表達高致病性和NADC30樣PRRSV毒株GP5蛋白的重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建

王林青,侯承堯,馬 曉,劉 穎,劉 芳,金 鉞*,陳紅英*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,河南 鄭州450046;2.鄭州師范學院 分子生物學鄭州市重點實驗室,河南 鄭州 450044)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種急性傳染病,其特征為母豬繁殖障礙和各個年齡段豬呼吸系統(tǒng)疾病[1-3]。20世紀90年代,PRRS在美國和歐洲相繼出現(xiàn),隨后傳至全球,嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展。PRRSV是一種有囊膜、單鏈正義RNA病毒[4],其表面包含至少7個膜蛋白,其中GP5是一種相對分子質(zhì)量約為25 kDa的跨膜蛋白,攜帶能誘導機體產(chǎn)生中和抗體的中和表位,是研制新型PRRSV疫苗的熱門靶點?；贕P5基因序列構(gòu)建的全球分類體系,PRRSV-1分為3個亞型(亞型1～3),PRRSV-2分為9個譜系,譜系下再分多個子譜系[4-5]。臨床上出現(xiàn)新的PRRSV毒株往往會導致PRRS的再次廣泛流行。2006年,我國豬群中出現(xiàn)高致病性PRRSV (HP-PRRSV)毒株,導致PRRS大流行,豬病死率為20%[6]。2013年,我國再次流行PRRS,研究表明出現(xiàn)了一種新的PRRSV變異體——NADC30-like PRRSV毒株,已證實該毒株為PRRSV NADC30毒株從北美傳入我國,與國內(nèi)HP-PRRSV毒株發(fā)生重組,并在我國豬群中適應(yīng)的毒株[7-8]。目前尚無基于NADC30-like PRRSV毒株開發(fā)的商業(yè)PRRSV疫苗。因此,開發(fā)一種針對NADC30-like PRRSV的PRRSV疫苗,對于控制持續(xù)增加的NADC30-like PRRS疫情尤為重要。

偽狂犬病(pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(PRV)引起多種動物共患的一種急性傳染病[1]。豬是PR的自然儲存宿主,各年齡階段豬都受到PR的威脅[9]。于2011年底,PR在我國北方省份很多接種了Bartha-K61疫苗的農(nóng)場中暴發(fā)與流行,隨后迅速蔓延到我國多個省份[10],對我國養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性打擊。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),新一輪暴發(fā)的PR是由PRV變異株導致的,且現(xiàn)有的疫苗只能提供部分保護,且抗體陽性率逐年上升[10]。PRV基因組為雙鏈線狀約150 kb DNA,其中有近70個開放閱讀框,編碼出70～100個病毒蛋白[11]。PRV的龐大基因組包含許多非必需基因和許多插入位點,包括TK、gE、gI和gG基因,可以整合和表達外源基因。這些非必需基因的缺失導致病毒的毒力表型減弱,而對免疫反應(yīng)沒有顯著影響[11]。

