犬2型腺病毒纖突蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

王樅嶸,牛欣蕊,郭江濤,魯維飛,劉忠虎,褚貝貝,付朋飛,王 江*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 河南省動(dòng)物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046;4.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467036)

犬腺病毒(canine adenovirus,CAV)是哺乳動(dòng)物腺病毒屬中致病性最強(qiáng)的一種[1]。CAV根據(jù)抗原性、血凝性和致病性等特性分為犬腺病毒1型(CAV-1)和2型(CAV-2)[2-4]。CAV-1 引起犬傳染性肝炎,多發(fā)于1歲以內(nèi)的犬,臨床癥狀有發(fā)熱、眼鼻分泌物增多、角膜炎以及間質(zhì)性腎炎等[5-6]。CAV-2在臨床上主要引起犬的傳染性喉氣管炎、咽炎、壞死性支氣管炎或肺炎等呼吸道疾病,臨床常表現(xiàn)為高熱、呼吸急促、干咳、漿液或膿性鼻漏及扁桃體腫大等,臨床特征常稱為“犬窩咳[7-8]”。此外也可引起出血性腹瀉等消化道疾病[9-10]。CAV-2的傳染性極強(qiáng),傳播速度快,且往往易與其他病毒或細(xì)菌混合感染,導(dǎo)致犬大多預(yù)后不良。

CAV-2為線型雙鏈DNA病毒,基因組長為30～31 kb。病毒為無囊膜,二十立面體對(duì)稱結(jié)構(gòu),直徑為70～100 nm[11]。病毒粒子的外表面由纖突(fiber)、五鄰體基質(zhì)(penton base)和六鄰體(hexon)衣殼組成[12]。纖突蛋白參與病毒的內(nèi)化過程,在病毒侵染細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用,其介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞受體之間的相互融合。纖突蛋白又可以分為3個(gè)基本結(jié)構(gòu)功能區(qū),包括小節(jié)、基軸和尾曲。纖突小節(jié)呈球形,具有與細(xì)胞表面上特異性受體結(jié)合的功能,及與細(xì)胞上受體結(jié)合和凝集紅細(xì)胞的作用[13],另外其還與腺病毒的組織親嗜性有關(guān)[14]。

本研究將CAV-2分離株CAV-HN45濃縮并滅活后作為抗原免疫BALB/c小鼠,經(jīng)過一系列試驗(yàn)篩選出2株靈敏性高、特異性強(qiáng)的針對(duì)CAV-2 FIBER蛋白單克隆抗體,為建立快速、高效的CAV-2免疫學(xué)檢測技術(shù)和基礎(chǔ)病毒學(xué)研究提供了材料,為我國對(duì)CAV-2的防控提供了備選抗體藥物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與動(dòng)物CAV-HN45株分離自河南安陽某寵物醫(yī)院患病犬。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存),犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCC),感受態(tài)細(xì)胞Top 10由本實(shí)驗(yàn)室制備。pEGFP-C1真核表達(dá)質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)。表達(dá)CAV-2 FIBER的pEGFP-C1-CAV FIBER真核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。聚偏二氟乙烯膜 (PVDF) 購自Millipore公司。HybGro雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司。β-丙內(nèi)酯購自Solarbio公司。佐劑Quick Antibody-Mouse 5W購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。HAT/HT培養(yǎng)基、融合劑PEG1450、商業(yè)化β-actin鼠源單克隆抗體等均購自Sigma公司。Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)、Alexa FluorTM555 goat anti-mouse IgG(H+L)購自Thermo Fisher Scientific。HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。AEC酶底物試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。蛋白質(zhì)Marker購自Thermo Fisher公司。ProteinIso?Protein G Resin購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。IgG抗體亞類鑒定試劑盒購自Si-no Biological公司。清潔級(jí)BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.2 CAV-HN45株的增殖與純化將MDCK細(xì)胞傳代于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)過夜。接種CAV-HN45株病毒液0.5 mL,24～36 h待出現(xiàn)90% 細(xì)胞病變后,凍融3次收毒,8 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞上清,取上清通過蔗糖密度梯度離心法濃縮純化病毒,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CAV-HN45株病毒滅活與小鼠免疫取CAV-HN45株濃縮病毒液,加入β-丙內(nèi)酯(終含量為0.2%)混勻后置4℃滅活48 h,將佐劑Quick Antibody-Mouse 5W與濃縮滅活病毒液等比例配制混勻,免疫病毒劑量為5 μg/只(免疫小鼠體質(zhì)量為25～30 g),腿部肌肉注射免疫7周齡雌性BALB/c小鼠,首免3周后加強(qiáng)免疫1次,免疫劑量及方式同首免;首免5周后,取小鼠尾靜脈血,通過ELISA方法檢測血清抗體水平[15]。

