川西北高原地區(qū)牦牛腹瀉大腸埃希菌毒力基因檢測及致病性分析

毛惠玲,陳席敏,湯文慧,孫溪晗,冉 敏,張 露,任玉鵬*

(1.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041;2.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

引起腹瀉的大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)根據(jù)流行病學(xué)特征、臨床特征、主要毒力基因和血清型等差異至少可分為6類:腸致病性大腸埃希菌 (EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌 (ETEC)、腸侵襲性大腸埃希菌 (EIEC)、腸出血性大腸埃希菌 (EHEC)、腸黏附性大腸埃希菌 (EAEC) 和彌散黏附性大腸埃希菌 (DAEC)[1]。致病性大腸埃希菌常導(dǎo)致人和多種動物(犢牛、仔豬、羔羊、幼兔和家禽等)腹瀉和敗血癥,直接或間接對畜禽養(yǎng)殖造成經(jīng)濟損失[2]。不同地區(qū)、不同動物種類大腸埃希菌病的患病率為54%～100%。川西北高原牧區(qū)是我國五大牧區(qū)之一,牦牛是牧區(qū)的重要經(jīng)濟支柱和主要食品來源,在高原地區(qū)具有不可替代的生態(tài)與經(jīng)濟地位。牦牛大腸埃希菌病主要危害哺乳階段的犢牛,導(dǎo)致其腹瀉和生長遲緩,也會影響成年牦牛的生產(chǎn)性能。冬季發(fā)病常導(dǎo)致犢牛發(fā)病率達到100%,病死率超過90%[3],嚴重影響川西北高原地區(qū)畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

近年來,國內(nèi)關(guān)于川西北高原地區(qū)牦牛源大腸埃希菌病流行情況和致病性研究報道較少。已有研究表明,過去在該地區(qū)致牦牛腹瀉大腸埃希菌中,熱敏腸毒素(LT)、耐熱腸毒素(STa)、非菌毛黏附素(eaeA)、黏附性菌毛(K99、F41)、溶血素(hlyA)和志賀毒素(Stx1、Stx2)等毒力因子都被不同程度地檢出[4]。其中 K99 和 F41 菌毛基因在犢牛腹瀉大腸埃希菌中最為常見,是引起腸壁細胞功能障礙的重要毒力因子[5]。ST 和LT 是ETEC在增殖過程中分泌的蛋白質(zhì)毒素,可影響腸道上皮細胞內(nèi)的體液平衡[6];志賀毒素(Stx1,Stx2)是產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(STEC)重要的致病因子,由整合到細菌基因組中的λ噬菌體編碼[7],可通過抑制核糖體的活動,影響宿主細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成,具有較強的細胞毒性和腸毒性[8];Stx基因亞型在不同宿主動物中有所差異,如:Stx1a主要分布于牛源STEC,Stx1c主要分布于羊源STEC[9-10]。

本研究對2021—2022年導(dǎo)致川西北牦牛腹瀉的大腸埃希菌進行分離鑒定,并對其遺傳進化特征、毒力基因攜帶情況和致病性進行研究,以期為川西北高原地區(qū)牦牛大腸埃希菌病的防治提供參考依據(jù),并助力推動牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物165只SPF級雌性昆明小鼠(18～22 g)購自成都達碩實驗動物有限公司。本試驗所用實驗動物均經(jīng)四川省成都市西南民族大學(xué)動物保護與使用委員會批準(zhǔn)。

1.2 病料的采集與處理本研究所用樣本分別于2021—2022年采自四川省雅江縣、石渠縣、松潘縣和美姑縣等地犢牛腹瀉樣本,共計160份。所有樣本均由四川省動物疫病預(yù)防控制中心提供。樣本與50%無菌甘油-生理鹽水凍存液按1∶1混勻,置于-80℃保存。

