豬偽狂犬病病毒變異株HN1201 gE蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

牛欣蕊,付朋飛,魯維飛,張 超,褚貝貝,王 江*,曾 磊*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 河南省動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046;4.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467036)

豬偽狂犬病(PR)是由豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的豬急性、致死性傳染病。該病呈暴發(fā)性流行,可引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎,公豬不育,新生仔豬大量死亡,育肥豬呼吸困難、生長(zhǎng)停滯等[1-2];該病傳播速度快,20世紀(jì)60年代開始在全國(guó)范圍內(nèi)傳播,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。為了控制該病傳播,PRV Bartha弱毒疫苗在我國(guó)被廣泛使用,部分豬場(chǎng)轉(zhuǎn)變成PRV陰性場(chǎng)[6]。而2011年開始,我國(guó)北方多個(gè)豬場(chǎng)發(fā)生了嚴(yán)重的PR疫情,并迅速蔓延至我國(guó)北方大部分地區(qū),在接種了PRV Bartha弱毒疫苗的豬場(chǎng)同樣發(fā)生了疫情。與之前的PRV流行株相比,此次疫情的PRV基因組部分氨基酸發(fā)生突變、插入與缺失,表現(xiàn)出毒力增強(qiáng)的特點(diǎn),PR疫苗對(duì)PRV變異株感染沒有有效的保護(hù)作用[7]。本研究所用PRV變異株P(guān)RV HN1201與PRV Kaplan、Becker、Bartha基因組同源性分別為95.6%,95.9%和97.5%,表現(xiàn)出毒力增強(qiáng)的特點(diǎn)[8-9],因此,想要根除該病,除了疫苗免疫外,還應(yīng)加強(qiáng)PRV野毒感染的檢測(cè)并及時(shí)淘汰野毒感染豬。

PRV是線性雙鏈DNA病毒,屬皰疹病毒科(Herpesviridae)、α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae),病毒粒子呈球形,有囊膜和衣殼?；蚪M可編碼約100種蛋白,其中g(shù)E基因位于PRV基因組的US區(qū),長(zhǎng)約1 740 bp,編碼gE糖蛋白,在病毒入侵神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10-12]。gE蛋白有4個(gè)不同的功能區(qū),胞外域、跨膜域、胞內(nèi)域和 N 端信號(hào)肽,gE 蛋白胞外區(qū)域由 438 個(gè)氨基酸組成,是病毒的主要抗原表位區(qū),通常gE與gI通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合,以異源二聚體的形式存在[13]。gE蛋白是病毒復(fù)制的非必須蛋白,缺失后不影響病毒的免疫原性,但毒力顯著減弱。因此,PRV gE基因缺失疫苗被廣泛使用[13-17],可通過(guò)檢測(cè)gE蛋白來(lái)區(qū)分疫苗免疫和野毒感染[18]。本研究用PRV變異株HN1201滅活后免疫小鼠,經(jīng)過(guò)一系列試驗(yàn)篩選出2株靈敏性高、特異性強(qiáng)的PRV gE蛋白單克隆抗體,并對(duì)其針對(duì)的抗原表位進(jìn)行鑒定,為研究PRV感染機(jī)制、PRV gE蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位篩選以及建立快速、高效的PRV免疫學(xué)檢測(cè)方法提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑PRV HN1201、PRV QXX、PRV Bartha K61、293T細(xì)胞、PK-15細(xì)胞、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、pEGFP-C1質(zhì)粒、重組質(zhì)粒pCDNA3.0-gE-HA均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存;佐劑Quick Antibody-Mouse 5W購(gòu)自Biodragon公司;HybGro培養(yǎng)基購(gòu)自BasalMedia公司;β-丙內(nèi)酯購(gòu)自Solarbio公司;融合劑PEG1450、HAT/HT培養(yǎng)基、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(IgG-FITC)、弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司;HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司;AEC酶底物試劑盒購(gòu)自ZSGB-BIO公司;ProteinIso?Protein G Resin購(gòu)自TransGen Biotech公司;Protein L Resin 購(gòu)自金斯瑞生物科技股份有限公司;IgG抗體亞類鑒定試劑盒購(gòu)自Sino Biological公司。

1.2 PRV HN1201病毒的增殖與純化將PK-15細(xì)胞接種至T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶,待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)接種PRV HN1201病毒液,細(xì)胞90%病變時(shí),反復(fù)凍融3次,收集細(xì)胞培養(yǎng)物,8 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片,然后通過(guò)30%蔗糖層超速離心,純化上清中的病毒。