1.4 細(xì)胞融合取抗體水平最高的小鼠處死并收集血清,無菌環(huán)境下取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按10∶1的比例進(jìn)行混合,離心棄上清。向細(xì)胞沉淀中以1 mL/min的速度滴加37℃預(yù)熱的PEG-1450 1 mL,37℃作用90 s進(jìn)行融合,加入14 mL 37℃ 預(yù)熱的DMEM(邊加邊搖),37℃水浴5 min后,緩慢補(bǔ)加37℃ 預(yù)熱的DMEM至40 mL,終止融合。離心后棄上清,加適量的37℃ 預(yù)熱的加HAT的雜交瘤培養(yǎng)基混勻后鋪96孔板進(jìn)行培養(yǎng)[16]。

1.5 單克隆抗體篩選

1.5.1IPMA試驗(yàn)篩選分泌CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系 96孔板中鋪MDCK,接CAV-2病毒液約18 h,用預(yù)冷含3% H2O2的甲醇室溫固定15 min。PBST洗2次,5% 脫脂奶37℃ 封閉2 h。棄封閉液,PBST洗3次,加入融合細(xì)胞上清作為一抗,37℃ 孵育2 h;棄一抗,PBST洗3次,加入1∶1 000 稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗,37℃ 作用1 h。棄二抗,PBST洗3次,加入AEC顯色液室溫作用10～15 min,加入雙蒸水終止顯色反應(yīng),于顯微鏡下觀察,篩選出分泌CAV-2抗體的雜交瘤細(xì)胞系。

1.5.2IFA試驗(yàn)篩選分泌CAV-2 FIBER蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系 將表達(dá)CAV-2 FIBER蛋白的真核重組質(zhì)粒pEGFP-C1-CAV FIBER轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞中,24 h后用預(yù)冷的4%多聚甲醛于室溫下固定細(xì)胞30 min,1×PBS洗滌3次;用0.1% TritonX-100于室溫通透細(xì)胞膜10 min,1×PBS洗滌3次;使用含10%胎牛血清的1×PBS于室溫下封閉1 h,1×PBS洗滌3次;將制備的CAV單克隆抗體或雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗與固定的細(xì)胞于37℃ 孵育1 h,1×PBS洗滌3次,加入1∶1 000稀釋后的Alexa FluorTM555標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)作為二抗,于37℃ 避光孵育1 h后,1×PBS洗3次;加入DAPI染色試劑于室溫避光孵育10 min,1×PBS洗滌3次、雙蒸水洗滌3次;加入封片劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察、分析并采集圖像。在1.5.1篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上,用上述IFA試驗(yàn)進(jìn)一步篩選出分泌CAV-2 FIBER蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞,利用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,直至得到能穩(wěn)定的分泌CAV-2 FIBER蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。

1.6 腹水的制備及抗體純化取10～12周齡的BALB/c雌鼠,注射0.3 mL不完全弗氏佐劑。1周后,腹腔注射狀態(tài)良好的單克隆細(xì)胞2.5×106個(gè)/只,待小鼠腹部明顯隆起且按壓有波動(dòng)感時(shí)收集腹水,將收集的腹水10 000 r/min 離心10 min,取上清進(jìn)行初步純化。后將初步純化的腹水經(jīng)硫酸銨沉淀法和ProteinIso?Protein G Resin進(jìn)行純化,加甘油(最終濃度為25%～50%)將純化后的抗體質(zhì)量濃度定至1 g/L,-20℃ 保存,并用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.7 單克隆抗體生物學(xué)特性分析單克隆細(xì)胞染色體數(shù)目分析:將對(duì)數(shù)生長期的單克隆細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞中加入0.3 g/L的秋水仙素液后,37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h,離心收集細(xì)胞,低滲處理、固定制片、吉姆薩染色、鏡檢并拍照進(jìn)行染色體數(shù)目計(jì)數(shù)分析。單克隆細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性分析:將篩選出的單克隆細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)3個(gè)月,用IPMA和IFA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體水平。單克隆抗體亞型鑒定:按照Sino Bioligical小鼠單克隆亞類鑒定試劑盒說明書操作,鑒定CAV FIBER單克隆抗體亞類。

