間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體對2型糖尿病小鼠胰島功能和炎癥因子的影響

王振剛,付 塬,張聞達(dá),朱長吉,李柱虎

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,吉林 延吉133002)

流行病學(xué)調(diào)查顯示我國糖尿病總患病人數(shù)為1.298億,患病率高達(dá)12.8%,且呈逐年上升趨勢[1]。在糖尿病患者中,2型糖尿病約占95%以上,并呈年輕化趨勢,給患者及其家庭帶來巨大的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。大量研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植能降低血糖,改善胰島β細(xì)胞功能,降低糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3-7]。MSCs主要通過旁分泌的方式發(fā)揮組織損傷的修復(fù)作用,其中外泌體是MSCs旁分泌的主要成分[8-11]。本研究通過誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型,探討多次輸注胎盤MSCs來源的外泌體對2型糖尿病小鼠的血糖水平、糖耐量水平、炎癥因子水平及胰島功能的影響,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料取4周齡健康的雄性C57BL/6小鼠30只,體重約20 g,購自北京維通利華公司。主要試劑:鏈脲佐菌素和4%的多聚甲醛組織固定液購自北京索萊寶生物有限公司。DAPI染液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。α-MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自HyClone公司,無外泌體血清及外泌體提取試劑盒購自SBI公司?？挂葝u素及抗胰高血糖素抗體分別購自武漢塞維爾生物科技有限公司。小鼠C-肽ELISA試劑盒和小鼠胰島素ELISA試劑盒均購自酶聯(lián)生物科技股份公司。Luminex試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。羅氏活力血糖儀及血糖試紙均購自羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司。

1.2 胎盤MSCs外泌體的制備

采用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs,待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右,更換含10%無外泌體血清的α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞上清,然后采用SBI外泌體提取試劑盒提取外泌體。將獲得的外泌體沉淀懸浮在PBS緩沖液中,分裝并放于-80℃冰箱保存,備用。

1.3 外泌體的鑒定

使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察外泌體的形態(tài)。取10 μl外泌體滴加在無定形碳包覆銅網(wǎng)上沉淀5 min,吸去多余液體,晾干。滴加10 μl的1%磷鎢酸復(fù)染2 min,吸去多余液體,晾干。通過TEM觀察外泌體并照相。采用NanoSight納米顆粒跟蹤分析儀測定外泌體的粒徑分布范圍及濃度。取20 μl外泌體進(jìn)行50倍稀釋,然后進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.4 模型建立及分組

從購買的30只小鼠中隨機(jī)取出24只作為造模組,剩余6只作為對照組。造模組進(jìn)行高脂高糖飲食喂養(yǎng)8周后,按40 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射鏈脲佐菌素溶液一次,連續(xù)注射5天。正常組小鼠正常飼養(yǎng)8周后,腹腔注射等劑量的PBS一次,連續(xù)注射5天。一周后開始檢測小鼠血糖,連續(xù)3天檢測隨機(jī)血糖大于等于13.9 mmol/L的小鼠被認(rèn)為糖尿病造模成功。將糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型組和外泌體治療組。模型組小鼠每隔一天尾靜脈注射100 μl PBS,外泌體治療組每隔一天尾靜脈注射20 μg外泌體,治療4周。治療結(jié)束后,再觀察2周,對小鼠行安樂死,收集胰腺組織和血清樣本。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1體重和血糖檢測 第一次靜脈注射外泌體后每周測定一次體重和隨機(jī)血糖,隨機(jī)血糖監(jiān)測均于上午9:00～10:00進(jìn)行。

1.5.2腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT) 外泌體治療4周后行腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)。小鼠禁食12 h,腹腔注射葡萄糖溶液(2.0 g/kg)。在注射后0、30、60、90和120 min分別測定血糖水平。

1.5.3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 獲得全血后,室溫放置1 h 后,3 000 g 離心10 min,取上層血清檢測。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清中C-肽和胰島素水平。

1.5.4Luminex多因子檢測 按照Luminex多因子檢測說明書檢測小鼠血清中的IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等炎癥因子水平。

1.6 胰腺組織HE染色及免疫熒光染色

4%的多聚甲醛固定組織48 h,常規(guī)石蠟包埋并制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色并用光學(xué)顯微鏡觀察拍照。石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后,進(jìn)行抗原修復(fù),然后在1%BSA中封閉30 min。再將石蠟切片與抗小鼠胰島素抗體和抗小鼠胰高血糖素抗體在4℃下孵育過夜。次日,PBS洗滌3次后,加入稀釋好的熒光二抗避光孵育1 h。最后,使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MSCs外泌體的鑒定

