棲冷克呂沃爾氏菌臨床株對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的分子機(jī)制

馬艷輝,劉真真,馮漸燾,姜美妍,朱元祺,趙自云*

(1.青島大學(xué)附屬青島市中心醫(yī)院,青島市腫瘤醫(yī)院,山東 青島266042;2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島266003)

克呂沃爾氏菌屬現(xiàn)歸類(lèi)于腸桿菌目中的腸桿菌科,被認(rèn)為是一種條件致病菌,通常存在于環(huán)境中,也存在于人的胃腸道[1-2]。該菌屬可引起從輕微到致命的感染,如菌血癥、膽管炎、腹瀉、新生兒腦膜炎、腹膜炎和肺炎[2],但關(guān)于人體感染克呂沃爾氏菌的報(bào)道較少。到目前為止,克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)包括抗壞血酸克呂沃爾氏菌(K.ascorbata)、棲冷克呂沃爾氏菌(K.cryocrescens)、居中克呂沃爾氏菌(K.intermedia)、佐治亞克呂沃爾氏菌(K.georgiana)和四川克呂沃爾氏菌(K.sichuanensis)五個(gè)種[2]。

位于棲冷克呂沃爾氏菌染色體上的blaKLUC-1基因于2001年由Decousser報(bào)道[3],它編碼屬于CTX-M型的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶KLUC-1。D類(lèi)碳青霉烯酶基因blaOXA-181于2007年在印度被首次報(bào)道[4]。此后,blaOXA-181基因在英國(guó)、美國(guó)、丹麥和中國(guó)等國(guó)家被發(fā)現(xiàn),并在腸桿菌科中的流行率呈上升趨勢(shì)[5]。另外,攜帶blaOXA-181基因的腸桿菌科細(xì)菌主要是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌[5],但目前還未在克呂沃爾氏菌屬細(xì)菌中檢出該基因。因此,本文對(duì)首例同時(shí)攜帶qnrS1、blaKLUC-1和blaOXA-181基因的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株進(jìn)行報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49于2022年分離自肺部感染住院患者的痰標(biāo)本。沙門(mén)菌H9812、ATCC25922和ATCC 700603以及大腸埃希菌J53AziR分別作為S1核酸脈沖場(chǎng)凝膠電泳(S1-PFGE)的分子量標(biāo)記、儀器的質(zhì)控菌株以及質(zhì)粒的液相接合受體菌,且這些菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器和試劑細(xì)菌鑒定通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS,布魯克,德國(guó))。藥敏試驗(yàn)為VITEK 2 Compact系統(tǒng),結(jié)果判定依據(jù)CLSI-M100-2021[6]標(biāo)準(zhǔn)。上海復(fù)星NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶免疫層析卡(C,質(zhì)控對(duì)照線(xiàn);K,KPC;O,OXA-48;V,VIM;I,IMP和N,NDM型酶)。S1核酸酶切的脈沖場(chǎng)凝膠電泳(S1-PFGE)的電泳系統(tǒng)以及凝膠成像儀均為BIO-RAD公司。

1.3 棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49的測(cè)序基于Illumina MiSeq(Illumina,USA)和Oxford Nanopore MinION(ONT,UK)平臺(tái)對(duì)PD49株進(jìn)行測(cè)序。使用Unicycler軟件(v.0.4.1)重新組裝所有reads,經(jīng)校正后,使用PlasmidFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)、ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)和ISfinder(https://www-is.biotoul.fr)等在線(xiàn)軟件分析該菌株的生物學(xué)信息。

1.4 液相接合試驗(yàn)和S1-PFGE棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49與EscherichiacoliJ53AziR的液相接合以及與接合子的S1-PFGE的試驗(yàn),操作參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[7];接合子的酶型檢測(cè)采用NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶免疫層析檢測(cè)卡,操作步驟按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49的藥敏和碳青霉烯酶型篩檢結(jié)果

棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑林、厄他培南、亞胺培南和美羅培南耐藥,但對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢替坦和氨曲南以及氨基糖苷類(lèi)敏感。另外,對(duì)喹諾酮類(lèi)呈現(xiàn)中介藥敏表型。藥敏結(jié)果見(jiàn)表1。此外,經(jīng)NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶卡檢測(cè),該菌株在OXA-48型碳青霉烯酶處呈現(xiàn)陽(yáng)性條帶,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 碳青霉烯酶卡檢測(cè)結(jié)果圖

表1 PD49株、接合子和E.coli J53AziR的藥敏結(jié)果

2.2 棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49的測(cè)序和生物信息學(xué)分析結(jié)果

