構(gòu)建沉默Runx2基因的牙齦癌細(xì)胞慢病毒載體*

胡金龍 秦晗 張勇 鄧晴

(南京醫(yī)科大學(xué)連云港臨床醫(yī)學(xué)院口腔科,江蘇 連云港 222002)

口腔鱗狀細(xì)胞癌約占全身惡性腫瘤的3%[1],而牙齦是口腔鱗狀細(xì)胞癌的最常發(fā)生部位之一,占口腔鱗狀細(xì)胞癌的10%～25%[2]。目前,基因治療是廣為研究的癌癥治療新方向,其能夠在分子水平改變細(xì)胞的基因表達(dá),從而使細(xì)胞獲得新的遺傳表型,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、個(gè)性化的癌癥治療[3]。成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)是轉(zhuǎn)錄因子Runx家族中的一員,Runx轉(zhuǎn)錄因子家族在不同的組織和細(xì)胞譜系中發(fā)揮著重要作用,其中Runx2是胚胎期間骨骼發(fā)育和其他器官如乳腺和前列腺形態(tài)發(fā)生過程中的必需轉(zhuǎn)錄因子[4]。相關(guān)研究表明Runx2在Ⅱ型糖尿病腎病、骨質(zhì)疏松等疾病中起重要的調(diào)控作用[5-6]。Runx2同樣參與惡性腫瘤的生物學(xué)行為,與乳腺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種惡性腫瘤的進(jìn)展聯(lián)系緊密[7-8]。然而Runx2在牙齦癌中的作用鮮有報(bào)道,在牙齦癌中的不同時(shí)空表達(dá)水平及調(diào)控機(jī)制仍未明確。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染GNM細(xì)胞,獲得穩(wěn)定沉默Runx2基因的GNM細(xì)胞,為進(jìn)一步探討其在牙齦癌中的作用及其分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清(澳洲Ausbian公司),基礎(chǔ)培養(yǎng)基和DPBS(美國(guó)Corning公司),兔抗人Runx2抗體、兔抗及鼠抗IgG抗體(美國(guó)CST公司),鼠抗人β-actin抗體(美國(guó)SANTA CRUZ公司),胰酶(美國(guó)GIBCO公司),Trizol(上海普飛生物技術(shù)有限公司),M-MLV(美國(guó)promega公司),oligo dT(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),BCA Protein Assay Kit(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),RIPA 裂解液(上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞 人上頜牙齦癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系GNM細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供)凍存管從液氮罐中取出,解凍后1300 rpm離心3 min,消毒后移至生物安全柜。取出凍存管吸除凍存液上清,加入1 mL完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸細(xì)胞,細(xì)胞懸液接種至含有3 mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,輕晃勻后將其放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每過24 h進(jìn)行1次培養(yǎng)液更換,細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右再做傳代培養(yǎng)。用含HiTransG P的轉(zhuǎn)染液將完全培養(yǎng)基制成(3～5)×104個(gè)mL-1細(xì)胞懸液,隨之接種細(xì)胞懸液到培養(yǎng)板,直至細(xì)胞達(dá)到15%～30%鋪板量左右。鋪板后無需培養(yǎng),病毒按MOI=10進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將各孔中轉(zhuǎn)染16 h后的細(xì)胞收集起來轉(zhuǎn)移至12孔板中,并補(bǔ)加1 mL完全培養(yǎng)基,輕混勻后放至培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后120 h,細(xì)胞繁殖良好未出現(xiàn)大量的細(xì)胞死亡現(xiàn)象,NC組和CON組具有相似的細(xì)胞狀態(tài),使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記基因的表達(dá),熒光率即為病毒的陽性轉(zhuǎn)染率。

1.2.2 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Runx2基因轉(zhuǎn)錄水平 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,2000 r/min離心5 min后吸除其中上清液,向沉淀物中加入1 mL Trizol并充分混勻,室溫下靜置5 min后轉(zhuǎn)移至新EP管;反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(使用M-MLV試劑盒),將2 μL反轉(zhuǎn)錄引物與2.0 μg Total RNA一同混入PCR小管中,再加入RNase-Free H2O至11 μL,混勻后進(jìn)行離心,70 ℃水浴10 min,立即對(duì)其進(jìn)行冰浴退火。按比例配制反應(yīng)體系,混勻后進(jìn)行短暫離心。42 ℃水浴中上述體系反應(yīng)1 h后,70 ℃水浴10 min令反轉(zhuǎn)錄酶失活,最后得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA將置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?步法實(shí)時(shí)PCR并制作擴(kuò)增曲線和熔解曲線,然后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所需引物由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司設(shè)計(jì)合成,見表1。

