血根堿基于PI3K/AKT 通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究

王 密 翁春燕

結(jié)腸癌是全球最普遍的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。手術(shù)治療仍然是目前原發(fā)性結(jié)腸癌主要外科治療方法，易輔以放化療等，但其“發(fā)現(xiàn)晚、多耐藥、易復(fù)發(fā)”的典型特點(diǎn)易導(dǎo)致治療失敗，從而難以獲得較好的預(yù)后效果。盡管新型靶向藥物針對(duì)多種癌癥（包括結(jié)腸癌）的研究也獲得了進(jìn)展，但其應(yīng)用仍存在較大的局限性；而經(jīng)典的化療手段由于其自身難以解決的耐藥性高及生物敏感性過(guò)低等問(wèn)題，治療效果不甚理想。血根堿作為一種分布廣、易養(yǎng)殖的苯并菲啶類(lèi)生物堿中藥提取物，其多種抗癌機(jī)制受到越來(lái)越多的重視[2]。因此，本研究選用人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-8 細(xì)胞和SW-620 細(xì)胞），重點(diǎn)研究血根堿對(duì)人體結(jié)腸癌的影響，并進(jìn)一步探究其作用于體內(nèi)外腫瘤的可能藥物作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞系FHC（批號(hào)CRL-1831）和結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8（批號(hào)CCL-244）、SW-620（批號(hào)CCL-227）購(gòu)自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 動(dòng) 物 4～5 周齡SPF 級(jí)別的BALB/c 裸鼠6只，購(gòu)于上海BK 公司，雌性，體質(zhì)量（16～20）g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)特定病原屏障中心，飼養(yǎng)濕度為（50±5）%，溫度（25±2）℃，各12 h 的光、暗循環(huán)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)后進(jìn)行（倫理審批號(hào)：IACUC-20221008-04）。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2022-0004；動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（滬）2022-0004；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（浙）2021-0012。

1.3 試 劑 血根堿（貨號(hào)HY-N005） 購(gòu)自MedChemExpress，使用DMSO 配制成2 mmol/L 的濃度進(jìn)行保存；血根堿溶液采用DMSO 及生理鹽水溶解至100 mg/mL 待用；使用前，使用相應(yīng)培養(yǎng)基配制成所需的工作濃度。胎牛血清（FBS，貨號(hào)16140-071）、1640 培養(yǎng)液（貨號(hào)72400047）、杜爾伯科改良伊格爾（DMEM，貨號(hào)C11995500BT）培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；RIPA 裂解液（貨號(hào)PC101）、蛋白酶抑制劑混合液（貨號(hào)PC101）、磷酸酶抑制劑混合液（貨號(hào)FGR102）等細(xì)胞裂解液相關(guān)試劑均購(gòu)自雅酶生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K，貨號(hào)4255）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT，貨號(hào)4691）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-AKT，貨號(hào)4060）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR，貨號(hào)2983）、E-鈣黏蛋白（E-cad，貨號(hào)14472）、N-鈣黏蛋白（N-cad，貨號(hào)13116）、β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin，貨號(hào)3700）等抗體均購(gòu)自CST；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，貨號(hào)GK10001） 購(gòu)自GLPBIO；多聚甲醛購(gòu)自默克（貨號(hào)30525-89-4）。