1.8 單克隆抗體間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)效價(jià)測定取1.6步驟中純化腹水所得抗體,采用固定病毒-稀釋抗體法(β法)[17],以2倍倍比稀釋的單克隆抗體為一抗,1∶1 000 稀釋的Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)為二抗,對(duì)純化后的抗體進(jìn)行IFA抗體效價(jià)測定。

1.9 單克隆抗體體外中和試驗(yàn)(VNT)及抗體中和效價(jià)檢測采用終點(diǎn)法(β法)測定抗體中和效價(jià),通過病毒回歸試驗(yàn),測得病毒感染工作濃度。在96孔板內(nèi),將系列稀釋的100 μL抗體 1-A12-C6、8-A12-B10與200 TCID50/100 μL的CAV病毒液等體積混勻,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。隨后接種MDCK細(xì)胞,100 μL/孔,同時(shí)設(shè)置MDCK細(xì)胞空白對(duì)照、病毒工作濃度(100 TCID50/100 μL)感染對(duì)照和僅接種2 種抗體作用的抗體對(duì)照, 37℃ 孵育2 h后,用1×PBS洗滌1次,隨即加入含1% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),3 d后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況(CPE)。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清抗體水平通過ELISA方法檢測免疫小鼠血清的抗體效價(jià),免疫的4只小鼠均能分泌CAV抗體,其中3號(hào)小鼠抗體效價(jià)最高,為1∶102 400(圖1),取3號(hào)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

2.2 CAV FIBER蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立取加強(qiáng)免疫后的3號(hào)小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選6 d后,明顯觀察到融合成功的細(xì)胞增殖(圖2),經(jīng)IPMA和IFA對(duì)多株融合細(xì)胞進(jìn)行篩選,最終獲得2株分泌CAV FIBER蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為1-A12-C6和8-A12-B10。IPMA結(jié)果顯示,制備的單克隆抗體可有效檢測CAV感染的MDCK細(xì)胞(圖3)。IFA結(jié)果顯示,上述2株雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體與感染CAV的MDCK細(xì)胞呈現(xiàn)特異性免疫反應(yīng),熒光顯微鏡下可見紅色熒光;且與轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-CAV-FIBER質(zhì)粒的MDCK細(xì)胞呈現(xiàn)特異性免疫反應(yīng),熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)EGPF-FIBER的綠色熒光與抗原抗體結(jié)合的特異性紅色熒光共定位,表明該單克隆抗體可特異性檢測CAV FIBER蛋白(圖4)。

圖1 間接ELISA檢測首免35 d后小鼠血清中CAV抗體分泌水平

A.融合后2 d;B.融合后4 d;C.融合后6 d

A.1-A12-C6檢測CAV感染的MDCK細(xì)胞;B.8-A12-B10檢測CAV感染的MDCK細(xì)胞;C.陰性對(duì)照(SP2/0細(xì)胞上清為一抗組)

2.3 CAV FIBER蛋白單克隆抗體純化效果經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定(圖5),純化后的抗體在大小約50,25 kDa處有2條明顯的蛋白條帶,分別為抗體的重鏈和輕鏈,而未見其他雜條帶。

2.4 單克隆抗體生物學(xué)特性分析對(duì)篩選出的雜交瘤細(xì)胞株染色體數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)分析(圖6),平均染色體數(shù)目約為106條。利用抗體亞型鑒定試劑盒檢測顯示(圖7,表1),1-A12-C6為IgG2a型抗體,8-A12-B10為IgG2b型抗體。

A,D.SP2/0細(xì)胞上清為一抗的對(duì)照組;B,E.1-A12-C6 分泌抗體作為一抗;C,F.8-A12-B10分泌抗體作為一抗

M.蛋白質(zhì)Marker;1.1-A12-C6純化前小鼠腹水;2.1-A12-C6小鼠腹水純化后抗體;3.8-A12-B10純化前小鼠腹水;4.8-A12-B10小鼠腹水純化后抗體

2.5 單克隆抗體的IFA效價(jià)測定將純化后的抗體用1×PBS進(jìn)行2倍系列稀釋,作為一抗檢測感染CAV的細(xì)胞。結(jié)果顯示(圖8,表2),2株所純化抗體的IFA效價(jià)為1-A12-C6:1∶8 192;8-A12-B10:1∶2 048。

