結(jié)直腸癌組織microRNA-16-5p、microRNA-493-5p 表達(dá)與PI3K/Akt/mTOR信號通路和預(yù)后的關(guān)系研究*

姚 勇,李 森△,徐文龍,朱俊佳,盛華明

東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院:1.肛腸外科;2.腫瘤科,江蘇江陰 214400

結(jié)直腸癌(CRC)是世界范圍內(nèi)第3大惡性腫瘤,其病死率居于惡性腫瘤第4位,目前我國CRC發(fā)病率及病死率呈持續(xù)升高趨勢,給家庭及社會均帶來巨大的負(fù)擔(dān)[1]。手術(shù)治療、術(shù)后輔助化療或放化療依然是CRC治療的主要手段,但部分患者術(shù)后生存期依然較短,預(yù)后差[2]。故尋找與CRC病情進(jìn)展、預(yù)后密切相關(guān)的生物標(biāo)志物有助于通過早期診治改善CRC患者預(yù)后。微小RNA(miRNA)是一類與癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的單鏈小RNA分子,且miRNA與癌細(xì)胞惡性生物行為學(xué)相關(guān)[3]。研究顯示,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miRNA-16-5p(miR-16-5p)能夠抑制CRC細(xì)胞增殖和侵襲,同時能夠促進(jìn)其凋亡[4]。另有報道發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-16-5p能抑制CRC上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[5]。CUI等[6]報道,過表達(dá)miRNA-493-5p(miR-493-5p)可抑制CRC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,低表達(dá)時發(fā)揮的作用則相反。磷脂酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路的激活是CRC等多種癌癥惡性進(jìn)展的關(guān)鍵通路[7-8]。本研究以CRC患者為研究對象,探討miR-16-5p、miR-493-5p與PI3K/AKT/mTOR通路及預(yù)后的關(guān)系,為CRC臨床診治提供新的可靠生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年1月本院收治的126例接受根治性切除手術(shù)的CRC患者,其中男72例,女54例;年齡40～75歲,平均(59.72±8.34)歲;病灶部位:左半結(jié)腸43例,右半結(jié)腸25例,直腸58例;臨床分期:Ⅰ期27例,Ⅱ期52例,Ⅲ期47例;腫瘤最大徑:<5 cm 85例,≥5 cm 41例;腫瘤分化程度:高分化14例,中分化96例,低分化16例;T分期:T1期9例,T2期19例,T3期86,T4期12例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合CRC診斷標(biāo)準(zhǔn)[9],且經(jīng)病理檢查、影像學(xué)檢查確診;(2)擬接受根治性切除手術(shù);(3)術(shù)前未接受放化療及其他綜合療法治療;(4)臨床分期Ⅰ～Ⅲ期;(5)簽署知情同意書;(6)年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴其他部位原發(fā)腫瘤;(2)伴腸道炎癥性疾病或全身其他感染性疾病;(3)既往接受CRC相關(guān)治療后復(fù)發(fā);(4)存在認(rèn)知或溝通障礙;(5)伴急性腸梗阻等嚴(yán)重并發(fā)癥;(6)臨床分期Ⅳ期。本研究獲得本院倫理委員會審批。

1.2治療方法 126例患者均接受根治性切除手術(shù),包括開腹手術(shù)78例,腹腔鏡手術(shù)48例。術(shù)后依據(jù)《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017年版)》[9]進(jìn)行術(shù)后化療者91例,化療方案:氟尿嘧啶單藥者16例、卡培他濱31例、FOLFOX6方案26例、XELOX方案18例。

1.3組織中mRNA表達(dá)水平檢測 術(shù)中取癌組織,另取自距離癌腫5 cm的腸黏膜作為癌旁組織,標(biāo)本采集完成后置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｈ〈郎y組織,研磨后采用RNA提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司)提取總RNA,采用DU800紫外分光光度計(美國Beckmancoulter公司)測定260 nm吸光度(A)值,計算RNA濃度,A260/A280在1.8～2.1說明RNA純度較好,瓊脂糖凝膠電泳28S、18S rRNA條帶清晰,且兩條帶亮度比值≥1.5說明RNA完整性較好。將獲取的RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并以cDNA為模板鏈進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測,按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒設(shè)計20 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;(95 ℃變性15 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min)×42個循環(huán)。miR-16-5p、miR-493-5p以U6為內(nèi)參,PI3K、Akt、mTOR以β-actin為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。所有引物設(shè)計及合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。見表1。

