瑞芬太尼通過上調(diào)lncRNA DGCR5表達(dá)影響卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

邱衛(wèi)華, 郭晴晴, 羅建喜

(1. 湖北省武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院 麻醉科, 湖北 武漢, 430400;2. 湖北省武漢市第四醫(yī)院 疼痛科, 湖北 武漢, 430033)

在所有婦科癌癥中,惡性卵巢腫瘤的致死率最高[1]。晚期卵巢癌的一線化療藥物是順鉑,但耐藥性會導(dǎo)致順鉑和許多其他化療藥物的有效性顯著降低[2]。瑞芬太尼是一種作用于阿片類藥物受體的合成阿片類藥物,具有起效和抵消時(shí)間短的特點(diǎn)[3]。瑞芬太尼在全身麻醉和鎮(zhèn)靜期間廣泛用作輔助鎮(zhèn)痛藥[4]。既往研究[5]報(bào)告了瑞芬太尼對腫瘤細(xì)胞的作用,例如瑞芬太尼以劑量依賴的方式減輕肺癌A549細(xì)胞增殖,加速其凋亡。瑞芬太尼可抑制胃癌細(xì)胞的生長,機(jī)制與上調(diào)微小RNA-206(miRNA-206)靶向高爾基磷蛋白3(GOLPH3)有關(guān)[6]。但是,瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞惡性生物行為的影響與機(jī)制尚未見報(bào)道。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物,無蛋白質(zhì)編碼能力[7-8], 被確定為癌癥生物學(xué)的關(guān)鍵參與者[9]。lncRNA DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因5(DGCR5)與多種類型的癌癥有關(guān),在卵巢癌中表達(dá)下調(diào),其低表達(dá)與卵巢癌患者的腫瘤直徑大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多、臨床分期晚和總生存期短有關(guān),可能是預(yù)測卵巢癌患者臨床進(jìn)展和預(yù)后的新的生物標(biāo)記物[10]。異丙酚通過提高lncRNA DGCR5對肝癌細(xì)胞發(fā)揮抗癌活性[11]。然而, lncRNA DGCR5是否介導(dǎo)瑞芬太尼調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞功能的過程尚不清楚。本研究探討瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響,通過分析lncRNA DGCR5的表達(dá)來研究瑞芬太尼影響卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3(美國典藏培養(yǎng)物保存中心),瑞芬太尼(宜昌人福藥業(yè)),小干擾RNA(siRNA)陰性對照(si-NC)、lncRNA DGCR5 siRNA(si-lncRNA DGCR5)(上海Gene Pharma), 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8, 目錄號KGA317)、蛋白酶抑制劑(目錄號KGP603)、磷酸酶抑制劑(KGP602)、全細(xì)胞裂解測定緩沖液(KGP250)(江蘇KeyGen BioTECH), 8 μm Transwell 小室(目錄351158, 美國Corning), PrimeScript RT試劑盒(日本TaKaRa), Taq qPCR Master Mix(美國Promega)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理: 將SKOV3、OVCAR3細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。分別將細(xì)胞SKOV3、OVCAR3分為0、0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組、si-NC組、si-lncRNA DGCR5組、si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼組、si-lncRNA DGCR5+500 ng/mL瑞芬太尼組。其中,不同濃度瑞芬太尼組以終濃度為0、0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼[12]的培養(yǎng)基分別作用于細(xì)胞SKOV3、OVCAR3 48 h。lncRNA DGCR5低表達(dá)時(shí),根據(jù)商購Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的操作說明,在融合率為60%～70%的SKOV3、OVCAR3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-lncRNA DGCR5(5′-GACATCACACAAATATGCAAGAGAA-3′), 5～6 h后,轉(zhuǎn)染基質(zhì)替換為新鮮培養(yǎng)基或終濃度為500 ng/mL瑞芬太尼的培養(yǎng)基,并保持48 h。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖: 根據(jù)制造商的說明,將2×104個(gè)卵巢癌SKOV3、OVCAR3細(xì)胞接種在裝有100 μL培養(yǎng)基的96孔板中, 24 h后參照1.2.1標(biāo)題中的分組,與終濃度為0、0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼的培養(yǎng)基或終濃度為75.0 μmol/L順鉑(陽性對照)的培養(yǎng)基一起培養(yǎng),或進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48 h后,與CCK-8試劑孵育2 h后,使用BioTek酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度(A)值(A450)來評估2種細(xì)胞的增殖活性。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡: 收集SKOV3、OVCAR3細(xì)胞,在黑暗中于37 ℃孵育膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC和碘化丙啶(PI), 孵育15 min, 通過Becton-Dickinson流式細(xì)胞儀定量凋亡細(xì)胞。