1.3 主要試劑乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、革蘭染色液和腸桿菌科細菌生化鑒定管均購自杭州微生物試劑有限公司;細菌DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和2×Taq PCR Master Mix(W9115)均購自天根生化科技(北京)有限公司;O抗原單因子鑒定血清購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.4 細菌分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定用接種環(huán)挑取處理后的糞便懸液樣本,接種在乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基,于37℃振蕩培養(yǎng)1 h;將菌液劃線接種到麥康凱瓊脂,37℃ 培養(yǎng)24 h,挑取單個粉紅色菌落于伊紅美藍瓊脂上進一步純化。挑取形態(tài)大小均一且呈黑色金屬光澤的菌落制備抹片,經(jīng)革蘭染色液處理后于100×油鏡下觀察菌體形態(tài)特征;將染色特性一致且符合大腸埃希菌特征的細菌用TSB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),菌液與50%甘油-生理鹽水混合,于-80℃凍存。

1.5 細菌生化鑒定分離純化的疑似菌株通過腸桿菌科微量化學(xué)鑒定管進行鑒定,具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。接種后將微量生化管置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后,根據(jù)編碼手冊判斷分離菌種類并記錄其生化特性。

1.6 細菌16S rRNA 基因檢測按照細菌DNA提取試劑盒說明書提取核酸,用16S rRNA基因檢測引物[11]進行PCR擴增,上、下游引物序列分別為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,R:5′-TAC-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,DNA模板1 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)條件:94℃ 2 min;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 90 s,循環(huán)35次;72℃ 8 min,16℃保存。擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。

1.7 細菌毒力基因檢測用提取的細菌DNA為模板,分別對K88、K99、F17、F6、F18、F41、bfpA、hlyA、Stx1、Stx2、LT、eaeA、STa 和 STb 等14個毒力基因進行PCR擴增,所用引物均參照文獻[12-17]的序列合成,詳見表1。反應(yīng)體系(25 μL):2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板1 μL,ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s,退火(退火溫度見表1)35 s,72℃延伸時間按1 kb/min設(shè)定,循環(huán)35次;72℃ 10 min;16℃保存。

表1 引物信息

1.8 血清型鑒定使用O抗原單因子鑒定血清進行玻片凝集試驗,鑒定大腸埃希菌的血清型。

1.9 K99+F41+菌株致病性試驗采用平皿計數(shù)法對原始菌液細菌樣本進行計數(shù)。將所有SPF級昆明小鼠隨機分成33組,每組5只。隨機選取一組作為空白對照,按每只小鼠0.2 mL的劑量肌肉注射無菌生理鹽水。其余小鼠用于攻毒試驗,攜帶K99菌毛基因的細菌菌液按5倍倍比稀釋,H5-2株(9.7×1011～1.24×107CFU/mL)、F2株(9.4×1011～1.2×107CFU/mL)、FR3株(1×1012～1.28×107CFU/mL)和FR2株(8.2×1011～1.05×107CFU/mL),各菌株設(shè)8個濃度梯度,每個濃度注射5只小鼠。攻毒后連續(xù)7 d觀察記錄小鼠死亡情況,剖檢并觀察病理變化。

1.10 牦牛源大腸埃希菌基因的生物信息學(xué)分析將細菌16S rRNA基因序列與GenBank登錄的多個動物源參考菌株的16S rRNA基因序列進行同源性比較;用MEGA 7.0將34株牦牛源大腸埃希菌16S rRNA基因和K99菌毛基因序列與GenBank中的參考菌株序列構(gòu)建進化樹,分析其演化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 分離菌菌落及菌體形態(tài)特征在所有牦牛腹瀉樣本中,34株分離菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基接種后生長出圓形、光滑、潮濕的粉紅色菌落,在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上生長出黑色圓形、有金屬光澤的菌落。挑取單個菌落進行革蘭染色,在顯微鏡下,觀察發(fā)現(xiàn)分離菌均為革蘭陰性短桿菌,分散或成對存在。

