慢性腎臟病患者血清miR-155、FT3水平對血管鈣化預(yù)測價值*

劉紅艷,布合力其·麥麥提,馮 琦,徐 超,任 榮

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腎病科,新疆烏魯木齊 830011

心肌、心臟瓣膜、血管的鈣化是慢性腎臟病(CKD)發(fā)生心血管并發(fā)癥的重要因素,相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,CKD患者中90%的冠心病和80%的動脈病變與血管鈣化有關(guān)[1]。血管鈣化主要表現(xiàn)為磷酸鈣鹽的沉積,在心臟瓣膜、血管內(nèi)膜及中膜均可發(fā)生,其具體機(jī)制仍未完全闡明[2]。有研究報道,血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化是血管鈣化的重要機(jī)制[3]。微小RNA-155(miR-155)由非編碼基因BIC轉(zhuǎn)錄活化形成,位于21q21.3染色體,參與腫瘤進(jìn)展、造血細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種生理病理過程。且研究發(fā)現(xiàn),miR-155可能是通過影響血管平滑肌細(xì)胞中鈣敏感受體活性而調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞生長[4]。因此,推測miR-155可能在CKD患者血管鈣化中發(fā)揮作用。甲狀腺功能異常與心血管疾病密切相關(guān),對終末期腎病血管鈣化、冠狀動脈鈣化有一定影響。游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)是甲狀腺激素的游離形式,可調(diào)節(jié)代謝及蛋白合成,刺激組織生長,CKD患者常發(fā)生甲狀腺功能減退癥,表現(xiàn)為FT3水平降低[5]。miR-155、FT3均與腎臟功能改變存在一定關(guān)系,但是否直接參與血管鈣化,尚需數(shù)據(jù)支持。本研究選取本院CKD患者,旨在分析血清miR-155、FT3水平與血管鈣化的關(guān)系,為臨床干預(yù)提供借鑒。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年7月至2022年3月本院CKD患者142例。納入研究的對象均符合CKD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];排除急性加重期、急性腎損傷、合并嚴(yán)重感染、長期糖皮質(zhì)激素治療史、甲狀腺功能亢進(jìn)的患者。CKD患者中男84例,女58例;年齡44～71歲,平均(57.43±6.21)歲。另選取同期體檢健康者142例,其中男80例,女62例;年齡42～68歲,平均(55.72±6.63)歲。CKD患者與體檢健康者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意(批準(zhǔn)文號:20200522741),受試者均知情本研究、簽署同意書。

1.2方法

1.2.1檢測方法 CKD患者入院24 h內(nèi)、體檢健康者體檢當(dāng)日抽取空腹靜脈血3 mL,離心處理(轉(zhuǎn)速3 000 r/min,時間10 min),取上層清液低溫保存。血清miR-155水平檢測通過聯(lián)邁生物Trizol試劑盒方法分離得到細(xì)胞RNA,使用上海凈信實業(yè)核酸定量測儀檢測其濃度、純度,以總RNA為模板,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR),反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延申30 s,共40個循環(huán)。miR-155引物,F 5′-CTCGTGGTAATGCTAATTGTGA-3′,R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,以U6為內(nèi)參,U6引物F 5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′,R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,以U6作為內(nèi)參基因,最后用2-ΔΔCt法計算miR-155相對表達(dá)水平。以放射免疫法檢測血清FT3水平,試劑盒均購自山東天合環(huán)境科技有限公司。

1.2.2血管鈣化評估 對患者行胸部CT檢測,由本院2名經(jīng)驗豐富的影像學(xué)醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立閱片,根據(jù)主動脈、冠狀動脈是否存在鈣化進(jìn)行判斷,若2名醫(yī)師判斷結(jié)果不一致,則重新評估,直至結(jié)果一致。

1.2.3疾病分期 根據(jù)依據(jù)腎小球濾過率進(jìn)行分期,腎小球濾過率估算值[mL/(min·1.73 m2)]=175×血肌酐(mg/dL)-1.234×年齡-0.179(女性×0.79),分期標(biāo)準(zhǔn):腎小球濾過率估算值>90 mL/(min·1.73 m2)為Ⅰ期;60～90 mL/(min·1.73 m2)為2期,30～<60 mL/(min·1.73 m2)為3期,15～<30 mL/(min·1.73 m2)為4期,<15 mL/(min·1.73 m2)為5期。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較CKD患者與體檢健康者血清miR-155、FT3水平。(2)統(tǒng)計CKD患者血管鈣化情況。(3)比較出現(xiàn)及未出現(xiàn)血管鈣化的CKD患者相關(guān)資料。(4)CKD患者血管鈣化的影響因素分析及Logistic回歸模型構(gòu)建。(5)CKD患者血管鈣化的列線圖預(yù)測模型建立及驗證。(6)血清miR-155、FT3水平評估CKD患者血管鈣化的決策曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1CKD患者與體檢健康者血清miR-155、FT3水平比較 CKD患者miR-155水平高于體檢健康者,FT3水平低于體檢健康者(P<0.05)。見表1。