2.6 單克隆抗體中和活性及中和效價(jià)FIBER 蛋白位于CAV-2 病毒表面,在介導(dǎo)病毒感染中起重要作用。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖9,表3),不進(jìn)行任何抗體處理的CAV-2感染細(xì)胞組中可看到明顯的細(xì)胞病變,而抗體處理的CAV-2 感染細(xì)胞組中1-A12-C6、8-A12-B10分別最高可在1∶256,1∶64 稀釋倍數(shù)下有效阻斷CAV-2 感染,細(xì)胞未病變。另外,抗體處理的正常細(xì)胞組中,細(xì)胞形態(tài)正常,說明抗體對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性。

A.SP2/0 細(xì)胞染色體數(shù)目;B.1-A12-C6 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目;C.8-A12-B10 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目

A.單克隆抗體1-A12-C6的亞類鑒定(1～3.1-A12-C6雜交瘤細(xì)胞上清;4.陽性對(duì)照;5.陰性對(duì)照);B.單克隆抗體8-A12-B10的亞類鑒定(6～8.8-A12-B10雜交瘤細(xì)胞上清;9.陽性對(duì)照;10.陰性對(duì)照)

表1 抗體亞型鑒定

表2 抗體免疫熒光效價(jià)

A.單克隆抗體1-A12-C6 免疫熒光陽性反應(yīng);B.單克隆抗體8-A12-B10 免疫熒光陽性反應(yīng);C.陰性反應(yīng)

3 討論

CAV在全世界流行,能在多種哺乳動(dòng)物中傳染,且傳染速度快,易發(fā)生群體感染[18-21]。CAV-2可引起犬科動(dòng)物的傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、腸炎,往往與其他呼吸道病毒混合感染,混合感染時(shí)有較嚴(yán)重的臨床癥狀出現(xiàn)[22]。4月齡以下的幼犬易感染發(fā)病,主要通過唾液和糞便傳播,可在幼犬相互舔舐的過程中使全窩或者全群犬被感染,出現(xiàn)咳嗽癥狀,“窩咳”[23]。CAV-2 FIBER蛋白為病毒的纖突蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量約為62 kDa,在腺病毒侵染過程中起關(guān)鍵作用,該蛋白介導(dǎo)了病毒與宿主細(xì)胞受體之間的相互結(jié)合[24]。纖突蛋白不僅具有型和亞群特異性抗原決定簇,還與腺病毒不同血清型的抗原特異性相關(guān)[25-28]。

A.MDCK空白細(xì)胞對(duì)照組;B.病毒工作濃度感染對(duì)照組;C.1-A12-C6抗體處理正常細(xì)胞組;D.256倍稀釋1-A12-C6抗體處理病毒感染細(xì)胞組;E.8-A12-B10抗體處理正常細(xì)胞組;F.64倍稀釋8-A12-B10抗體處理病毒感染細(xì)胞組

目前臨床上沒有治療CAV-2的特效藥物及高免血清,因此針對(duì)該病一般采用對(duì)癥療法[29]。CAV-2患病犬在康復(fù)后,雖無臨床癥狀但體內(nèi)仍可攜帶病毒6～9個(gè)月,這也導(dǎo)致該病在犬場長期傳播而不能被清除。國內(nèi)預(yù)防CAV-2完全依賴國外進(jìn)口的商品化疫苗,不能有效針對(duì)我國不斷進(jìn)化的流行毒株,臨床上仍可見免疫后犬感染CAV出現(xiàn)毒力反強(qiáng)的情況[30-31]。常規(guī)的治療及疫苗接種無法有效地阻斷該病的傳播,防控該病需要堅(jiān)持經(jīng)常性的檢疫。因此快速準(zhǔn)確的做出診斷在防控CAV中十分重要。但目前我國尚無標(biāo)準(zhǔn)化、商品化的CAV陽性血清及抗體供應(yīng)[32]。臨床中商品化的敏感性強(qiáng)的快速檢測試紙條不僅被國外產(chǎn)品壟斷,而且檢測的敏感性差[29]。

本研究以CAV-2免疫小鼠制備了2株抗CAV-2 FIBER蛋白的單克隆抗體。IPMA和IFA結(jié)果表明,單克隆抗體能特異性識(shí)別CAV-2病毒及CAV-2FIBER蛋白。中和活性檢測試驗(yàn)表明,單克隆抗體對(duì)CAV-2具有中和活性,中和效價(jià)不低于1∶64。為CAV-2的檢測、FIBER蛋白的功能研究、臨床診斷試劑盒的開發(fā)以及相關(guān)疾病的治療等具有重要意義。

表3 單克隆抗體病毒中和效價(jià)