1.4 主要儀器 超凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)：HF safe 1500LC）；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)：Universal Hood Ⅲ）；SDS-PAGE 電泳儀裝置（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)：1658004）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 將人結(jié)腸癌HCT-8 細(xì)胞接種在6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)一半以上時(shí)，棄上清液，加入2 mL 預(yù)定含量血根堿的培養(yǎng)基（0、2、4、8 μmol/L）處理24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將穩(wěn)定生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-8 和SW-620）以5000 個(gè)細(xì)胞數(shù)量均勻混合并接種于96 孔板中培養(yǎng)至貼壁（6～8 h）。隨后換液，加入預(yù)定含量血根堿的培養(yǎng)基（0、3、6、9、18 μmol/L）干預(yù)培養(yǎng)24 h 換液，加入適量CCK-8 溶液，選取恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間（1～4 h 內(nèi)）置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)，確保對(duì)照組在450 mm 激發(fā)光的吸光數(shù)值在0.8～1.2。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將穩(wěn)定生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8 以50 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%的時(shí)候，使用槍頭制造“細(xì)胞傷痕”。加入不同濃度血根堿的培養(yǎng)液（0、2、4、8 μmol/L）進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡直視下觀察細(xì)胞的匯合程度，并進(jìn)行拍照記錄（0、12、24、48 h）。

2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將穩(wěn)定生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-8 和SW-620）混合均勻，以1000 個(gè)細(xì)胞數(shù)量接種至6 孔板中，加入不同濃度血根堿的培養(yǎng)液（0、2、4、8 μmol/L）培養(yǎng)干預(yù)，置于溫度37 ℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，期間定期3～4 d 換各自相應(yīng)含量的血根堿培養(yǎng)液。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆形成時(shí)，先后加入多聚甲醛、結(jié)晶紫染色，洗凈晾干，觀察和記錄細(xì)胞的克隆個(gè)數(shù)。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法 將穩(wěn)定生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8 接種于6 cm 皿中，待細(xì)胞貼壁后使用含不同濃度血根堿的培養(yǎng)液（0、2、4、8 μmol/L）進(jìn)行培養(yǎng)。收集細(xì)胞加入裂解液充分溶解并置于4 ℃離心機(jī)中（轉(zhuǎn)速10000 r/min）離心15 min。隨后制備成含上樣緩沖液的蛋白樣品。采用SDS-PAGE 分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，予5%脫脂牛奶封閉1 h，置于一抗中并于4 ℃搖床上孵育過(guò)夜，予TBST 漂洗3 遍，每遍10 min，隨后加入二抗，室溫孵育1 h，再予TBST漂洗3 遍，每遍10 min，洗膜后經(jīng)ECL 試劑顯色、曝光。結(jié)果采用Image J 軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定。

2.6 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8細(xì)胞以100 萬(wàn)/200 μL 注射至小鼠左側(cè)腋下皮下；待腫瘤體積生長(zhǎng)至100 mm3左右時(shí)，按照隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分成對(duì)照組和血根堿組，每組3 只。血根堿組予10 mg/kg 血根堿溶液腹腔注射治療，每天1 次；對(duì)照組予等量生理鹽水腹腔注射安慰治療。每周測(cè)量1 次皮下腫瘤長(zhǎng)徑、短徑及小鼠體質(zhì)量。待治療28 d 后，安樂(lè)死小鼠并稱量小鼠腫瘤質(zhì)量。小鼠腫瘤體積計(jì)算方法：長(zhǎng)徑×短徑2×1/2。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 9 及SPSS 22.0 進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)的影響 為初步判定血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞是否存在毒性作用，予不同濃度的血根堿處理HCT-8 細(xì)胞24 h。如圖1 所示，對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞緊密貼壁，形態(tài)飽滿（HCT-8 細(xì)胞呈菱形），細(xì)胞膜光滑完整；而在不同濃度的血根堿處理組中，細(xì)胞貼壁能力下降，分泌物增多，形態(tài)皺縮至圓形，并出現(xiàn)不同程度的胞膜破裂。

圖1 不同濃度血根堿處理后人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8 的細(xì)胞形態(tài)（×40）

3.2 血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組比較，血根堿以濃度依賴性（3、6、9、18 μmol/L）對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8 和SW-620 具有較強(qiáng)的殺傷作用（P 均＜0.05）；并且血根堿對(duì)正常人結(jié)腸黏膜細(xì)胞FHC 的殺傷作用明顯弱于對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用。進(jìn)一步計(jì)算出血根堿對(duì)HCT-8、SW620 和FHC 的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50） 分別為（3.40±0.03）、（5.32±0.12）和（14.98±1.34）μmol/L。見(jiàn)表1～2。

