不同藥敏試驗(yàn)方法檢測耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌對替加環(huán)素敏感性的效能評價*

謝國艷,周林艷,梁 斌,裴凌燕,王禹婷,李鳳嬌,劉慶中△

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.病理科,上海 200071

替加環(huán)素是美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的首個甘氨酰四環(huán)素類抗菌藥物,其抗菌譜廣,抗菌活性強(qiáng),能夠治療多重耐藥(MDR)革蘭陰性和革蘭陽性細(xì)菌引起的感染[1-2]。在當(dāng)前耐藥菌廣泛流行的背景下,替加環(huán)素已成為這些病原菌感染治療的一線藥物[3],但隨著使用量的增加其耐藥率也隨之升高[1]。因此,根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱藥敏試驗(yàn))結(jié)果正確選擇替加環(huán)素用于感染治療,對減少和延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生至關(guān)重要。

目前,替加環(huán)素體外藥敏試驗(yàn)方法主要有肉湯微量稀釋(BMD)法和紙片擴(kuò)散(KB)法,其中BMD法為參考方法[4]。雖然歐洲抗菌藥物敏感性測試委員會(EUCAST)、FDA和英國抗菌化療協(xié)會(BSAC)制定了適合少量菌種(大腸埃希菌和柯氏枸櫞酸桿菌)對替加環(huán)素敏感性的最低抑菌濃度(MIC)折點(diǎn),但至今美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)仍缺乏相應(yīng)的判讀標(biāo)準(zhǔn)[4]。研究顯示,不同的藥敏試驗(yàn)方法檢測替加環(huán)素的敏感性會存在差異,導(dǎo)致對其耐藥性的判斷出現(xiàn)錯誤[2]。BMD法結(jié)果雖然準(zhǔn)確,但操作煩瑣,臨床上不易常規(guī)實(shí)行。因此,尋找簡便易行、結(jié)果可靠的替代方法勢在必行。本研究即擬評估臨床上可用的儀器法、E-test法及KB法檢測耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌對替加環(huán)素的敏感性,評估其與參考方法BMD法的一致性,以期獲得不同菌種對應(yīng)的最佳檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料來源 收集本院2020年8月至2022年3月臨床分離的非重復(fù)耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌211株(其中肺炎克雷伯菌96株、鮑曼不動桿菌62株、大腸埃希菌48株和陰溝腸桿菌5株)。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.2儀器與試劑 所有菌株經(jīng)Vitek2 Compact全自動微生物鑒定儀鑒定,亞胺培南和/或美羅培南耐藥性由配套藥敏卡檢測并經(jīng)KB法確認(rèn)。Vitek2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀及配套GN335藥敏卡為法國梅里埃公司產(chǎn)品,替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品購自國家衛(wèi)生健康委食品藥品鑒定所,替加環(huán)素藥敏紙片(15微克/片)為英國Oxoid公司產(chǎn)品,替加環(huán)素E-test試紙條為溫州市康泰生物科技有限公司產(chǎn)品、水解酪蛋白(MH)肉湯為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品,水解酪蛋白瓊脂(MH)平板購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司,替加環(huán)素緩沖液購自上海原科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3試驗(yàn)方法 按照美國CLSI推薦的操作[4]進(jìn)行。判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果時質(zhì)控菌株ATCC 25922的抑菌圈直徑范圍應(yīng)為20～27 mm,MIC值范圍應(yīng)為0.03～0.25 μg/mL,以證明在控[4]。

1.3.1BMD法 將替加環(huán)素倍比稀釋成0.062 5～32.000 0 μg/mL系列濃度的工作液,分別加入96孔無菌培養(yǎng)板,每孔100 μL,調(diào)節(jié)菌液至1.0×106CFU/mL,每孔加入100 μL,混勻,35 ℃培養(yǎng)16～20 h后觀察結(jié)果,孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為MIC值[4]。

1.3.2KB法 調(diào)節(jié)菌液至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?涂布于MH平板,待表面干后貼兩張?zhí)婕迎h(huán)素紙片于瓊脂表面,其中一張紙片加6 μL替加環(huán)素復(fù)敏液(KB1法),另一張紙片不加替加環(huán)素復(fù)敏液(KB2法),35 ℃培養(yǎng)16～18 h,測量抑菌圈直徑。