2.2 分離菌生化鑒定結(jié)果34株分離菌的生化鑒定結(jié)果均符合大腸埃希菌特征。分離菌具有運動性,靛基質(zhì)試驗、甲基紅試驗均為陽性,枸櫞酸鹽利用試驗、硫化氫試驗均為陰性。其中RA5菌株賴氨酸脫羧酶試驗為陰性,其余菌株均為陽性(不同種間生化特性有差異);鳥氨酸脫羧酶試驗中,9株分離菌(RA5、D6、H2-3、H2-2、H5-2、H1-1、H2-1、H4-1、F13)為陰性,其余25株均呈陽性;棉子糖利用試驗中,RA5、F1、D6、H2-3、H2-2、H1-1、R2-1、H4-1、H5-2、H2-3等10株分離菌呈陰性,其余多數(shù)菌株呈陽性;山梨醇試驗中,5株分離菌(H4-1、R2-1、H1-1、H2-2、H2-3)為陰性,其余菌株均為陽性;木糖試驗中,3株菌株(RD4、RC4、RD2)呈陰性,其余均呈陽性。

2.3 細菌 16S rRNA PCR鑒定結(jié)果將34個經(jīng)微量生化鑒定為陽性的細菌,用16S rRNA通用引物進行PCR擴增,獲得與預(yù)期大小相符的條帶。通過產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn),34株細菌16S rRNA基因序列的同源性為95%～99%,所有分離菌與NCBI上登錄的大腸桿菌菌株基因序列同源性均高于95%。其中主要與牛源、豬源和禽源大腸埃希菌16S rRNA 基因序列相似度較高。如與牛源大腸埃希菌 DSPV 284T株(FJ997270.1)、4097株(FJ405353.1)和RREC Ⅲ株(AF527825.1)同源性達99%以上,與豬源 K-12 C600株(M35282.1)同源性高于98%,與鴨源 J11株(KR870316.1)同源性為96.9%。

2.4 細菌毒力基因檢測結(jié)果34株細菌毒力基因檢測結(jié)果顯示,多個菌株攜帶Stx1、hlyA、eaeA、K99、F17和F41基因,其擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期相符(圖1)。不同菌株攜帶毒力基因情況見表2,其中 hlyA 100%(34/34)、eaeA 100%(34/34)檢出率最高,其次為 K99 11.76%(4/34)、F17 8.82%(3/34)、F41 14.7%(5/34)、Stx1 5.88%(2/34)。此外,部分菌株存在同時攜帶多種毒力基因的情況,如:H5-2、FR3、F2株同時攜帶K99、F41、hlyA、eaeA基因;FR2株攜帶K99、F41和hlyA基因;R2-1株攜帶F41、hlyA、eaeA基因;H2-3、H2-2、D6株攜帶F17、hlyA、eaeA基因;H2-4、H5-4株攜帶Stx1、hlyA、eaeA毒力基因。

表2 部分菌株攜帶各類毒力基因情況

M.DL2000 DNA Marker;1～6.分別為K99(314 bp)、Stx1(664 bp)、hlyA(533 bp)、eaeA(425 bp)、F41(380 bp)、F17(411 bp)基因

2.5 血清型鑒定34株致病性大腸埃希菌中鑒定出5種血清型,分別為 O1、O72、O117、O126和O152,其中O152為優(yōu)勢血清型,檢出率為 44.1%(15/34),其次為 O1 5.9%(2/34)、O72 23.5%(8/34)、O126 14.7%(5/34)和O117 11.8%(4/34)。

2.6 K99+F41+菌株基因生物學(xué)信息分析

2.6.1K99+F41+大腸埃希菌的同源性分析 同源性分析結(jié)果顯示,牦牛源大腸埃希菌H5-2、F2、FR3、FR2株與其他動物源大腸埃希菌參考序列同源性為94.4%～100%。其中F2株與人源TEM160株 (MT928774.1)、豬源WS株 (MN086364.1) 同源性最高,均為97.1%;FR2株與JE86-ST02株 (AP022811.1)、E15042株 (AP024478.1)同源性最高,為 97.6%;FR3株與豬源E.colistrain 202 16S rRNA株 (MH671481.1) 同源性100%;H5-2與禽源E.colistrain HYulww1株 (MT740347.1) 同源性最高,為96.9% (圖2)。