1.2.4 Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲: 為了進(jìn)行2種細(xì)胞遷移和侵襲分析,將不含血清的150 μL RPMI-1640培養(yǎng)基中的1×105個(gè)卵巢癌SKOV3、OVCAR3細(xì)胞分別培養(yǎng)于24孔板上的8 μm Transwell上部隔室中,上部隔室?guī)в谢|(zhì)膠(侵襲)或不帶有基質(zhì)膠(遷移)。誘導(dǎo)2種細(xì)胞通過膜主動侵襲或遷移到含有10%胎牛血清的600 μL RPMI-1640培養(yǎng)基的下部隔室中。37 ℃孵育48 h后,輕輕去除殘留在Transwell上部的細(xì)胞。固定后使用結(jié)晶紫將附著在膜下表面的SKOV3、OVCAR3細(xì)胞染色。在倒置顯微鏡下以200倍放大率拍攝侵襲或遷移的細(xì)胞,并在5個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域中計(jì)算侵襲或遷移細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.5 免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測蛋白表達(dá): 來自2種細(xì)胞的總蛋白在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的全細(xì)胞裂解測定緩沖液中裂解。通過Bio-Rad蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白濃度。將每個(gè)樣品30 μg蛋白溶解在10% SDS-PAGE凝膠上,電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下,用脫脂奶粉在緩沖液中封閉PVDF膜60 min, 并在4 ℃與下述一抗孵育過夜: 細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)兔多克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2兔多克隆抗體、MMP9兔多克隆抗體(1∶1 000, 美國Proteintech), 活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)兔多克隆抗體(1∶500, 美國abcam)。與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗溫育60 min, 使用ECL試劑檢測免疫反應(yīng)蛋白,并通過Syngene Bio Imaging進(jìn)行可視化。以β-肌動蛋白(β-Actin)為對照,使用Quantity One軟件定量蛋白水平。

1.2.6 RNA提取和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測lncRNA DGCR5表達(dá)[9]: 按照Invitrogen制造商的說明,使用TRIzol試劑從SKOV3、OVCAR3細(xì)胞中提取總RNA, NanoDrop 2000c分光光度計(jì)測量提取的RNA的濃度。確定提取的RNA僅在A260/A280比率為1.8～2.1時(shí)使用。此后,將RNA儲存在-80 ℃進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。在PrimeScript RT試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程下,使用隨機(jī)引物將總RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA。在下述PCR條件下,通過ABI Prism 7300序列檢測系統(tǒng)在Taq qPCR Master Mix上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增lncRNA DGCR5: 95 ℃ 20 min, 95 ℃ 10 s, 隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán),分別為98 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s。lncRNA DGCR5和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物如下: lncRNA DGCR5正向引物為5′-CCAAGCCTGTCTGTGTGTGTGTTC-3′,反向引物為5′-GGGAGACACAGACCACAAGA-3′;GAPDH正向引物為5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′, 反向引物為5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。lncRNA DGCR5的相對表達(dá)通過2-△△Ct公式計(jì)算,被標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)源基因GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.01定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK-8法結(jié)果顯示,與0 ng/mL瑞芬太尼組比較, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組或順鉑作用于卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3后,細(xì)胞的增殖活性依次降低,并以500.0 ng/mL瑞芬太尼組增殖活性最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖1 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用(n=9)

2.2 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,與0 ng/mL瑞芬太尼組比較, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組作用于卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3后,細(xì)胞的凋亡率依次增加,且SKOV3、OVCAR3細(xì)胞的凋亡率均以500 ng/mL瑞芬太尼組最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

A: SKOV3細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖; B: OVCAR3細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖; C: SKOV3、OVCAR3細(xì)胞凋亡率的柱狀圖。與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用(n=9)

2.3 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用

Transwell法結(jié)果顯示,與0 ng/mL瑞芬太尼組比較, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3的遷移和侵襲數(shù)量依次減少,且遷移和侵襲數(shù)量均以500 ng/mL瑞芬太尼最少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

A: SKOV3、OVCAR3細(xì)胞遷移情況; B: SKOV3、OVCAR3細(xì)胞侵襲情況。與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖3 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用(n=9)

2.4 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9的影響

Western blot結(jié)果顯示, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平均比0 ng/mL瑞芬太尼組低, Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平均比0 ng/mL瑞芬太尼組高,其中SKOV3、OVCAR3細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)以500 ng/mL瑞芬太尼組最低,而Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)則以500 ng/mL瑞芬太尼組最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

A: Western blot檢測SKOV3細(xì)胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá); B: Western blot檢測OVCAR3細(xì)胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)。與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖4 Western blot檢測不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響(n=9)

2.5 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNADGCR5表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細(xì)胞SKOV3中l(wèi)ncRNA DGCR5表達(dá)水平依次為(1.54±0.07)、(1.98±0.13)、(2.34±0.18)、(2.71±0.24), OVCAR3中依次為(1.32±0.09)、(1.72±0.14)、(2.07±0.13)、(2.49±0.20), 高于0 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細(xì)胞SKOV3中l(wèi)ncRNA DGCR5表達(dá)水平(1.00±0.06)和OVCAR3中(1.00±0.08), 并以500 ng/mL瑞芬太尼組lncRNA DGCR5表達(dá)水平最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖5 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞lncRNA DGCR5表達(dá)的影響(n=9)

2.6 lncRNA DGCR5低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

si-lncRNA DGCR5組卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR3的lncRNA DGCR5表達(dá)水平、凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平低于si-NC組,細(xì)胞增殖活性、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平高于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。si-lncRNA DGCR5+500 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR3的lncRNA DGCR5表達(dá)水平、凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平低于si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼組,細(xì)胞增殖活性、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平高于si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖6、圖7、圖8。