表1 血根堿對(duì)HCT-8、SW-620 和FHC 細(xì)胞活力的影響（%，±s）

表1 血根堿對(duì)HCT-8、SW-620 和FHC 細(xì)胞活力的影響（%，±s）

注：HCT-8 和SW-620 為人結(jié)腸癌細(xì)胞；FHC 為人正常腸上皮細(xì)胞；與同濃度血根堿處理下的FHC 組比較，aP＜0.05

細(xì)胞HCT-8 SW-620 FHC血根堿濃度孔數(shù)333 0 μmol/L 100.00±2.47 100.00±2.38 100.00±3.53 3 μmol/L 66.11±1.11a 76.88±3.27a 93.67±2.42 6 μmol/L 40.49±2.36a 54.90±2.24a 77.53±2.01 9 μmol/L 16.11±1.52a 30.83±1.70a 66.21±2.62 18 μmol/L 1.13±0.23a 3.11±0.18a 30.82±1.83

表2 血根堿對(duì)HCT-8、SW-620 和FHC 細(xì)胞的IC5（0μmol/L，±s）

表2 血根堿對(duì)HCT-8、SW-620 和FHC 細(xì)胞的IC5（0μmol/L，±s）

注：IC50 為半數(shù)抑制濃度；HCT-8 和SW-620 為人結(jié)腸癌細(xì)胞；FHC 為人正常腸上皮細(xì)胞；與FHC 比較，aP＜0.05

細(xì)胞HCT-8 SW-620 FHC孔數(shù)333血根堿的IC50 3.40±0.03a 5.32±0.12a 14.98±1.34

3.3 血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，血根堿以濃度依賴形式明顯抑制了HCT-8 和SW-620 細(xì)胞的克隆形成大小和個(gè)數(shù)（0、2、4、8 μmol/L血根堿處理下的SW-620 和HCT-8 的克隆數(shù)分別是81、40、22、11 個(gè)和63、26、22、7 個(gè)）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

3.4 血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響 使用不同濃度血根堿處理結(jié)腸癌HCT-8 細(xì)胞0、12、24、48、72 h，結(jié)果如圖3 和表3 所示，隨著血根堿濃度的提高，細(xì)胞劃痕的愈合能力逐漸下降（P<0.05）。

表3 血根堿對(duì)HCT-8 的遷移抑制率（%，±s）

表3 血根堿對(duì)HCT-8 的遷移抑制率（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

血根堿濃度0 μmol/L 2 μmol/L 4 μmol/L 8 μmol/L實(shí)驗(yàn)次數(shù)3333細(xì)胞遷移率59.43±5.05 24.55±5.45a 15.50±3.38a 3.36±2.37a

圖3 血根堿治療HCT-8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的代表性圖片（×16）

3.5 血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中E-cad、N-cad、PI3K、AKT 蛋白水平的影響 如圖4 和表4 所示，血根堿以濃度依賴性提高了HCT-8 細(xì)胞E-cad 的表達(dá)，降低了N-cad 的表達(dá)（P<0.05）。此外，血根堿明顯下調(diào)PI3K、p-AKT、mTOR 的蛋白表達(dá)水平（P<0.05）。

表4 血根堿治療HCT-8 細(xì)胞后相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（±s）

表4 血根堿治療HCT-8 細(xì)胞后相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（±s）

注：PI3K 為磷脂酰肌醇3-激酶；AKT 為絲氨酸/蘇氨酸激酶；p-AKT 為磷酸化AKT；mTOR 為雷帕霉素靶蛋白；E-cad 為E-鈣黏蛋白；N-cad 為N-鈣黏蛋白；與0 μmol/L 血根堿組比較，aP＜0.05