1.3 小鼠免疫與抗體水平檢測(cè)取PRV HN1201病毒濃縮液按500∶1比例加入β-丙內(nèi)酯,混勻,4℃處理48 h對(duì)病毒進(jìn)行滅活,之后按1∶1比例加入免疫佐劑Quick Antibody-Mouse 5W,混勻,按100 μL/只腿部肌肉注射免疫7周齡BALB/c小鼠。首免21 d后同劑量進(jìn)行二次免疫,首免35 d后選擇血清抗體水平較高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)免疫小鼠抗體水平:用PRV HN1201感染PK-15細(xì)胞約16 h,用含3%過(guò)氧化氫(H2O2)的甲醇固定細(xì)胞,取未免疫小鼠血清作為陰性對(duì)照,將免疫小鼠血清進(jìn)行2倍系列連續(xù)稀釋作為一抗,Goat anti mouse IgG-HRP作為二抗,按照ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行篩選。

1.4 細(xì)胞融合取免疫后小鼠,無(wú)菌分離其脾臟細(xì)胞,在37℃將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按10∶1的比例混合后1 200 r/min離心10 min,輕彈離心管使細(xì)胞沉淀混勻,加入1 mL 預(yù)熱的PEG-1450,37℃作用90 s,然后連續(xù)加入DMEM至40 mL,1 000 r/min離心10 min,加入預(yù)熱的含有HAT的培養(yǎng)基,混勻,鋪細(xì)胞至96孔板進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 單克隆抗體篩選

1.5.1免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(immune peroxidase monolayer assay,IPMA)篩選分泌PRV抗體的雜交瘤細(xì)胞 鋪PK-15細(xì)胞于96孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí),用PRV HN1201感染,同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞為陰性對(duì)照。感染16 h后,用預(yù)冷的含3% H2O2的甲醇室溫固定細(xì)胞15 min,PBST洗2次;加入5%脫脂奶,37℃封閉2 h,PBST洗3次;加入雜交瘤細(xì)胞上清,37℃孵育2 h,PBST洗3次;加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗,37℃孵育1 h,PBST洗3次;加入AEC顯色液室溫作用10～15 min,棄顯色液,加入雙蒸水終止顯色反應(yīng),于顯微鏡下觀察,篩選分泌PRV抗體的雜交瘤細(xì)胞。

1.5.2分泌PRV gE蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選及亞克隆 將表達(dá)PRV HN1201 gE蛋白的真核重組質(zhì)粒pCDNA3.0-gE-HA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,通過(guò)Western blot試驗(yàn)進(jìn)一步篩選分泌PRV gE蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞,利用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,直至得到能穩(wěn)定分泌PRV gE蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。

1.6 單克隆抗體亞類鑒定按照IgG亞類鑒定試劑盒說(shuō)明書操作,對(duì)PRV gE單克隆抗體亞類進(jìn)行鑒定。

1.7 腹水制備及抗體純化10～12周齡BALB/c雌鼠,腹腔注射300 μL弗氏不完全佐劑,7 d 后腹腔接種分泌PRV gE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞(3×106/只),同時(shí)設(shè)置腹腔注射SP2/0細(xì)胞的陰性對(duì)照小鼠。待小鼠腹部明顯脹大時(shí)采集腹水,10 000 r/min離心10 min,收集上清,即為單克隆抗體腹水。收集的腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法和ProteinIso?Protein G Resin進(jìn)行純化,加甘油(終濃度為50%)-20℃保存,用SDS-PAGE對(duì)純化后的抗體純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 抗體效價(jià)測(cè)定取腹水純化所得抗體,采用固定病毒-稀釋腹水抗體法,對(duì)其進(jìn)行IFA抗體效價(jià)檢測(cè)。另外對(duì)已純化腹水抗體用于Western blot試驗(yàn)的最佳稀釋度進(jìn)行探索。

1.9 IFA鑒定抗體與不同 PRV毒株的反應(yīng)性分別將PRV HN1201、PRV QXX、PRV Bartha K61接種于PK-15細(xì)胞,設(shè)置未接毒的細(xì)胞為陰性對(duì)照,16 h后,用4% PFA室溫固定細(xì)胞30 min,雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗,FITC標(biāo)記山羊抗小鼠抗體作為二抗,按照IFA反應(yīng)條件進(jìn)行操作,于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.10 IFA檢測(cè)單克隆抗體交叉反應(yīng)性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染Marc-145細(xì)胞,豬流行性腹瀉病毒(PEDV)感染Vero細(xì)胞,按照常規(guī)IFA方法操作,檢測(cè)單克隆抗體與常見病毒的交叉反應(yīng)性。