表1 CKD患者與體檢健康者血清miR-155、FT3水平比較

2.2CKD患者血管鈣化情況 142例患者中47例出現(xiàn)血管鈣化,95例未出現(xiàn)血管鈣化,血管鈣化率為33.10%。

2.3出現(xiàn)及未出現(xiàn)血管鈣化的CKD患者相關(guān)資料比較 血管鈣化的CKD患者年齡≥60歲、合并糖尿病、冠心病的例數(shù)多于未血管鈣化的患者,血管鈣化的CKD患者疾病分期、miR-155水平高于未鈣化患者,血管鈣化CKD患者的FT3水平低于未鈣化患者(P<0.05)。見表2。

表2 出現(xiàn)及未出現(xiàn)血管鈣化的CKD患者相關(guān)資料比較[n(%)或

2.4CKD患者血管鈣化的影響因素分析及Logistic回歸模型構(gòu)建 以CKD患者是否出現(xiàn)血管鈣化為因變量,以年齡、糖尿病、冠心病、疾病分期、miR-155、FT3水平為自變量,根據(jù)表3內(nèi)容進(jìn)行賦值,采用Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,合并糖尿病、冠心病、疾病分期高、血清miR-155水平升高是CKD患者血管鈣化的獨(dú)立危險因素(P<0.05),FT3水平升高是CKD患者血管鈣化的保護(hù)因素(P<0.05)。見表4。構(gòu)建Logistic回歸模型:Logit(P)=-6.784+1.046×糖尿病+1.182×冠心病+1.009×疾病分期+1.255×miR-155-0.999×FT3。對回歸模型進(jìn)行評價,似然比χ2=106.315,自由度=7,P<0.001,模型建立差異有統(tǒng)計學(xué)意義;Waldχ2=108.665,自由度=8,P<0.001,回歸方程的系數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,模型構(gòu)建有效,采用Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗,χ2=6.574,自由度=7,P=0.192,擬合效果較好。

表3 賦值方案

2.5CKD患者血管鈣化的列線圖預(yù)測模型建立及驗證 根據(jù)Logistic回歸分析結(jié)果,納入5個獨(dú)立影響因素(糖尿病、冠心病、疾病分期、miR-155、FT3)構(gòu)建CKD患者血管鈣化的列線圖預(yù)測模型,見圖1,預(yù)測模型預(yù)測CKD患者血管鈣化的曲線下面積(AUC)為0.873(95%CI:0.758～0.902),采用校準(zhǔn)曲線驗證模型的精準(zhǔn)度,預(yù)測值與實際結(jié)果幾乎相同,校準(zhǔn)曲線接近理想?yún)⒖季€,具有較高一致性,表明精準(zhǔn)度、區(qū)分度較好,預(yù)測效果令人滿意,見圖2、3。

圖1 CKD患者血管鈣化的列線圖預(yù)測模型

圖2 列線圖預(yù)測模型預(yù)測CKD患者血管鈣化的ROC曲線

圖3 列線圖預(yù)測模型校準(zhǔn)曲線驗證

2.6血清miR-155、FT3水平評估CKD患者血管鈣化的決策曲線分析 以風(fēng)險閾值為橫坐標(biāo)、以凈收益率為縱坐標(biāo)繪制決策曲線,結(jié)果顯示,當(dāng)風(fēng)險閾值為0.00～0.95時凈受益率>0,表明具有臨床意義,且當(dāng)風(fēng)險閾值越小時凈受益率越大,凈受益率最大為0.3。當(dāng)風(fēng)險閾值為0.15～0.95時,血清miR-155、FT3聯(lián)合檢測的凈受益率大于單獨(dú)檢測。見圖4。

圖4 血清miR-155、FT3水平評估CKD患者血管鈣化的決策曲線

3 討 論

心血管疾病是CKD患者常見并發(fā)癥,而血管鈣化是其發(fā)生的危險因素,且可進(jìn)一步誘導(dǎo)不良心血管事件,嚴(yán)重時可造成心肌梗死、心力衰竭,威脅患者生命。因此,分析CKD患者血管鈣化發(fā)生的機(jī)制并制訂有效干預(yù)措施具有重要意義。CKD血管鈣化主要是由于抑制及促進(jìn)因子失衡所致,機(jī)制復(fù)雜,影響因素較多,尋找可用于早期預(yù)測血管鈣化的客觀指標(biāo)便于指導(dǎo)臨床治療方案的制訂,以降低心血管并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險。