基于Illumina MiSeq和Oxford Nanopore MinION測(cè)序平臺(tái)技術(shù),獲得了PD49株的全基因組序列。

生物信息學(xué)分析顯示:①染色體(PD49-chr)的長(zhǎng)度為4844 054 bp,攜帶有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶blaKLUC-1基因以及多個(gè)耐藥相關(guān)的外排泵基因,如acrA、acrB、TolC、mdtB、和mdtC等。②PD49株攜帶1個(gè)質(zhì)粒(被命名為pPD49-OXA-181),攜帶D類(lèi)碳青霉烯類(lèi)耐藥基因blaOXA-181和喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrS1,大小為51 479 bp。依據(jù)復(fù)制子類(lèi)型,質(zhì)粒pQD49-OXA-181屬于ColKP3/IncX3型雜合質(zhì)粒。③與OXA-48相比(GenBank Accession Number KC354801.1),該OXA-181基因顯示了45個(gè)核苷酸替代,導(dǎo)致4個(gè)氨基酸差異(T104A,N110D,E168Q和S171A)。測(cè)序分析的詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49的生信分析結(jié)果

2.3 質(zhì)粒的液相接合及接合子的驗(yàn)證結(jié)果

PD49株作為供體菌與作為受體菌的E.coliJ53AziR的液相接合,獲得了接合子,命名為PD49-C株。然后,對(duì)接合子進(jìn)行碳青霉烯酶檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)和S1核酸酶切的脈沖場(chǎng)凝膠電泳(同時(shí)對(duì)PD49和PD49-C株),以進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果顯示:①接合子PD49-C在OXA-48型碳青霉烯酶處也呈現(xiàn)陽(yáng)性條帶。②與PD49株比較,接合子PD49-C除了對(duì)哌拉西林/他唑巴坦顯示敏感外,其他藥敏結(jié)果基本一致;然而,接合子PD49-C與E.coliJ53AziR比較,對(duì)厄他培南、亞胺培南和美羅培南的MIC值提高了4～8倍。PD49、接合子PD49-C和E.coliJ53AziR的藥敏比較見(jiàn)表1。③S1-PFGE顯示,PD49和接合子PD49-C都攜帶一個(gè)分子量大小相同的質(zhì)粒,且與測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)粒pPD49-OXA-181的大小相一致,結(jié)果見(jiàn)(S1-PFGE)圖2。以上結(jié)果表明,攜帶blaOXA-181基因是PD49對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的機(jī)制。另外,攜帶blaOXA-181基因的pQD49-OXA-181質(zhì)?？山?jīng)液相接合傳遞到E.coliJ53AziR,這提示該質(zhì)粒具有經(jīng)水平傳遞到其他不同種的腸桿菌科細(xì)菌的潛能,可能導(dǎo)致耐藥基因的播散和對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥率的上升。

圖2 S1核酸酶切的脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果圖

3 討論

耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌構(gòu)成了全球緊迫的抗生素耐藥性威脅,因?yàn)樗饶芡ㄟ^(guò)克隆播散,又能通過(guò)諸如質(zhì)粒等移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)將碳青霉烯酶基因水平轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌。OXA-181是最常見(jiàn)的OXA-48-like碳青霉烯酶之一,世界上許多國(guó)家都報(bào)道了產(chǎn)生OXA-181酶的腸桿菌,并且攜帶blaOXA-181基因的細(xì)菌主要是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌[5],但尚未有克呂沃爾氏菌屬細(xì)菌攜帶該基因的報(bào)道。因此,本研究的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49攜帶blaOXA-181基因?qū)儆趪?guó)內(nèi)外首次報(bào)道。

廈門(mén)希瓦菌(Shewanellaxiamenensis)被認(rèn)為blaOXA-181基因的祖先,其染色體遺傳結(jié)構(gòu)與報(bào)道的ColE型攜帶blaOXA-181基因的質(zhì)粒相似[8]。PD49株攜帶1個(gè)被命名為pPD49-OXA-181的質(zhì)粒,大小為51 479 bp,且碳青霉烯酶基因blaOXA-181和喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrS1都位于該質(zhì)粒上,并可經(jīng)液相接合試驗(yàn)傳遞到E.coliJ53AziR,這與LIU的結(jié)果[9]類(lèi)似。依據(jù)復(fù)制子,該質(zhì)粒屬于ColKP3/IncX3雜合型。YU等[10]從NCBI RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)下載的35150個(gè)細(xì)菌質(zhì)粒中鑒定出的81個(gè)blaOXA-181陽(yáng)性質(zhì)粒呈現(xiàn)多種類(lèi)型,但主要由IncX3型質(zhì)粒攜帶。然后,YU等又系統(tǒng)地比較了66個(gè)blaOXA-181陽(yáng)性IncX3質(zhì)粒的宿主菌株、質(zhì)粒類(lèi)型和遺傳背景,發(fā)現(xiàn)攜帶blaOXA-181的IncX3質(zhì)粒大多為ColKP3/IncX3雜合質(zhì)粒,每個(gè)質(zhì)粒長(zhǎng)度為51 kb,主要分布在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中。另外,大多數(shù)攜帶blaOXA-181的IncX3質(zhì)粒來(lái)自人類(lèi)和大多數(shù)IncX3質(zhì)粒同時(shí)含有blaOXA-181和qnrS1基因[10],這與本文研究的pPD49-OXA-181質(zhì)粒相同。另外,與blaOXA-48的序列相比較(GenBank Accession Number KC354801.1),本研究的質(zhì)粒pPD49-OXA-181攜帶的blaOXA-181基因顯示了45個(gè)核苷酸替代,導(dǎo)致4個(gè)氨基酸差異(T104A,N110D,E168Q和S171A)。

