宮頸癌患者免疫功能、腸道微生物與放射性腸炎的相關(guān)性研究

景文江?陳嘉琦?羅若楠?馬武

【摘要】 目的 探討宮頸癌患者免疫功能、腸道微生物與放射性腸炎（RE）的關(guān)系。方法 回顧性分析80例宮頸癌患者的臨床資料，根據(jù)放射治療后3個(gè)月內(nèi)是否發(fā)生RE將患者分為RE組（29例）和非RE組（51例），根據(jù)常見不良反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)5.0版將RE組患者分為低癥狀級(jí)別組（1級(jí)，18例）和高癥狀級(jí)別組（≥2級(jí)，11例）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)血漿T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞；使用16S核糖體RNA（16S rRNA）基因擴(kuò)增測(cè)序?qū)δc道微生物進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析。結(jié)果 無(wú)論是放射治療前還是放射治療后，RE組患者的CD4+/CD8+比值、B淋巴細(xì)胞比例均低于非RE組（P均< 0.05）；RE組中，低癥狀級(jí)別組患者的CD4+/CD8+比值、B淋巴細(xì)胞比例均高于高癥狀級(jí)別組（P均<0.05）。放射治療前后，非RE組患者腸道微生物α多樣性高于RE組（P < 0.05）。2組腸道微生物組成具有明顯差異的菌屬主要為硬壁菌門和互養(yǎng)菌門；放射治療前后，RE組Acidaminococcus、Dialister相對(duì)豐度高于非RE組，Pyramidobacter相對(duì)豐度低于非RE組（P < 0.05）。結(jié)論 宮頸癌患者CD4+/CD8+比值、B淋巴細(xì)胞比例和腸道微生物特征與RE密切相關(guān)，治療期間CD4+/CD8+比值、B淋巴細(xì)胞比例下降和腸道微生態(tài)失衡的患者更容易發(fā)生RE。

【關(guān)鍵詞】 宮頸癌；放射治療；放射性腸炎；免疫功能；腸道微生物

Correlation of immune function： gut microbiota and radiation enteritis in patients with cervical cancer Jing Wenjiang， Chen Jiaqi， Luo Ruonan， Ma Wu. Cancer Radiotherapy Department， 3201 Hospital， Hanzhong 723000， China

Corresponding author， Ma Wu， E-mail： 13992690936@139.com

【Abstract】 Objective To investigate the relationship of immune function and gut microbiota with radiation enteritis （RE） in patients with cervical cancer. Methods Clinical data of 80 patients with cervical cancer were retrospectively analyzed. All patients were divided into the RE group （n=29） or non-RE group （n=51） according to the incidence of RE within 3 months after radiotherapy. According to the CTCAE5.0 adverse reaction evaluation criteria， patients in the RE group were divided into the low-symptom grade subgroup （grade 1， n=18） and high-symptom grade subgroup （≥ grade 2， n=11）. Plasma T lymphocyte subsets and B lymphocytes were detected by flow cytometry. 16S rRNA gene amplification and sequencing were used for sequencing and bioinformatic analysis of gut microbiota. Results The levels of CD4+/CD8+ and B lymphocytes in the RE group were significantly lower than those in the non-RE group before and after radiotherapy （all P < 0.05）. In the RE group， the levels of CD4+/CD8+ and B lymphocytes in the low-symptom grade subgroup were significantly higher than those in the high-symptom grade subgroup （all P < 0.05）. The α-diversity of gut microbiota in the non-RE group was higher than that in the RE group before and after radiotherapy （both P < 0.05）. The major bacterial genera with significant differences between two groups were Firmicutes and Synergistetes. The relative abundance of Acidaminococcus and Dialister in the RE group was significantly higher than that in the non-RE group， and the relative abundance of Pyramidobacter was significantly lower than that in the non-RE group before and after radiotherapy （all P < 0.05）. Conclusions CD4+/CD8+， proportion of B lymphocyte and characteristics of gut microbiota are closely correlated with RE in patients with cervical cancer. The decreases in CD4+/CD8+ and proportion of B lymphocyte， and intestinal microecological imbalance during treatment may increase the risk of RE.