3 討 論

SKOV3和OVCAR3是研究細(xì)胞行為時(shí)常用的卵巢癌細(xì)胞[13]。瑞芬太尼是一種短效的阿片受體激動劑,可被血漿和組織中的非特異性酯酶迅速水解[14]。瑞芬太尼具有抑制破骨細(xì)胞分化和成熟并降低骨吸收[15],改善心肌[16]、肝臟[17]和腦缺血再灌注損傷[18],減輕炎癥[19]等藥理活性。近年來,瑞芬太尼在腫瘤方面的潛在作用引起了人們的極大關(guān)注。研究[20]報(bào)道,瑞芬太尼在胃癌中顯示出抗腫瘤活性,可通過上調(diào)miR-519d-3p靶向STAT3, 抑制胃癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。在骨肉瘤MG63細(xì)胞中,瑞芬太尼促進(jìn)miR-148a表達(dá)來減少細(xì)胞增殖和加速細(xì)胞凋亡,這與Cyclin D1的下調(diào)相符[21]。在結(jié)腸癌[22]和胰腺癌[23]細(xì)胞中,瑞芬太尼同樣顯示出抗增殖和促凋亡的功能。本研究結(jié)果與此相符,0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼減少卵巢癌SKOV3、OVCAR3細(xì)胞的增殖活性,并增加2種細(xì)胞的凋亡率。另外,瑞芬太尼還可降低卵巢癌SKOV3、OVCAR3細(xì)胞的遷移和侵襲活性,這與既往研究吻合。吳遠(yuǎn)波等[24]證實(shí)2、4、6 ng/mL瑞芬太尼使肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降,周成茂[25]證明瑞芬太尼和Ly294002聯(lián)用可使肝癌細(xì)胞遷移能力明顯減弱。上述結(jié)果說明,瑞芬太尼可以抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,可能成為潛在的卵巢癌抑制劑。

A: SKOV3細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖; B: OVCAR3細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖; C: SKOV3、OVCAR3細(xì)胞凋亡率的柱狀圖。與si-NC比較, **P<0.01; 與si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼比較, ##P<0.01。圖6 lncRNA DGCR5低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響(n=9)

A: SKOV3、OVCAR3細(xì)胞遷移情況; B: SKOV3、OVCAR3細(xì)胞侵襲情況。與si-NC比較, **P<0.01; 與si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼比較, ##P<0.01。圖7 lncRNA DGCR5低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響(n=9)

A: Western blot檢測SKOV3細(xì)胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá); B: Western blot檢測OVCAR3細(xì)胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)。與si-NC比較, **P<0.01; 與si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼比較, ##P<0.01。圖8 lncRNA DGCR5低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對卵巢癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響(n=9)

lncRNA DGCR5也稱為Linc00037,位于人類染色體22q11.21上[10]。lncRNA DGCR5在不同類型的癌癥中具有相反的功能,在某些類型的癌癥(包括肺腺癌[26]和食管鱗狀細(xì)胞癌[27])中起到癌基因的作用,但在其他類型的癌癥中發(fā)揮抑癌作用。在甲狀腺乳頭狀癌中, lncRNA DGCR5通過海綿化miR-2861抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲[28]。在大腸癌中, lncRNA DGCR5通過下調(diào)miR-21抑制RKO和CR4細(xì)胞的增殖[29]。在非小細(xì)胞肺癌中, lncRNA DGCR5的過表達(dá)通過調(diào)節(jié)miR-211-5p/EPHB6軸來抑制細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[30]。卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA DGCR5表達(dá)下調(diào),并與晚期腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[10]。本研究中, lncRNA DGCR5低表達(dá)降低了卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR3的體外凋亡,并提高其增殖、遷移、侵襲能力,這揭示了lncRNA DGCR5在卵巢癌中起抑癌作用。

一些lncRNA可能充當(dāng)阿片樣物質(zhì)獨(dú)特生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)劑,涉及阿片樣物質(zhì)信號傳遞的lncRNA也可能對藥物行為和功效產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[31]。例如,lncRNA MEG3參與阿片類藥物嗎啡介導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞自噬[32]。阿片類藥物芬太尼通過MALAT1下調(diào)發(fā)揮保護(hù)作用,并在體外和遭受心肌缺血再灌注的小鼠中負(fù)調(diào)節(jié)miR-145-5p/BNIP3途徑[33]。本研究檢測到卵巢癌SKOV3、OVCAR3細(xì)胞內(nèi)lncRNA DGCR5表達(dá)被瑞芬太尼上調(diào),而lncRNA DGCR5低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對SKOV3、OVCAR3細(xì)胞惡性行為的抑制作用,提示lncRNA DGCR5的上調(diào)是瑞芬太尼發(fā)揮抗卵巢癌作用的重要分子途徑之一。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼上調(diào)了卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3中l(wèi)ncRNA DGCR5的表達(dá),并確定了瑞芬太尼抗卵巢癌進(jìn)展的作用機(jī)制。