本研究的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49的染色體(PD49-chr)上攜帶有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶blaKLUC-1基因以及多個(gè)耐藥相關(guān)的外排泵基因,如acrA、acrB、TolC、mdtB、和mdtC等。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶KLUC由blaKLUC基因編碼,屬于CTX-M型酶。迄今為止,blaKLUC基因有6個(gè)亞型(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene#KLUC)。2001年,從棲冷克呂沃爾氏菌中發(fā)現(xiàn)一個(gè)位于染色體上命名為blaKLUC-1的新基因,編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL),它與其他CTX-M成員具有77%～86%的相同氨基酸[3]。然而,blaKLUC-2基因編碼的KLUC-2是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的CTX-M家族ESBL,從陰溝腸桿菌中鑒定出來(lái),與KLUC-1相比具有單一氨基酸差異(G115R)[11]。隨后,blaKLUC-3和blaKLUC-4基因(編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶KLUC-3和KLUC-4)也都被證明位于大腸埃希菌和陰溝腸桿菌攜帶的質(zhì)粒上[12]。最近,LI 等[13]報(bào)道肺炎克雷伯菌臨床株攜帶blaKLUC-5基因,且該基因也位于質(zhì)粒上。與之前發(fā)現(xiàn)的KLUC-1(G18S)和KLUC-3(G240D)相比,blaKLUC-5基因編碼的KLUC-5酶具有氨基酸替代。blaKLUC-6基因由Tanabe在日本的城市污水中分離的棲冷克呂沃爾氏菌6BC3中發(fā)現(xiàn),于2022年提交了該基因的序列(GenBank Accession Number NG_148621.1)。以上研究和報(bào)道提示,blaKLUC基因可通過(guò)移動(dòng)遺傳元件在菌株的染色體和質(zhì)粒之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。

對(duì)于喹諾酮(fluoroquinolones,FQ)耐藥的傳播,質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)基因起著主要作用。已知幾種PMQR基因(qnr,aac(6’)-lb-cr,qepA和oqxAB)與FQ易感性降低有關(guān)。特別是qnrS1被報(bào)道為來(lái)自食品、牲畜和人源的大腸埃希菌中可傳播的FQ抗性基因。另外,qnrS1基因常與廣譜β-內(nèi)酰胺酶或其他抗菌藥物的耐藥基因共存在同一個(gè)質(zhì)粒上,以便通過(guò)抗微生物的共選擇,使這些菌株能夠長(zhǎng)期存在,這不僅提供了選擇優(yōu)勢(shì),而且促進(jìn)了它們的傳播。此外,qnrS1基因的高度流行與攜帶該基因的質(zhì)粒類(lèi)型相關(guān),如IncX型質(zhì)粒最多見(jiàn)[14]。本研究的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49攜帶的blaOXA-181和qnrS1共存于ColKP3/IncX3雜合型pPD49-OXA-181質(zhì)粒上,這進(jìn)一步提示了這兩個(gè)基因的傳播和流行都與IncX型質(zhì)粒相關(guān)。

綜上所述,本研究表明棲冷克呂沃爾氏菌臨床株P(guān)D49對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的分子機(jī)制與其攜帶blaOXA-181基因有關(guān)。另外,同時(shí)攜帶blaKLUC-1、blaOXA-181和qnrS1基因的克呂沃爾氏菌為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。此外,本研究結(jié)果有助于增強(qiáng)對(duì)攜帶blaOXA-181和qnrS1基因的IncX3質(zhì)粒的遺傳多樣性和特征的理解,并進(jìn)一步闡明了它們?cè)讷@得和傳播這兩個(gè)基因的腸桿菌中的作用。