采用外泌體試劑盒提取的MSCs外泌體通過透射電鏡可以觀察到膜結(jié)構(gòu)完整,為直徑小于200 nm的圓形囊泡(圖1A)。對獲得的MSCs外泌體進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析,顯示其直徑小于200 nm(圖1B),符合外泌體的直徑范圍。

圖1 MSCs外泌體的形態(tài)和鑒定

2.2 MSCs外泌體治療后小鼠體重、血糖及糖耐量的變化

與模型組相比,MSCs外泌體治療組的小鼠消瘦狀態(tài)有所緩解(圖2A),隨機(jī)血糖明顯降低(圖2B)。IPGTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示任何時(shí)間點(diǎn) MSCs外泌體治療組血糖均明顯低于模型組(圖3)。

圖2 多次輸注MSCs外泌體對糖尿病小鼠隨機(jī)血糖和體重的影響(*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)

圖3 多次輸注MSCs外泌體對糖尿病小鼠糖耐量的影響(*表示P<0.05,***表示P<0.001)

2.3 MSCs外泌體治療后小鼠血清中C-肽和胰島素水平

與正常組相比,模型組的小鼠血清中C-肽水平和胰島素水平均明顯下降,與模型組相比MSCs外泌體治療,小鼠血清中C-肽水平和胰島素水平均明顯升高(P<0.001)。見圖4。

圖4 小鼠血清中C-肽(A)和胰島素水平(B)(***P<0.001)

2.4 MSCs外泌體治療后小鼠血清中炎癥因子水平

與正常組相比,模型組的小鼠血清中促炎癥因子IL-1β、IL-12、IFN-γ和TNF-α水平均明顯升高,抗炎因子IL-4和IL-10水平明顯降低。與模型組相比經(jīng)MSCs外泌體治療小鼠血清中促炎癥因子IL-1β、IL-12、IFN-γ和TNF-α水平均明顯降低(P<0.001),而抗炎因子IL-4和IL-10水平明顯升高(P<0.001)。見圖5。

圖5 小鼠血清中炎癥因子水平(***P<0.001)

2.5 MSCs外泌體治療后糖尿病小鼠胰腺組織HE染色及免疫熒光染色分析

HE染色及免疫熒光染色結(jié)果顯示,正常組的小鼠胰腺組織形態(tài)完整,胰島內(nèi)細(xì)胞排列整齊;模型組小鼠胰島明顯變小,胰島形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞排列紊亂,胰島數(shù)目明顯降低;與模型組相比,外泌體治療組小鼠胰島形態(tài)及大小得到明顯改善,胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰可見,結(jié)構(gòu)較完整(圖6,圖7),其胰島β細(xì)胞的數(shù)量及比例與模型組比較也顯著上升(圖8)。

圖6 各組小鼠胰腺HE染色圖(×400)

圖7 各組小鼠胰腺免疫熒光染色圖(× 200)

圖8 各組小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量及比例比較

3 討論

研究證明,MSCs可以改善胰島β細(xì)胞的功能,抑制胰島β細(xì)胞凋亡,從而改善機(jī)體的高血糖狀態(tài)[4,12-14]。MSCs可以在體外分化為β細(xì)胞或胰島素產(chǎn)生細(xì)胞[15-17],但是HESS等[18]發(fā)現(xiàn)MSCs在體內(nèi)僅可以刺激胰島β細(xì)胞的增殖,卻不能轉(zhuǎn)分化為胰島β細(xì)胞。MSCs也可能通過旁分泌多種細(xì)胞因子、生長因子或者外泌體進(jìn)而改善胰島功能[19-20]。

本研究采用多次輸注MSCs外泌體的方式,探討外泌體對2型糖尿病的價(jià)值。從血糖的檢測數(shù)值、血清中C-肽、胰島素及炎癥因子水平以及病理分析不同實(shí)驗(yàn)組糖尿病小鼠胰腺組織的結(jié)果證明,經(jīng)尾靜脈多次輸注MSCs外泌體可有效降低血糖、增加對葡萄糖的耐受能力,且抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng),促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素進(jìn)而發(fā)揮降糖的作用。MSCs外泌體治療組的小鼠,在輸注外泌體一周后,其血糖水平下降較為明顯,這可能與外泌體中含有大量的microRNA 有關(guān)。研究顯示,MSCs外泌體中的miR-let-7a-5p,miR-24-3P和miR-19-b-1-5p能夠提高胰島β細(xì)胞功能進(jìn)而促進(jìn)胰腺修復(fù)[21]。因此,多次輸注MSCs外泌體可以有效的降低血糖水平和抑制炎癥反應(yīng),從而對2型糖尿病小鼠有良好的治療作用。