1.11 單克隆抗體識(shí)別PRV HN1201 gE抗原表位鑒定利用生物學(xué)軟件SnapGene根據(jù)gE基因序列將gE基因截短為兩段重合的片段,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增目的片段,連接到pEGFP-C1載體中,構(gòu)建真核表達(dá)載體,通過(guò)Western blot檢測(cè),確定抗體針對(duì)的抗原表位所在片段,再對(duì)特異片段用同樣的方法繼續(xù)進(jìn)行截短。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清抗體水平通過(guò)ELISA方法測(cè)定滅活PRV HN1201免疫小鼠血清抗體效價(jià),結(jié)果顯示7只小鼠均產(chǎn)生PRV抗體,其中1號(hào)小鼠抗體效價(jià)最高為1∶102 400(圖1),取1號(hào)小鼠加強(qiáng)免疫1次。

圖1 間接ELISA檢測(cè)首免35 d后小鼠血清中 PRV 抗體分泌水平

2.2 分泌PRV gE蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立將滅活后的PRV HN1201病毒免疫小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選5～7 d后,明顯觀察到雜交瘤細(xì)胞增殖(圖2),經(jīng)IPMA和Western blot對(duì)多株融合細(xì)胞進(jìn)行篩選,最終得到2株穩(wěn)定分泌PRV gE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1-F11-3、3-E11-3。IPMA結(jié)果顯示1-F11-3株單克隆抗體使感染PRV的PK-15細(xì)胞呈紅棕色(圖3),3-E11-3不能使感染PRV的PK-15細(xì)胞呈紅棕色;Western blot結(jié)果顯示,以1-F11-3、3-E11-3為一抗孵育PVDF膜,在相對(duì)分子質(zhì)量100 kDa左右出現(xiàn)了特異性條帶,表明2株抗體均可特異性識(shí)別PRV gE蛋白(圖4)。

A.融合后5 d;B.融合后7 d

A.1-F11-3檢測(cè)PRV HN1201感染的PK-15細(xì)胞;B.3-E11-3檢測(cè)PRV HN1201感染的PK-15細(xì)胞;C.正常PK-15細(xì)胞

M.蛋白質(zhì)Marker;1.PK-15細(xì)胞蛋白;2.PRV HN1201感染PK-15細(xì)胞蛋白;3.pCDNA3.0-gE-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞蛋白

2.3 PRV gE蛋白單克隆抗體Ig亞類鑒定按照IgG亞類鑒定試劑盒說(shuō)明書操作,通過(guò)ELISA方法對(duì)PRV gE單克隆抗體亞類進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,1-F11-3亞類為IgG2a,3-E11-3亞類為IgM,輕鏈均為Kappa鏈(圖5)。

A.單克隆抗體1-F11-3的亞類鑒定(1～3.1-F11-3雜交瘤細(xì)胞上清;4.陽(yáng)性對(duì)照;5.陰性對(duì)照);B.單克隆抗體3-E11-3的亞類鑒定(6～8.3-E11-3雜交瘤細(xì)胞上清;9.陽(yáng)性對(duì)照;10.陰性對(duì)照)

2.4 PRV gE蛋白單克隆抗體純化效果及抗體效價(jià)純化后的抗體經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳,1-F11-3在50,25 kDa處分別為抗體的重鏈和輕鏈,3-E11-3在75,25 kDa處分別為抗體的重鏈和輕鏈(圖6)。純化后的1-F11-3、3-E11-3抗體用于Western blot檢測(cè)的最高稀釋比分別為1∶14 000和1∶12 000。1-F11-3抗體IFA檢測(cè)效價(jià)為2-14(圖7)。

2.5 IFA檢測(cè)單克隆抗體與不同PRV毒株反應(yīng)及其交叉反應(yīng)性IFA結(jié)果顯示,1-F11-3抗體能與不同PRV毒株反應(yīng),但不與PRV Bartha-K61反應(yīng)(圖8A),且不與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)(圖8B)。

2.6 單克隆抗體識(shí)別PRV HN1201 gE抗原表位鑒定將PRV gE片段截短真核表達(dá)后,通過(guò)Western blot試驗(yàn),鑒定1-F11-3株P(guān)RV gE抗體識(shí)別gE抗原序列為64GDDRRAGFGSALASLR79,3-E11-3株P(guān)RV gE抗體識(shí)別gE抗原序列為156PPEVPRLRRGPPIVTPERWS175(圖9)。