利用同源重組技術(shù),本研究將2種不同亞型PRRSV GP5基因插入PRV變異株3基因缺失株rPRV-gE-/gI-/TK-基因組中,并利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),構(gòu)建了能穩(wěn)定表達NADC30-like PRRSV GP5蛋白和HP-PRRSV GP5蛋白的重組PRV毒株,以期為PRRS和豬PR的防治提供一種新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞和毒株pBApo-EF1α_Pur_DNA真核表達載體購自寶生物工程有限公司;PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP(含HP-PRRSV GP5基因)、敲除質(zhì)粒CRISPR/Cas9-gG、ST細胞以及rPRV-gE-/gI-/TK-毒株均由鄭州豬重大疫病防控重點實驗室構(gòu)建和保存。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol、HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾維贊生物科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒、Endo-Free Plasmid Mini Kit Ⅰ-fast購自O(shè)MEGA公司;小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)、BamHⅠ、HindⅢ和Bst Z17I等購自寶生物工程(大連)有限公司; SE Seamless Cloning and Assembly Kit、轉(zhuǎn)染試劑ZLip2000購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;DMEM、2×DMEM培養(yǎng)基購自武漢博士德生物公司;低熔點瓊脂糖、OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)NADC30-like PRRSV分離株HENAN-XINX基因組序列 (GenBank 登錄號:KF611905)中GP5基因,設(shè)計1對特異性引物(表1),BamHⅠ(GGATTC)和HindⅢ(AAGCTT) 分別引入到引物的5′端,并在上游引物BamHⅠ位點后引入Kozak序列(GCCACC),用于擴增PRRSV毒株GP5基因?；趐BApo-EF1α_Pur_DNA中表達盒插入質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP中Bst Z17I位點,設(shè)計1對含左右同源臂的引物T-pBA-F/R。引物EGFP-F/R用于鑒定EGFP基因的表達盒。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的構(gòu)建用TRIzol試劑提取NADC30-like PRRSV毒株總RNA,按照HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit說明合成cDNA,利用引物GP5-NA-F/R進行PCR擴增GP5基因。RT-PCR產(chǎn)物通過BamHⅠ和HindⅢ克隆到載體pBApo-EF1α_Pur_DNA中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBA-GP5/NADC30(圖1),導入DH5α感受態(tài)細胞,挑取單個菌落,用引物GP5-NA-F/R進行PCR鑒定并提取質(zhì)粒進行測序。

圖1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的構(gòu)建示意圖

以重組質(zhì)粒pBA-GP5/NADC30 DNA為模板,利用T-pBA-F/R為引物,PCR擴增GP5/NA表達盒,并純化回收擴增產(chǎn)物。用SE Seamless Cloning and Assembly Kit,將含有同源臂的GP5/NA表達盒和用Bst Z17I酶切并用CIAP去磷酸化的質(zhì)粒pG-GP5/HP-EGFP進行無縫克隆連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP(圖1),37℃水浴作用30 min,導入 DH5α感受態(tài)細胞中,用引物GP5-NA-F/R和T-pBA-F/R對選取的單個菌落進行PCR鑒定。提取質(zhì)粒,以T-pBA-F/R為引物進行測序。

1.5 重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的拯救用Endo-Free Plasmid Mini KitⅠ-fast去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒按照說明提取轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP。在長至80%單層ST細胞6孔板內(nèi)接種3基因缺失PRV親本株rPRV-gE-/gI-/TK-,37℃、5% CO2培養(yǎng)2 h后,將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP按照轉(zhuǎn)染試劑ZLip2000說明進行轉(zhuǎn)染。37℃、5% CO2孵育5 h后,棄細胞液,添加新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)細胞病變(CPE),反復凍融細胞,收獲病毒液。

將病毒液按照10-1,10-2,10-3,10-4,10-5倍比梯度稀釋后,接種于長滿至80% 6孔板的單層ST細胞,在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h,吸棄孔內(nèi)細胞液,并用含1.3%低熔點瓊脂糖、5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基鋪板進行重組病毒的蝕斑篩選。每次病毒純化都選取稀釋度最大孔內(nèi)的單個綠色熒光病變灶進行下一輪病毒純化,將收取的病毒液反復凍融3次后重復上述步驟,直至稀釋孔內(nèi)的所有病變灶均呈現(xiàn)綠色熒光時,提取病毒DNA,用引物GP5-NA-F/R進行PCR鑒定。

1.6 重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30的拯救將rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP接種已轉(zhuǎn)染敲除質(zhì)粒CRISPR/Cas9-EGFP 并37℃、5% CO2孵育5 h后的單層ST細胞,37℃、5% CO2孵育2 h,吸棄孔內(nèi)細胞液,加入新鮮培養(yǎng)液,出現(xiàn)CPE時收獲病毒細胞液。蝕斑純化同1.5,但是選取稀釋度最大孔內(nèi)的無綠色熒光病變灶,直到所有稀釋孔內(nèi)的所有病變灶均不出現(xiàn)綠色熒光時,提取病毒DNA,用引物GP5-NA-F/R和EGFP F/R進行PCR擴增。