圖2 攜帶K99基因菌株的16S rRNA基因序列相似性分析結(jié)果

2.6.2遺傳進化分析 根據(jù)K99基因構(gòu)建的進化樹結(jié)果顯示,所有菌株分成3個大支。H5-2和FR2株與其他動物源菌株遺傳距離較遠,且獨立形成2個分支;FR2與阿根廷牛源ETEC(KX461932.1)親緣關(guān)系最近;而FR3與阿根廷牛源ETEC(KX461931.1)、越南豬源ETEC(JX987524.1)聚為1個小支,可能存在相似的演化關(guān)聯(lián)(圖3)。

2.7 小鼠致病性試驗結(jié)果

2.7.1小鼠剖檢病理變化 攻毒試驗結(jié)果顯示,H5-2、F2、FR3、FR2株分別在3.88×109,3.76×109,4×109,3.28×109CFU/mL可使小鼠24 h內(nèi)死亡,其余濃度菌液在24 h后也出現(xiàn)了精神萎靡、體質(zhì)量減輕、厭食、怕冷聚堆等癥狀且相繼死亡;對照組小鼠無異?，F(xiàn)象。剖檢死亡小鼠可見腹腔內(nèi)有大量膠凍樣積液,肝臟、脾臟淤血、出血;肺臟充血水腫;腸壁變薄,腸腔內(nèi)充滿稀薄內(nèi)容物(圖4)。

2.7.2K99+F41+大腸埃希菌半數(shù)致死量(LD50)測定 統(tǒng)計4株攜帶K99基因和F41基因的大腸埃希菌攻毒小鼠的死亡情況,應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行細菌LD50的計算,得到各菌株的LD50,具體參照文獻[18]方法進行。結(jié)果顯示,各菌株LD50分別為:H5-2株 3.46×108CFU/mL(95% CI:9.60×107～1.25×109CFU/mL)、F2株4.53×108(95% CI:1.31×108～1.70×109CFU/mL)、FR3株9.96×107(95% CI:2.04×107～3.78×108)、FR2株5.29×108(95% CI:1.62×108～2.07×109CFU/mL)。

圖3 K99 菌毛基因序列系統(tǒng)進化樹

A～D.分別為攻毒組小鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腸;E～H.分別為對照組小鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腸

2.7.3小鼠生存曲線 通過GraphPad Prism 5計算4株K99+F41+菌株對小鼠的致死率,建生存曲線。結(jié)果顯示,在劑量為109CFU/mL時,H5-2、FR3和FR2株可在攻毒后1 d 100%致死小鼠,F2株于攻毒后2 d可100%致死小鼠(圖5)。