多項研究證實,miRNA參與多種腎臟疾病的發(fā)生、進(jìn)展,如miR-27a、miR-92a、miR-30a均與糖尿病腎病密切相關(guān)[7-9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miR-155在糖尿病腎病[10]、IgA腎病[11]、狼瘡性腎炎[12]等腎臟疾病中存在異常表達(dá),但其在CKD中的表達(dá)情況尚缺乏相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示,CKD患者miR-155水平高于體檢健康者,提示miR-155或參與CKD發(fā)生、進(jìn)展。miR-155具有促進(jìn)炎癥進(jìn)展、調(diào)節(jié)免疫的作用,通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、激活B淋巴細(xì)胞導(dǎo)致免疫異常,達(dá)到刺激腎臟炎癥反應(yīng)的目的[13-14]。這可能是CKD患者血清miR-155水平異常升高的主要原因。FT3是評估甲狀腺功能的敏感指標(biāo),其水平變化受血清蛋白、結(jié)合球蛋白影響較小,具有良好穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)CKD患者血清FT3水平較體檢健康者更低,這可能是由于CKD患者易出現(xiàn)低T3綜合征。FT3對膽固醇具有調(diào)節(jié)作用,CKD患者出現(xiàn)低T3綜合征后,可降低低密度脂蛋白膽固醇受體mRNA表達(dá),降低膽固醇7-α羥化酶的mRNA水平,阻礙膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致膽固醇水平升高,從而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂[15-16]。同時,甲狀腺功能異?？烧T導(dǎo)腎功能異常,對腎臟血流、腎小管功能、腎小球濾過率、腎臟結(jié)構(gòu)、電解質(zhì)平衡等均有明顯影響[17]。CKD患者FT3水平異常降低可能是由于腎臟損害會降低5′脫碘酶活性,減弱外環(huán)脫碘向FT3轉(zhuǎn)化的作用,導(dǎo)致FT3水平降低。

本研究構(gòu)建Logistic回歸分模型發(fā)現(xiàn),在保持其他變量不變的情況下,血清miR-155、FT3水平異常變化仍是CKD患者血管鈣化的獨(dú)立影響因素,提示血清miR-155、FT3或與CKD患者血管鈣化有關(guān)。目前臨床認(rèn)為,血管鈣化與血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化有關(guān),而miR-155具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖及血管形成的作用,當(dāng)miR-155過表達(dá)時可抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣敏感受體活性,并降低鈣敏感受體表達(dá),且有助于抑制細(xì)胞凋亡,促使血管平滑肌細(xì)胞增殖,最終可能起到促進(jìn)血管鈣化的作用。在該過程中,PI3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞生物活性的重要通路,miR-155在抑制鈣敏感受體的同時可增強(qiáng)PI3K活性,進(jìn)一步提高平滑肌細(xì)胞生物學(xué)活性。因此,miR-155高表達(dá)可能在CKD患者血管鈣化中發(fā)揮重要作用。CKD患者FT3水平降低導(dǎo)致血管鈣化的機(jī)制可能與以下因素有關(guān):(1)FT3低表達(dá)刺激促炎因子生成,提高血管鈣化風(fēng)險;(2)FT3水平異常低表達(dá)表明甲狀腺激素水平改變,進(jìn)而影響脂代謝,提高血脂水平;(3)甲狀腺功能異?？杉せ铙w內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),促使血鈣被動沉積;(4)甲狀腺功能異常造成的血管內(nèi)皮損傷,是血管鈣化的關(guān)鍵因素。因此,FT3水平降低對血管鈣化有促進(jìn)作用。本研究構(gòu)建的列線圖預(yù)測模型對評估CKD患者血管鈣化風(fēng)險具有較高準(zhǔn)確率,進(jìn)一步通過決策曲線分析,發(fā)現(xiàn)當(dāng)風(fēng)險閾值為0.15～0.95時,miR-155、FT3聯(lián)合檢測的凈受益率大于單獨(dú)檢測,表明miR-155、FT3聯(lián)合檢測對評估CKD患者血管鈣化的價值更高,具有臨床應(yīng)用價值。

綜上所述,CKD患者血清miR-155水平異常升高、FT3水平異常降低,且二者異常表達(dá)均與患者血管鈣化有關(guān),當(dāng)miR-155水平升高、FT3水平降低時表明CKD患者血管鈣化風(fēng)險較高,臨床應(yīng)及時采取干預(yù)措施以預(yù)防血管鈣化。本研究局限性在于未對建立的模型進(jìn)行外部驗證,結(jié)果或存在一定偏倚,仍需臨床選取更多病例進(jìn)一步證實。