1.7 GP5基因在ST細胞中轉(zhuǎn)錄鑒定將重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NA接種于長至80%融合ST細胞中,37℃、5% CO2中培養(yǎng)。當約80%細胞出現(xiàn)CPE時,收集病毒細胞液,反復凍融3次,用TRIzol試劑提取病毒RNA,并用HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用引物GP5-NA-F/R進行PCR擴增。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pBA-GP5/NADC30的鑒定將選取的單個菌落接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,利用引物GP5-NA-F/R和T-pBA-F/R進行PCR鑒定。結(jié)果顯示,在630 bp處出現(xiàn)1條特異性條帶(圖2),與預期擴增GP5基因長度相符。對表達盒的擴增,呈現(xiàn)1條約2 000 bp特異性條帶,經(jīng)測序證實結(jié)果正確。表明已成功構(gòu)建質(zhì)粒pBA-GP5/NA。

2.2 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的鑒定以重組質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP轉(zhuǎn)化后的菌液為模板,利用引物GP5-NA-F/R和T-pBA-F/R,PCR擴增GP5基因和表達盒。結(jié)果顯示,在約630,2 000 bp處分別呈現(xiàn)1條特異性條帶(圖3),與預期擴增片段相符,且測序結(jié)果也正確,表明已成功構(gòu)建質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.GP5基因PCR產(chǎn)物;4～6.表達盒PCR產(chǎn)物

M.DL2000 DNA Marker;1～4. GP5基因PCR產(chǎn)物;5～8. 表達盒PCR產(chǎn)物

2.3 rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的綠色熒光觀察和PCR擴增轉(zhuǎn)染ST細胞24 h后,細胞對照組和空白轉(zhuǎn)染組在熒光顯微鏡下無綠色熒光(圖4),而質(zhì)粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP轉(zhuǎn)染孔呈現(xiàn)明顯的綠色熒光。提取病毒DNA,使用GP5基因特異性引物GP5-NA-F/R進行PCR擴增,結(jié)果顯示,在約630 bp處有1條特異性條帶(圖5),與預期相符。

A.試驗組;B.細胞對照組;C.空白轉(zhuǎn)染組

M.DL2000 DNA Marker;1.GP5/HP PCR產(chǎn)物;2.陰性對照

2.4 rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30的綠色熒光觀察和PCR擴增對獲得的含rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30細胞液,經(jīng)4輪蝕斑純化,觀察到所有病變灶已無綠色熒光(圖6)。提取rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30基因組,利用引物GP5-NA-F/R,PCR擴增GP5基因,擴增出1條約630 bp的片段(圖7),與預期擴增片段大小相符。利用引物EGFP-F/R進行PCR擴增,擴增出1條約400 bp的片段,經(jīng)測序顯示,序列長度為436 bp,重組病毒中EGFP基因缺失了1 232 bp片段,表明重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30中的EGFP基因被成功敲除,且經(jīng)空斑純化完全。

2.5 GP5基因在ST細胞中的轉(zhuǎn)錄鑒定提取rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30感染的病變ST細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄出cDNA,利用GP5基因特異性引物GP5-NA-F/R進行PCR擴增。結(jié)果顯示,在約630 bp處呈現(xiàn)1條特異性條帶(圖8),與預期相符,且測序結(jié)果正確,表明成功構(gòu)建重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30。

A.白光下觀察結(jié)果;B.藍光下觀察結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker;1～4.GP5基因PCR產(chǎn)物;5～8.EGFP基因PCR產(chǎn)物;9.陰性對照