3 討論

由于川西北高原地區(qū)生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣,牦牛又多以自由放養(yǎng)方式為主,使大腸埃希菌病長期對牦牛健康造成影響。尤其在冬季感染導(dǎo)致犢牛劇烈腹瀉、生長遲緩和存活率下降等問題嚴重阻礙了牧區(qū)經(jīng)濟發(fā)展。大腸埃希菌的血清型和毒力基因復(fù)雜多樣,與其致病性密切相關(guān)。研究表明,K99、F41等黏附性菌毛是致牛、羊腹瀉ETEC的主要致病因子[19-20]。ETEC可借助黏附素黏附于宿主腸道上皮細胞定居繁殖并產(chǎn)生腸毒素引起腸壁細胞功能障礙。此外,K99可誘導(dǎo)熱穩(wěn)定性毒素的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致腸道氯化物的分泌量上調(diào),在滲透作用下將水吸入腸腔,導(dǎo)致犢牛腹瀉;F41菌毛可以通過與血型糖蛋白AM受體結(jié)合,協(xié)助細菌黏附于動物小腸上皮細胞[21]。本研究分離的34株牦牛源大腸桿菌中,K99 和F41基因攜帶率分別為11.76%(4/34)和 F41 14.7%(5/34),且攜帶K99基因的菌株(H5-2、F2、FR3和FR2)也同時攜帶F41基因,表明該菌株可能對犢牛具有較強致病性的ETEC[22]。有研究表明,hlyA、eaeA、LT、Stx1、Stx2等也是導(dǎo)致牦牛腹瀉性大腸桿菌中常見的毒力因子[4,23]。如:hlyA溶血素通過hlyA基因編碼合成hlyA原毒素,與鈣結(jié)合在hlyC ?；D(zhuǎn)移酶作用下激活其毒素活性[24]。緊密素eaeA是引起黏附與脫落損傷,導(dǎo)致病畜非出血性腹瀉最重要的一個毒力因子,其編碼的基因位于吸附消除型大腸桿菌(AEEC)染色體上的LEE毒力島[25-26]?；诖?本研究對上述毒力基因進行了檢測,結(jié)果表明,34株牦牛源大腸桿菌中,hlyA、eaeA、F17和Stx1基因攜帶率分別為:hlyA 100%(34/34)、eaeA 100%(34/34)、F17 8.82%(3/34)和Stx1 5.88%(2/34)。同時攜帶多種毒力基因的類型主要包括:K99+F41+hlyA+eaeA;K99+F41+hlyA+;F41+hlyA+eaeA+;F17+hlyA+eaeA+;Stx1+hlyA+eaeA+。其毒力譜與2018年諸明欣等[23]對四川省阿壩州牦牛源大腸桿菌的檢測結(jié)果差異較大,本次分離菌株中hlyA、eaeA、F17、K99和Stx1基因的攜帶率相對較高。不同的毒力因子可能對大腸埃希菌的致病性起到協(xié)同作用。

A～D.分別為H5-2株、F2株、FR3株、FR2株

進一步對K99基因的遺傳進化分析表明,FR2和FR3株與2株阿根廷牛源ETEC均具有較近的親緣關(guān)系,而FR3株還與越南豬源ETEC聚為一個小支,表明上述菌株可能存在相似的演化關(guān)聯(lián),且可能在不同物種間傳播。致病性試驗結(jié)果表明,H5-2、F2、FR3和FR2 4個菌株在109CFU/mL肌肉注射后均可使小鼠24 h內(nèi)死亡,且多個組織器官出現(xiàn)充血、水腫。尤其是感染小鼠都表現(xiàn)出腸炎和腹瀉的癥狀,這與劉勃興等[27]從河北省分離的犢牛腹瀉大腸埃希菌的結(jié)果類似,也進一步提示本次分離的牦牛源攜帶K99基因大腸埃希菌具有較強的致病性和跨種傳播能力。

此外,在我國不同地區(qū)流行的牛源大腸埃希菌血清型具有一定差異。如:梁艷艷等[28]對2022年河北保定牛群中來源的25株致病性大腸桿菌O血清型鑒定發(fā)現(xiàn),優(yōu)勢血清型為O157;貢嘎等[29]從西藏自治區(qū)分離的16株牛源大腸埃希菌共檢出8個血清型其中O78占68.75%。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn),引起2021-2022年川西北部分地區(qū)牦牛腹瀉的大腸埃希菌優(yōu)勢血清型為O152。研究表明,O抗原血清型種類與大腸埃希菌致病力相關(guān),但其優(yōu)勢血清型因地域、氣候、牛品種差異而不同[4],對致病性大腸桿菌血清流行病學(xué)的調(diào)查可以為大腸桿菌病的防治提供理論依據(jù)。

綜上所述,本研究對導(dǎo)致川西北地區(qū)牦牛腹瀉的大腸埃希菌進行了系統(tǒng)地分離鑒定,調(diào)查了解了各菌株的生化特征、基因型和血清型,豐富了川西北地區(qū)牦牛大腸埃希菌的相關(guān)研究資料。進一步對大腸埃希菌的毒力基因攜帶情況進行了系統(tǒng)地調(diào)查和分析,并對攜帶K99菌毛基因牦牛源大腸埃希菌的致病性進行了初步研究,為牦牛源致病性大腸埃希菌致病機制的研究奠定了基礎(chǔ),也將為川西北高原地區(qū)牦牛大腸埃希菌病的防控提供理論依據(jù)。