M.蛋白質(zhì)Marker;1.純化前小鼠腹水;2.小鼠腹水純化后抗體

圖7 IFA檢測(cè)小鼠腹水純化后PRV gE蛋白抗體效價(jià)

A.單克隆抗體1-F11-3與不同PRV毒株反應(yīng);B.單克隆抗體1-F11-3與其他病毒的交叉反應(yīng)

3 討論

1947年,我國(guó)東部地區(qū)首次報(bào)道了PRV引起的病例[19]。1970年,PR在我國(guó)大部分地區(qū)廣泛流行,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[20-21]。gE蛋白是PRV主要的毒力蛋白,但缺失gE蛋白不影響病毒的免疫原性。為控制和根除PR,人們廣泛使用gE基因缺失疫苗,至1990年以后該病得到了有效控制[22-23]。然而,2011年底,PRV變異株再次引起了PR的暴發(fā),gE基因缺失疫苗(Bartha-K61)已不能提供有效的免疫保護(hù)[24-26],因此,在PR的防控工作中,除疫苗免疫外,還應(yīng)加強(qiáng)PRV野毒感染的檢測(cè)并及時(shí)淘汰野毒感染豬。

由于市面上的PRV疫苗多為gE基因缺失疫苗,因此gE被認(rèn)為是野生PRV毒株感染的指標(biāo),可以通過(guò)檢測(cè)血清中g(shù)E抗原或gE抗體來(lái)區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬。因此,PRV gE單克隆抗體在PR的防治和凈化過(guò)程中具有重要作用。

通過(guò)原核表達(dá)gE蛋白為免疫原制備的gE單克隆抗體,在識(shí)別天然gE蛋白時(shí)的特異性和親和力較差,這可能與原核表達(dá)gE蛋白缺乏天然構(gòu)象和糖基化修飾有關(guān)。而以PRV全病毒顆粒為免疫原制備的gE單克隆抗體能有效識(shí)別天然gE蛋白,故本研究使用PRV抗原免疫小鼠。用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清,選取抗體水平最高的小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合,然后,通過(guò)IPMA、Weatern blot和亞克隆等方法篩選獲得了2株能分泌PRV gE抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為1-F11-3和3-E11-3,亞類鑒定分別為IgG2a和IgM。

接下來(lái)用IFA方法進(jìn)一步評(píng)估其特異性,1-F11-3單克隆抗體與含有g(shù)E的PRV特異性結(jié)合,不與gE缺失的PRV發(fā)生反應(yīng),說(shuō)明該單克隆抗體特異性識(shí)別gE蛋白,且與PRV的其他結(jié)構(gòu)蛋白無(wú)交叉反應(yīng);此外,通過(guò)IFA試驗(yàn)確定該單克隆抗體不與PRRSV、PEDV、PCV-2、PPV發(fā)生交叉反應(yīng)。3-E11-3單克隆抗體僅能通過(guò)Western blot方法識(shí)別gE蛋白,這可能與其識(shí)別的抗原表位的類型有關(guān)。通過(guò)抗原表位鑒定,2株抗體識(shí)別不同的gE抗原序列,分別為64GDDRRAGFGSALASLR79和156PPEVPRLRRGPPIVTPERWS175。純化后的1-F11-3、3-E11-3抗體用于Western blot檢測(cè)的最高稀釋比分別為1∶14 000和1∶12 000;1-F11-3株IFA效價(jià)達(dá)2-14,抗體靈敏度較高。

A.1-F11-3株單克隆抗體識(shí)別gE抗原表位的8個(gè)重疊的多肽示意圖;B.Western blot鑒定1-F11-3株單克隆抗體識(shí)別gE抗原表位;C.表達(dá)gE截短的蛋白的GFP標(biāo)簽鑒定;D.3-E11-3株單克隆抗體識(shí)別gE抗原表位的6個(gè)重疊的多肽示意圖;E.Western blot鑒定3-E11-3株單克隆抗體識(shí)別gE抗原表位;F.表達(dá)gE截短的蛋白的GFP標(biāo)簽鑒定

PRV gE蛋白作為具有重要的生物學(xué)和免疫學(xué)功能的蛋白,是制備單克隆抗體、疫苗研制、診斷試劑等方面研究的靶標(biāo)物質(zhì)。本研究成功制備了特異性強(qiáng)、靈敏度高的2株P(guān)RV gE單克隆抗體,并探究了單克隆抗體識(shí)別的特異性抗原表位。為建立快速、特異的PR血清學(xué)診斷方法和免疫預(yù)防等研究奠定了基礎(chǔ)。