表1 引物序列

1.4隨訪 所有患者出院后以電話或復(fù)診方式進(jìn)行為期3年的隨訪,第1年隨訪頻率為3個月1次,隨后6個月1次。終點(diǎn)事件為患者全因死亡、失訪、隨訪時間截止,術(shù)后隨訪開始至全因死亡、失訪時間、隨訪時間截止記為總生存期(OS)。

2 結(jié) 果

2.1RNA質(zhì)量測定結(jié)果 總RNA A260/A280為1.90,瓊脂糖凝膠電泳提示28S與18S rRNA帶亮度比值均>1.5,總RNA濃度750 ng/μL,說明RNA純度高、完整性較好,本次獲得的RNA質(zhì)量好,可應(yīng)用于后續(xù)試驗研究。見圖1。

注:A、B分別為癌組織和癌旁組織總RNA凝膠電泳圖。

2.2癌組織與癌旁組織中miR-16-5p、miR-493-5p表達(dá)水平比較 癌組織中miR-16-5p、miR-493-5p表達(dá)水平均低于癌旁組織(P<0.05)。見表2。

表2 癌組織與癌旁組織中miR-16-5p、miR-493-5p表達(dá)水平比較

2.3癌組織與癌旁組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平比較 癌組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平均高于癌旁組織(P<0.05)。見表3。

表3 癌組織與癌旁組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平比較

2.4miR-16-5p、miR-493-5p與PI3K/Akt/mTOR信號通路的相關(guān)性分析 癌組織中miR-16-5p、miR-493-5p與PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 miR-16-5p、miR-493-5p與PI3K/Akt/mTOR信號通路的相關(guān)性分析

2.5癌組織miR-16-5p、miR-493-5p表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 以癌組織中miR-16-5p平均值0.18、miR-493-5p平均值1.21作為分界點(diǎn)劃分為高表達(dá)和低表達(dá)。臨床分期為Ⅲ期患者中miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)者占比高于Ⅰ期和Ⅱ期(P<0.05),臨床分期為Ⅰ期與Ⅱ期患者中miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)者占比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);低分化患者中miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)者占比高于中分化和高分化,且中分化患者中miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)者占比高于高分化(P<0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)者占比高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05);T4分期患者中miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)者占比高于T1和T2分期(P<0.05),T3分期患者中miR-493-5p低表達(dá)者占比高于T1分期(P<0.05)。不同性別、年齡、病灶部位、腫瘤最大徑患者中miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)者占比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 癌組織miR-16-5p、miR-493-5p表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.6miR-16-5p、miR-493-5p高表達(dá)與低表達(dá)患者3年OS生存曲線比較 隨訪3年,126例患者中7例失訪,119例成功隨訪。隨訪率為94.44%,總生存率為80.67%(96/119)。依據(jù)各生存資料建立Kaplan-Meier生存曲線,見表6、圖2。分析顯示,miR-16-5p高表達(dá)和低表達(dá)患者3年累積生存率為93.22%、68.33%,生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rankχ2=5.565,P=0.017)。miR-493-5p高表達(dá)和低表達(dá)患者3年累積生存率為94.74%、67.74%,生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rankχ2=6.313,P=0.012)。

圖2 miR-16-5p及miR-493-5p高、低表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存曲線

表6 miR-16-5p、miR-493-5p高表達(dá)與低表達(dá)患者生存資料比較[n(%)]

3 討 論

CRC早期缺乏特異性臨床癥狀,根治性手術(shù)輔助化療依然是CRC治療的主要手段,其能夠在一定程度上延長患者生存期,但患者預(yù)后仍不十分理想[10]。CRC發(fā)病病因尚不明確,可能與多種因素相互作用有關(guān),近年來研究認(rèn)為,癌基因與抑癌基因表達(dá)紊亂是CRC發(fā)生及病情進(jìn)展的關(guān)鍵[11]。miRNA位于非編碼區(qū),通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控靶基因的表達(dá)參與復(fù)雜的生命過程,miRNA通過與癌基因或抑癌基因的信使RNA定向結(jié)合參與癌細(xì)胞惡性行為學(xué)的調(diào)控,并根據(jù)惡性腫瘤類型或所處階段的不同扮演不同角色,為探究惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制提供了可能[12]。PI3K/Akt/mTOR通路激活參與CRC細(xì)胞增殖促進(jìn)和凋亡抑制等多個過程[13],尋找與該通路密切相關(guān)的非編碼區(qū)miRNA異常表達(dá)基因,對改善CRC臨床預(yù)后至關(guān)重要。