【Key words】 Cervical cancer； Radiotherapy； Radiation enteritis； Immune function； Gut microbiota

宮頸癌是一種原發(fā)于子宮頸部位的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一［1］。以手術(shù)、放射治療為主的綜合治療是進(jìn)展期宮頸癌的主要治療手段，其中放射治療除根治性治療作用外，還可作為手術(shù)后的輔助治療，預(yù)防腫瘤的局部復(fù)發(fā)［2］。然而，超過(guò)50%的宮頸癌患者在放射治療后會(huì)發(fā)生放射性腸炎（RE），出現(xiàn)腹痛、急性腹瀉、惡心、食欲不振等腸道損傷癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［3］。對(duì)RE發(fā)生的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，除電離輻射造成的上皮損傷外，腸道免疫系統(tǒng)、腸道微生物等多種因素的相互作用，也是誘發(fā)RE的重要原因［4］，但有關(guān)進(jìn)展期宮頸癌放射治療患者免疫功能、腸道微生物與RE的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)分析進(jìn)展期宮頸癌放射治療患者免疫功能、腸道微生物特征與RE的關(guān)聯(lián)性，旨在為臨床RE的防治提供參考依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2020年3月至2022年3月在本科行放射治療的80例進(jìn)展期宮頸癌患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床檢查符合宮頸癌的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)展期為Ⅱb～Ⅳa期；②年齡> 18歲；③均接受根治性放射治療或術(shù)后放射治療［5］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腸道疾病、代謝疾病或免疫缺陷病史患者；②合并其他惡性腫瘤患者；③長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑患者；④有消化道手術(shù)史患者。根據(jù)放射治療后3個(gè)月內(nèi)是否發(fā)生RE將患者分為RE組（29例）和非RE組（51例）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：院倫理審〔2023〕006號(hào)），入組患者均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. RE評(píng)估與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

治療期間每周監(jiān)測(cè)患者的不良反應(yīng)，患者出現(xiàn)便血，同時(shí)合并便頻、便秘、黏液糞便等癥狀時(shí)，可確診為RE。根據(jù)常見不良反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)5.0版（CTCAE5.0）對(duì)RE的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)［6］。RE組中，1級(jí)RE患者18例（低癥狀級(jí)別組），2～3級(jí)RE患者11例（高癥狀級(jí)別組），無(wú)4級(jí)及以上RE發(fā)生。

2. 免疫功能評(píng)估

所有患者均于放射治療前1周內(nèi)、放射治療第2周結(jié)束次日取空腹靜脈血5 mL，采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司CytoFLEX型流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+/CD8+）和B淋巴細(xì)胞比例。

3. 腸道微生物特征分析

3.1 樣本收集與16S rDNA測(cè)序

于放射治療前1周內(nèi)、放射治療第2周結(jié)束次日采集患者糞便。采用DNA提取試劑盒（QIAamp Power Fecal DNA Kit）提取糞便樣本中的細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)細(xì)菌的16S核糖體RNA（16S rRNA）基因序列設(shè)計(jì)V4區(qū)通用引物，對(duì)微生物核糖體RNA的V4基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行磁珠純化回收后熒光定量，使用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

3.2 生物信息學(xué)分析

使用QIIME軟件完成生物信息學(xué)分析，所得結(jié)果用于操作分類單元（OTU）的聚類分析和物種分類注釋。基于OTU分析結(jié)果進(jìn)行α多樣性分析，獲得Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)；采用Bray-curtis、unweighted unifrac和weighted unifrac三種距離矩陣PCoA分析法進(jìn)行β多樣性分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較行配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較行χ 2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。α=0.05。

結(jié) 果

一、RE組和非RE組患者的一般臨床資料分析

RE組和非RE組的一般臨床資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。見表1。

二、RE組和非RE組的免疫功能比較

放射治療前后，RE組患者的CD4+/CD8+比值、B淋巴細(xì)胞比例低于非RE組（P < 0.05）。見表2。

三、RE組中不同分級(jí)患者的免疫功能比較

無(wú)論是放射治療前還是放射治療后，RE組中的低癥狀級(jí)別組患者CD4+/CD8+、B淋巴細(xì)胞比例均高于高癥狀級(jí)別組（P < 0.05）。見表3。

四、RE組和非RE組的腸道微生物α多樣性比較

無(wú)論是放射治療前還是放射治療后，非RE組患者的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于RE組（P < 0.05）。見表4。

五、RE組和非RE組腸道微生物β多樣性比較

無(wú)論是放射治療前還是放射治療后，放射治療前后，RE組和非RE組患者的腸道微生物的β多樣性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表5。

