2、3 mL，加甲醇至約45 mL，超聲處理10 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾膜（PTFE，0.45μm）過濾，精密吸取續(xù)濾液5μL，注入HPLC，照“2.2.1”項下色譜條件測定，計算丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均加樣回收率依此為98.77%、98.46%，RSD依此為2.00%、2.15%，表明該方法準(zhǔn)確度較好，可行。

3.3 正交試驗結(jié)果

以綜合評分為指標(biāo)，在所選因素水平范圍內(nèi)，各影響因素作用順序為煎煮次數(shù)（C） ＞加水量（A） ＞提取時間（B），得出第5號結(jié)果綜合評分最高，初步優(yōu)選工藝為A2B2C3；方差分析可知，A因素對煎煮效果呈顯著影響（P＜0.05），B因素對煎煮效果無顯著影響（P＞0.05），C因素對煎煮效果呈極顯著影響（P＜0.01），故在直觀分析結(jié)果基礎(chǔ)上，將提取工藝調(diào)整為A2B1C3，即加10倍量水，煎煮3次，40 min/次。

3.4 水提工藝驗證

優(yōu)選出最佳工藝后，按照優(yōu)選條件進(jìn)行驗證試驗，測定丹酚酸B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ及干膏率，已驗證優(yōu)選工藝的重復(fù)性及可行性。結(jié)果見表7，驗證所得各指標(biāo)RSD均小于3%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表7 水提工藝驗證結(jié)果（n＝3）

3.5 助孕I號方對RDBS-PER大鼠相關(guān)藥效學(xué)指標(biāo)測定

3.5.1 各組大鼠著床點數(shù)及子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化

實驗過程中無大鼠死亡，與空白組相比，RDBSPER大鼠著床點數(shù)明顯降低，差異顯著（P ＜0.001），提示RDBS-PER大鼠子宮發(fā)育及胚胎著床明顯受到干擾。而助孕I號方各劑量組和對照組大鼠著床點均顯著多于RDBS-PER大鼠（P＜0.05）；光鏡下子宮內(nèi)膜形態(tài)：助孕I號方各劑量組大鼠子宮內(nèi)膜被覆上皮較模型組有明顯改善。透射電鏡子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)提示：與空白組相比，RDBS-PER大鼠內(nèi)膜絨毛稀疏、破損嚴(yán)重，僅見少量小胞飲突表達(dá)，胞飲突評分明顯下降（P＜0.001）；助孕I號方各組、對照組胞飲突評分均高于RDBS-PER大鼠（P＜0.05），助高組評分顯著高于RDBS-PER大鼠（P＜0.001）（詳見圖4）。以上結(jié)果提示助孕I號方有改善RDBS-PER模型大鼠“胚-膜”發(fā)育不良的作用。

圖4 助孕I號方對腎虛血瘀-PER模型大鼠的藥效學(xué)研究結(jié)果

3.5.2 各組大鼠外周血雌二醇（E2）、孕酮（P）、D2聚體及子宮IFGBP-1、ECAD表達(dá)水平比較

與空白對照組比較，模型組大鼠外周血E2、P表達(dá)明顯減弱（P＜0.05），D2聚體升高；與模型對照組比較，助孕I號方各劑量組E2、P表達(dá)顯著性上調(diào)（P＜0.05），D2聚體表達(dá)出現(xiàn)不同程度的下降，以助中組療效最佳。與空白對照組比較，模型組大鼠子宮組織IGFBP-1表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）、ECadherin表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。與模型對照組比較，助孕I號方各劑量組的子宮組織IGFBP-1表達(dá)均著性上調(diào)（P＜0.05），助孕I號方各劑量組組間差異不明晰，而E-Cadherin表達(dá)均明顯下調(diào)，助中組表型差異更大（詳見表6、圖5）。

圖5 助孕I號方對腎虛血瘀-PER模型大鼠子宮IGFBP-1、E-Cadherin研究結(jié)果

4 討論

研究顯示，自然受孕條件下，人類30%的妊娠失敗是胚胎著床失敗導(dǎo)致，反復(fù)著床失敗也是輔助生殖技術(shù)中的難點?！陡登嘀髋啤吩疲骸熬珴M則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物”，精血同源、母子相生，腎精虧虛、津枯血燥，血液則易黏滯而成瘀，胞脈瘀阻則有礙腎中精氣化生，且輔助生殖技術(shù)反復(fù)金刃之邪傷及胞脈胞絡(luò)、耗損腎氣，因此腎虛血瘀是導(dǎo)致胎元不固的主要病機(jī)。本研究團(tuán)隊以補(bǔ)腎活血法立方的助孕I號直腸導(dǎo)入方治療腎虛血瘀不孕癥/輔助生殖技術(shù)失敗患者療效確切，該協(xié)定方的開發(fā)、應(yīng)用、推廣具有重要價值。

本研究旨在確定助孕I號直腸導(dǎo)入方的最佳提取工藝，并探討其對RDBS-PER模型大鼠的子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)、著床率、E2、P、D2聚體、IGFBP-1、E-Cadherin表達(dá)的影響。本研究通過HPLC-MS聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)預(yù)測揭示丹酚酸B和川續(xù)斷皂苷Ⅵ是助孕I號方重要的活性成分，前者為丹參主要的水溶性藥效成分，具有活血化瘀、抗氧化等藥理作用［7-9］，后者為續(xù)斷的主要藥效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、治療先兆性流產(chǎn)等藥理作用［10-12］，與處方的功能主治一致。

綜合考慮多個成分含量和出膏率，通過正交試驗篩選出最優(yōu)的提取工藝，并采用了急毒和藥效實驗相結(jié)合的方法進(jìn)行了驗證。①在優(yōu)化提取工藝方面，通過正交試驗篩選出加10倍量水，煎煮3次，40 min/次的最優(yōu)提取工藝方案。這些結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝可以使助孕I號方的有效成分得到充分提取。②急毒實驗結(jié)果表明，所有大鼠在最佳提取方案下均健康存活，未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。這表明最佳提取方案安全無毒，可以用于后續(xù)的臨床應(yīng)用和研究。③藥效實驗結(jié)果顯示，采用最佳提取方案的助孕I號方中劑量組（1.30 g/mL的）能夠顯著改善RDBS-PER大鼠的性激素和子宮組織IGFBP-1、E-CAD 表達(dá)。IGFBP1作為子宮內(nèi)膜蛻膜化的重要標(biāo)志物之一，其表達(dá)可用以衡量著床期子宮內(nèi)膜蛻膜化程度的高低［12］。E-cadherin屬于Ⅰ類經(jīng)典鈣黏素，是跨膜糖蛋白的一種，介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的黏附，對維持細(xì)胞連接有重要作用，對參與著床期上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）具有重要作用，從而利于胚胎植入成功［13］。以上結(jié)果表明，采用最優(yōu)提取工藝方案，助孕I號直腸導(dǎo)入方可顯著改善模型大鼠子宮內(nèi)膜容受性，為其后續(xù)開發(fā)提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

綜上，本研究所采用的藥效篩選和正交試驗方法具有很好的可重復(fù)性和可擴(kuò)展性，可提高中藥方劑的提取效率和藥效。本研究確定了最佳的提取工藝方案，驗證了助孕I號方水提物具有改善腎虛血瘀子宮內(nèi)膜容受性不良的作用，為助孕I號直腸導(dǎo)入方的下一步研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和依據(jù)。