miR-16-5p作為腫瘤抑制因子,參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。WANG等[14]發(fā)現(xiàn),miR-16-5p在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá),過表達(dá)miR-16-5p能有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,將細(xì)胞阻滯于G2/M期而誘導(dǎo)凋亡,說明miR-16-5p低表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞無限增殖。REIS等[15]臨床研究顯示,肺癌患者循環(huán)血中miR-16-5p表達(dá)下調(diào),在肺腺癌和肺鱗癌早期篩查中具有較高的特異度和靈敏度。上述研究結(jié)果均說明低表達(dá)miR-16-5p參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等惡性行為學(xué)。miR-493-5p定位于20q11.2,已有研究發(fā)現(xiàn),miR-493-5p異常表達(dá)參與肝細(xì)胞癌[16]、胃癌[17]等惡性腫瘤進(jìn)展。LIU等[18]發(fā)現(xiàn),miR-493-5p在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中均顯著下調(diào),過表達(dá)miR-493-5p能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性行為,提示其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示,miR-16-5p和miR-493-5p在CRC癌組織中低表達(dá),這與二者在其他癌細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果一致,提示其在癌細(xì)胞中的功能相似。PI3K/Akt/mTOR是參與癌細(xì)胞增殖等惡性行為學(xué)的核心通路,該通路的激活提示CRC等癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),凋亡能力抑制,耐藥性增強(qiáng)等[19]。蔚晉斌等[20]在骨肉瘤細(xì)胞體外研究中證實,miR-16-5p能通過靶蛋白負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號通路,這與本研究結(jié)果相符。本研究相關(guān)性分析顯示,miR-16-5p和miR-493-5p與PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān),提示miR-16-5p和miR-493-5p可能具有負(fù)調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用,miR-16-5p和miR-493-5p可能通過調(diào)控編碼區(qū)靶蛋白的mRNA間接調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路,但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實。

本研究發(fā)現(xiàn),臨床分期、T分期越高,腫瘤分化程度越低,miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)率越高,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,說明miR-16-5p、miR-493-5p與臨床分期、腫瘤分化程度及浸潤程度有關(guān)。本研究還顯示,miR-16-5p高表達(dá)和低表達(dá)患者3年累積生存率為93.22%、68.33%。miR-16-5p高表達(dá)與低表達(dá)患者生存曲線比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-493-5p高表達(dá)和低表達(dá)患者3年累積生存率為94.74%、67.74%,miR-493-5p高表達(dá)與低表達(dá)患者生存曲線比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示miR-16-5p、miR-493-5p高表達(dá)患者根治手術(shù)預(yù)后較好。CHEN等[21]發(fā)現(xiàn),肺腺癌患者血清外泌體中miR-16-5p異常低表達(dá),其表達(dá)水平與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān),且與程序性細(xì)胞死亡配體-1(PD-L1)陽性患者PD-L1抑制劑治療后OS延長有關(guān)。LIANG等[22]發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中miR-493-5p表達(dá)下調(diào),且其低表達(dá)與患者無進(jìn)展生存期及OS較短有關(guān)。由上述研究中可知miR-16-5p、miR-493-5p表達(dá)水平越低,癌細(xì)胞的增殖、侵襲等能力越強(qiáng),凋亡能力越弱,因此分析由于miR-16-5p、miR-493-5p低表達(dá)CRC癌灶中的細(xì)胞惡性侵襲能力更強(qiáng),有利于癌細(xì)胞向周圍組織浸潤,促進(jìn)CRC病情進(jìn)展,可能與miR-16-5p、miR-493-5p負(fù)調(diào)控細(xì)胞易損信號通路PI3K/Akt/mTOR有關(guān)。

綜上所述,miR-16-5p、miR-493-5p在CRC癌組織中表達(dá)均下調(diào),且與PI3K/Akt/mTOR信號通路呈負(fù)相關(guān),miR-16-5p、miR-493-5p高表達(dá)患者生存期延長,可作為臨床中CRC術(shù)后病情進(jìn)展輔助評估的可靠生物標(biāo)志物,同時為CRC治療提供了潛在靶點(diǎn)。