六、RE組和非RE組腸道微生物組成及差異分析

2組的腸道微生物組成中具有明顯差異的菌屬主要為硬壁菌門和互養(yǎng)菌門。放射治療前及放射治療后，RE組氨基酸球菌屬（Acidaminococcus）、戴阿利斯特桿菌屬（Dialister）相對(duì)豐度高于非RE組，錐形桿菌屬（Pyramidobacter）相對(duì)豐度低于非RE組（P < 0.05）。見表6。

討 論

放射治療作為惡性腫瘤的主要治療手段，在控制疾病進(jìn)展、改善患者預(yù)后方面，具有重要意義。臨床研究證實(shí)，放射治療的療效主要取決于照射劑量的準(zhǔn)確性，但由于腸道的可耐受劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于靶病灶的治療劑量，放射治療期間RE仍是困擾宮頸癌患者的一大問(wèn)題［7］。盡管三維適形放射治療、調(diào)強(qiáng)適形放射治療等技術(shù)逐漸成熟，但RE的發(fā)生率仍無(wú)明顯改善。提前預(yù)測(cè)RE的發(fā)生并采取支持性的治療，是降低RE發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。

本研究顯示，與非RE組相比，RE組放射治療前后的CD4+/CD8+比值、B淋巴細(xì)胞比例均下降，提示細(xì)胞免疫功能失衡與宮頸癌放射治療患者RE的發(fā)生有關(guān)。B淋巴細(xì)胞具有更高的輻射敏感性，在放射治療期間更易受到輻射線影響［8］。輻射一方面會(huì)殺滅腫瘤細(xì)胞，另一方面會(huì)導(dǎo)致腸黏膜免疫調(diào)節(jié)功能失調(diào)，增加放射治療后RE的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［9］。胡格等［10］的研究也發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者CD4+/CD8+比值越低、B淋巴細(xì)胞比例下降越明顯，患者放射治療后出現(xiàn)RE的概率越高。本研究顯示，免疫功能失衡越嚴(yán)重，患者更易發(fā)生較為嚴(yán)重的RE，考慮與腸黏膜免疫系統(tǒng)失衡誘導(dǎo)的過(guò)度炎癥反應(yīng)會(huì)損害腸屏障功能，導(dǎo)致吸收障礙和血管損傷，使腸壁黏膜蒼白、脆弱，最終壞死有關(guān)［11］。

王中秋等［12］研究發(fā)現(xiàn)，特定菌群豐度的改變，會(huì)使機(jī)體處于慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，影響屏障完整性與免疫功能，從而促進(jìn)腸道疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，發(fā)生RE的宮頸癌患者，其腸道微生物多樣性較低。分析原因可能為輻射使腸壁萎縮、腸黏膜損傷，導(dǎo)致腸道分泌功能減退，使腸道菌群分布發(fā)生改變，引起腸道微生態(tài)失衡，最終導(dǎo)致腸道微生物多樣性降低［13］。本研究中，2組患者的腸道微生物β多樣性比較無(wú)明顯差異，這與既往研究結(jié)果不同，考慮與患者個(gè)體差異、輻射時(shí)長(zhǎng)不同等有關(guān)［14］。在腸道微生物組成方面，本研究顯示，發(fā)生RE的宮頸癌患者腸道微生物Acidaminococcus、Dialster和Pyramidobacter豐度水平發(fā)生明顯改變。Acidaminococcus、Dialister是定植于人類腸道的正常菌群，均屬于機(jī)會(huì)致病菌，二者的富集與腸道功能障礙密切相關(guān)［15］。Pyramidobacter多數(shù)為厭氧菌，其代謝產(chǎn)物丁酸鹽可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，并能通過(guò)影響結(jié)腸上皮細(xì)胞的新陳代謝，發(fā)揮維持腸道微生態(tài)平衡的作用［16］。據(jù)此可推測(cè)，RE患者在Acidaminococcus、Dialister和Pyramidobacter等屬水平上豐度的改變，可能會(huì)誘發(fā)腸黏膜炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大量炎性因子釋放的釋放，從而激活炎癥通路，使黏膜屏障被破壞，從而出現(xiàn)腹痛、腹瀉、便血等臨床癥狀。

綜上所述，進(jìn)展期宮頸癌放射治療患者CD4+/CD8+比值、B淋巴細(xì)胞比例和腸道微生物特征與RE密切相關(guān)，治療期間CD4+/CD8+比值、B淋巴細(xì)胞比例下降和腸道微生態(tài)失衡的患者更容易發(fā)生RE。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-09-07）

（本文編輯：林燕薇）