血根堿濃度0 μmol/L 2 μmol/L 4 μmol/L 8 μmol/L實(shí)驗(yàn)次數(shù)3333 E-cad 0.44±0.11 0.60±0.02a 0.86±0.07a 1.00±0.03a N-cad 1.00±0.08 0.80±0.12a 0.51±0.08a 0.29±0.03a PI3K 1.00±0.05 0.88±0.04a 0.81±0.03a 0.67±0.06a AKT 1.00±0.14 1.11±0.09 1.00±0.07 0.97±0.01 p-AKT 1.00±0.08 0.77±0.06a 0.70±0.03a 0.47±0.03a mTOR 1.00±0.09 0.79±0.13a 0.55±0.11a 0.34±0.03a

圖4 血根堿治療HCT-8 細(xì)胞后相關(guān)蛋白的代表性圖片

3.6 血根堿在體內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌的影響 為明確血根堿在體內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌的抑制作用，我們構(gòu)建了HCT-8 皮下荷瘤小鼠模型。相較于對(duì)照組，血根堿治療組小鼠腫瘤體積（見(jiàn)圖5）及腫瘤質(zhì)量（見(jiàn)表5）明顯下降（P<0.05）。此外，治療過(guò)程中兩組小鼠體質(zhì)量未出現(xiàn)明顯差異，提示血根堿能夠在不對(duì)宿主造成藥物毒性的狀態(tài)下抑制結(jié)腸癌腫瘤生長(zhǎng)。

表5 HCT-8 細(xì)胞荷瘤小鼠在血根堿治療期間皮下腫瘤體積大小及腫瘤質(zhì)量（±s）

表5 HCT-8 細(xì)胞荷瘤小鼠在血根堿治療期間皮下腫瘤體積大小及腫瘤質(zhì)量（±s）

注：與對(duì)照組同期比較，aP＜0.05

組別對(duì)照組血根堿組鼠數(shù)33第0 天105.78±6.63 108.14±4.88腫瘤體積（mm3） 腫瘤質(zhì)量（g）1.01±0.21 0.63±0.11a第28 天862.28±133.90 367.48±30.17a

圖5 HCT-8 細(xì)胞荷瘤小鼠在血根堿治療后皮下腫瘤圖片

4 討 論

既往研究表明，血根堿可以在頭頸癌、肺癌、胃癌等多種癌癥中誘導(dǎo)凋亡從而抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展[3]。PI3K/AKT 信號(hào)通路在許多腫瘤中出現(xiàn)異?；顒?dòng)，并參與調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)降解等功能，激活肝癌、口癌、消化道腫瘤的全程[4]。mTOR 拾取并整合由營(yíng)養(yǎng)攝入、生長(zhǎng)因子和其他細(xì)胞刺激引發(fā)的信號(hào)，以調(diào)節(jié)下游信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)合成。通過(guò)其下游效應(yīng)器4EBP1 和P70S6 激酶（S6K），參與將mRNA核糖體翻譯成細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞代謝所必需的蛋白質(zhì)[5]。此外，血根堿可通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路失活誘導(dǎo)人口腔鱗狀細(xì)胞癌KB 細(xì)胞凋亡[6]。因此，本研究旨在探索血根堿是否可以通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT 通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞。

本研究檢測(cè)了不同濃度的血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移等的影響。結(jié)果表明，血根堿能夠呈濃度依賴性地抑制結(jié)腸癌HCT-8 和/或SW-620 細(xì)胞的增殖、遷移等能力；并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血根堿能夠有效抑制結(jié)腸癌腫瘤生長(zhǎng)；隨著血根堿濃度的增高，PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表達(dá)量受到明顯抑制，說(shuō)明血根堿可抑制PI3K 磷酸化，減少AKT 活化抑制下游蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

總之，本研究結(jié)果表明，血根堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出有效的抑制作用，可能通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT/mTOR 通路影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生物活性。