表1 目的基因與內(nèi)參基因引物

1.2.3 Western Blot檢測(cè)Runx2蛋白表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,使用PBS洗滌兩次后加入RIPA,在冰上進(jìn)行裂解10 min,刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新EP管中,超聲使細(xì)胞破碎,4 ℃、12000 rpm離心15 min,利用BCA法測(cè)定離心后上清液蛋白的濃度。加入新裂解液使每個(gè)樣品蛋白濃度調(diào)至2 μg/μL-1,加入1/5體積的6X lodding buffer并混勻,100 ℃浴煮 10min,短暫離心后保存在-80 ℃?zhèn)溆谩DS-PAGE電泳,使用濕轉(zhuǎn)法免疫印跡。室溫下對(duì)PVDF膜封閉1 h,加入稀釋后一抗Runx2(1∶1000)、β-actin(1∶2000)4 ℃孵育過夜,TBST溶液洗膜,加入稀釋后二抗(1∶5000)室溫下孵育1.5 h,TBST溶液洗膜,X光顯影。利用Image J軟件分析圖像中蛋白OD比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染效率 病毒轉(zhuǎn)染120 h后,各組細(xì)胞狀態(tài)相當(dāng),細(xì)胞未出現(xiàn)大量死亡;熒光顯微鏡觀察標(biāo)記基因表達(dá),熒光率即為陽性轉(zhuǎn)染率。NC組熒光表達(dá)未見;KD1組熒光表達(dá)較高;KD2組熒光表達(dá)最高;KD3組熒光表達(dá)較低,見圖1。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染GNM細(xì)胞結(jié)果

2.2 GNM細(xì)胞Runx2 基因轉(zhuǎn)錄水平 實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線中各管曲線的平行性好,提示各管擴(kuò)增效應(yīng)相近,熔解曲線中Runx2基因和GAPDH基因均為單一峰型,峰形基底窄而峰高,提示引物設(shè)計(jì)良好,特異性強(qiáng),見圖2。PCR結(jié)果顯示,相較于NC組,KD2組的GNM細(xì)胞Runx2基因敲低效率最高,約達(dá)到64.4%(P<0.05),見圖3。

圖2 擴(kuò)增曲線和溶解曲線

圖3 各組Runx2 mRNA表達(dá)水平分析

2.3 GNM細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)水平 Western Blot結(jié)果顯示,相較于NC組,KD2組的GNM細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)下調(diào)最為明顯(P<0.05),見圖4、5。

圖4 Western Blot結(jié)果

圖5 各組Runx2 蛋白表達(dá)水平分析

3 討論

RNA干擾技術(shù)(RNAi)是應(yīng)用較廣泛的基因沉默方法,其相較DNA敲除技術(shù)操作簡(jiǎn)單且沉默效果可靠,現(xiàn)已有多種基于RNAi的癌癥治療制劑投入臨床試驗(yàn)[9-10]。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科,其可將自身RNA整合到宿主染色體上,慢病毒載體是通過改造慢病毒基因使其失去毒性后形成的一種基因編輯工具,以實(shí)現(xiàn)搭載基因在宿主細(xì)胞形成穩(wěn)定表達(dá)[11]。慢病毒轉(zhuǎn)染是RNAi常用的基因?qū)敕绞?即首先利用質(zhì)粒在輔助細(xì)胞內(nèi)包裝獲得慢病毒顆粒,攜帶dsRNA的慢病毒顆粒感染目的細(xì)胞,隨之針對(duì)靶基因的dsRNA隨病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA并結(jié)合到目的細(xì)胞的染色體上,形成穩(wěn)定表達(dá)的dsRNA。胞質(zhì)中核酸內(nèi)切酶Dicer將再生成的dsRNA切割成小干擾RNA(siRNA),siRNA在RNA解旋酶作用下形成反義鏈RNA,反義鏈RNA與靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)結(jié)合使其切割后降解,同時(shí)siRNA反義鏈可激活dsRNA合成形成RNAi循環(huán),從而特異性抑制靶基因表達(dá)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)即利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組基因整合到GNM細(xì)胞的基因組中,隨之細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)的RNA干擾使Runx2基因達(dá)到穩(wěn)定沉默效果。

慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果受多種因素影響,包括培養(yǎng)時(shí)間、轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞特性、病毒細(xì)胞比例等。實(shí)驗(yàn)前利用預(yù)實(shí)驗(yàn)首先確定病毒轉(zhuǎn)染的適宜條件,陰性對(duì)照病毒選用CON-313,按轉(zhuǎn)染試劑分為A組:在常規(guī)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染病毒;B組:在添加HitransG A(簡(jiǎn)稱A液)的常規(guī)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染病毒;C組:在添加HitransG P(簡(jiǎn)稱P液)的常規(guī)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染病毒;Control組:常規(guī)培養(yǎng)基中觀察細(xì)胞是否正常生長(zhǎng)。而后按照感染復(fù)數(shù)分4組進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染:MOI=1; MOI=10; MOI=50; MOI=100,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)GNM細(xì)胞而言,在含P液的常規(guī)培養(yǎng)基中,病毒按 MOI=10 更易轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染率可達(dá)80%且細(xì)胞增殖良好。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用慢病毒轉(zhuǎn)染GNM細(xì)胞,將病毒按序號(hào)分為:NC組(CON313)、KD1組LV-Runx2-RNAi(80978-1)、KD2組LV-Runx2-RNAi(80979-1)和KD3組LV-Runx2-RNAi(80980-1)。病毒轉(zhuǎn)染后16 h換液,120 h后熒光顯微鏡觀察到各組細(xì)胞狀態(tài)良好,其中NC組熒光表達(dá)未見;KD1組熒光表達(dá)較高;KD2組熒光表達(dá)最高;KD3組熒光表達(dá)較低,KD2組相較其他組病毒的轉(zhuǎn)染效率更高。RT-PCR分析顯示KD2組Runx2基因沉默效果最佳,沉默效率可達(dá)64.4%。Western Blot結(jié)果顯示KD2組GNM細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)下調(diào)顯著,較其他實(shí)驗(yàn)組具有明顯差異。實(shí)驗(yàn)篩選出特異性沉默GNM細(xì)胞Runx2基因的慢病毒組,并初步確定作用時(shí)間及各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)適宜值等。

Runx家族都包含一個(gè)Runt的DNA結(jié)合域,使Runx蛋白與DNA結(jié)合以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Runx2通常被稱為成骨的主開關(guān),是機(jī)體骨代謝過程中的橋梁[14]。Runx2是促進(jìn)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子,Runx2基因突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致顱鎖骨發(fā)育不良、顱縫早閉等遺傳性骨病的發(fā)生[15-17]。Runx2主要表達(dá)兩種亞型,其中Ⅱ型Runx2主要在骨譜系中表達(dá),而癌細(xì)胞中表達(dá)的是由近端P2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的Ⅰ型Runx2[18]。Runx2 的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞潛能相關(guān),Guo等[19]研究發(fā)現(xiàn)Runx2在胃癌的早期階段高表達(dá),Runx2的表達(dá)上調(diào)Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)激發(fā)胃癌腫瘤細(xì)胞的致瘤潛力。此外有研究稱多發(fā)性骨髓瘤中Runx2正向調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制基因生存素(survivin)表達(dá),并增強(qiáng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖[20]。Runx2的異常表達(dá)還會(huì)作用于腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程[21-23]。Gowda等[24]發(fā)現(xiàn)miR-302b通過靶向Runx2抑制乳腺癌的腫瘤進(jìn)展,其與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。骨轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞常顯示成骨細(xì)胞樣細(xì)胞表型,如腫瘤細(xì)胞通過Runx2依賴性信號(hào)傳導(dǎo)表達(dá)甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrp)、NF-κB受體活化因子配體(nuclear factor-κB receptor activating factor ligand,RANKL),激活破骨細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路使腫瘤周圍骨質(zhì)破壞,促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移腫瘤生長(zhǎng)[25-26]。同時(shí)腫瘤細(xì)胞能通過Runx2表達(dá)Dickkopf相關(guān)蛋白1(DKK1)抑制成骨細(xì)胞Wnt通路阻斷腫瘤周圍環(huán)境的骨質(zhì)修復(fù),以促進(jìn)腫瘤的溶骨性骨轉(zhuǎn)移[27]。以上研究提示Runx2在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,然而牙齦癌中Runx2的調(diào)控機(jī)制尚未明確,因此探討Runx2在牙齦癌中的潛在作用機(jī)制具有顯著的臨床意義。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建沉默Runx2基因的GNM細(xì)胞慢病毒載體,此慢病毒載體是進(jìn)一步研究Runx2基因沉默后GNM細(xì)胞功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變的重要實(shí)驗(yàn)工具。Runx2在牙齦癌細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中的時(shí)空表達(dá)變化及調(diào)控機(jī)制將是課題組接下來深入研究的重點(diǎn)內(nèi)容,借此以期發(fā)掘出牙齦癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵機(jī)制,從而為牙齦癌的靶向治療提供理論參考。