M.DL2000 DNA Marker;1.PCR產(chǎn)物;2.陰性對照

3 討論

PRRS仍然是養(yǎng)豬業(yè)面臨的主要挑戰(zhàn),每年都會造成重大經(jīng)濟損失。疫苗免疫依舊是控制PRRSV暴發(fā)和流行的重要手段。PRRSV的持續(xù)變異,導致多亞型毒株同時暴發(fā)和流行,使得PRRS的預防和控制更加復雜[12]。與HP-PRRSV株相比,NADC30-like PRRSV毒株是我國近年來主要流行毒株,檢出率第二[13]。盡管其致病性低于HP-RRRSV,但是極易與其他PRRSV發(fā)生重組,導致其致病性發(fā)生變化。目前市面上的基于經(jīng)典PRRSV和HP-PRRSV毒株的商用PRRSV疫苗是否能夠預防PRRSV新亞型毒株的感染,還有待進一步證實。利用NADC30-like PRRSV毒株進行攻毒保護試驗,發(fā)現(xiàn)我國應(yīng)用最廣泛的商品疫苗都不能有效保護豬免受該毒株的攻擊。疫苗免疫后,感染NADC30-like PRRSV毒株的豬仍出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,高病毒血癥,且各組織病毒載量高[14-15]。先前的多項研究已經(jīng)確定了分布在主要結(jié)構(gòu)蛋白(GP5和M)和次要糖蛋白(GP2a、GP3和GP4)上的多個中和表位,GP5中和抗體可部分預防廣泛性病毒血癥和PRRSV感染后肺部病變的發(fā)展[16]。我國流行的不同亞型PRRSV毒株GP5同源性在83.4%～99.8%之間, PRRS防控失敗的原因之一可能是現(xiàn)有疫苗不能產(chǎn)生交叉保護[17]。有研究表明PRRSV GP5與多基因共同表達可產(chǎn)生比單獨GP5蛋白更高的抗GP5中和抗體[18]。

通過基因缺失減毒的PRV活病毒載體表達外源基因是一種非常成熟的抗原呈遞系統(tǒng)。目前,PRV已經(jīng)發(fā)展成為一種表達外源性蛋白的強大載體體系,可以攜帶和表達其他病毒的主要免疫原性基因和蛋白,如PCV3 Cap、ASFV CD2v、HP-PRRSV GP5等[19-21]。這些用PRV活病毒載體研制的二價或三價重組疫苗,可以刺激機體產(chǎn)生針對目標病毒的特異性免疫反應(yīng),而不影響PRV的自體免疫效果。在先前的研究中,ZHAO等[22]以NY PRV變異株為基礎(chǔ),通過同源DNA重組和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),構(gòu)建了gE/gI/TK缺失重組PRV病毒(rPRV NY-gE/gI/TK)。rPRV NY- gE /gI/TK毒株在體外生長動力學與親本株NY相似,并被證明對小鼠是安全的,是一種可以表達外源基因的PRV活病毒載體。PRRSV和PRV感染均能引起豬繁殖障礙,而且臨床上常見兩者混合感染。目前,滅活苗和弱毒苗已得到了廣泛應(yīng)用,并在疾病的預防和控制中發(fā)揮了一定作用,但是由于滅活苗的保護力低、免疫效果不穩(wěn)定、免疫期短,而弱毒苗則有毒力返祖的潛在威脅等缺點,因此研發(fā)一種更加安全高效的PRRS和豬PR疫苗,具有現(xiàn)實意義和經(jīng)濟價值。

本研究利用DNA同源重組和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),將HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV 毒株的GP5基因共同重組至3基因缺失PRV變異毒株中,構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達兩種亞型PRRSV 毒株GP5基因的重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30,為未來開發(fā)針對PRRSV流行毒株和PRV變異毒株的疫苗提供了參考,以期能夠?qū)RRSV和PRV的防控起到更好的作用。