1.3.3儀器法 用Vitek 2 Compact全自動鑒定儀及GN335藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn),具體操作參照說明書,儀器軟件自動判讀MIC值。

1.3.4E-test法 操作同KB法,將紙片換成E-test試紙條,標(biāo)有刻度的一面向上貼于瓊脂表面,35 ℃培養(yǎng)16～20 h,讀取橢圓型抑菌圈與試紙條交界處刻度值,即為MIC值。

1.4判讀標(biāo)準(zhǔn) 替加環(huán)素的敏感性參照FDA推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)[5],見表1。

表1 替加環(huán)素敏感性的判定標(biāo)準(zhǔn)

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各種被評估方法與參考方法(BMD法)比較分析參數(shù)如下,Kappa值(κ>0.750表示一致性好,κ<0.400表示一致性差);基本一致率(EA):被評估方法與參考方法所得MIC值相同或相差上下一個濃度梯度的菌株百分率;分類一致率(CA):被評估方法與參考方法的符合率;微小誤差(mE):參考方法結(jié)果為敏感或耐藥,被評估方法為中介;重大誤差(ME):被評估方法將敏感判定為耐藥;非常重大誤差(VME):被評估方法將耐藥判定為敏感。根據(jù)美國CLSI要求,可接受誤差范圍為:EA和CA≥90%,VME≤1.5%,ME≤3%,mE≤10%[6]。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1BMD法檢測耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌的MIC值 96株肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的MIC50值(抑制50%菌株生長所需的MIC值)和MIC90值(抑制90%菌株生長所需的MIC值)分別為1.0、2.0 μg/mL,62株鮑曼不動桿菌的MIC50值和MIC90值分別為0.5、2.0 μg/mL,48株大腸埃希菌的MIC50值和MIC90值分別為0.5、1.0 μg/mL,5株陰溝腸桿菌的MIC50值和MIC90值分別為0.5、2.0 μg/mL。各菌種對替加環(huán)素MIC值的分布見表2。

表2 BMD法檢測各菌種對替加環(huán)素的MIC值分布(n)

2.2兩種KB法檢測各菌種對藥敏試驗(yàn)替加環(huán)素結(jié)果的比較 對于肺炎克雷伯菌,兩種KB法檢測的藥敏結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對于鮑曼不動桿菌,兩種KB法的敏感率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而對于大腸埃希就和陰溝腸桿菌,兩種KB法的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.34種被評估方法與BMD法檢測耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌對替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較 4種被評估方法檢測大腸埃希菌和陰溝腸桿菌對替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);E-test法檢測肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);KB1法檢測鮑曼不動桿菌中介株對替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);儀器法和KB2法檢測肺炎克雷伯菌(敏感、中介、耐藥株)和鮑曼不動桿菌(敏感、中介株)對替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4種被評估方法與BMD法檢測各菌種對替加環(huán)素藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較[n(%)]

2.44種被評估方法與BMD法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致性比較 4種被評估方法與BMD法檢測結(jié)果相比較,均未發(fā)現(xiàn)VME。E-test法檢測4種細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法相比,一致性好(κ>0.750),EA(94.8%～100.0%)、CA(91.7%～100%)和mE(0.0%～3.2%)均在可接受范圍,未發(fā)現(xiàn)ME和VME。儀器法檢測大腸埃希菌和陰溝腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法一致性好(κ=0.751、1.000),而對肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌則一致性較差(κ=0.209、0.316),具有較高的ME(4.2%和3.2%),尤其對鮑曼不動桿菌還同時存在mE偏高(11.3%)。KB1法檢測4種細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法的κ>0.750,EA、CA、mE、ME和VME均在可接受范圍,而KB2法除大腸埃希菌外(κ=0.639),對其余菌種檢測結(jié)果與BMD的一致性都不理想(κ<0.400)。見表4。

表4 4種被評估方法與BMD法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致性比較

3 討 論

隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用,細(xì)菌的耐藥率不斷增高,從而給該類抗菌藥物的選擇造成較大限制。替加環(huán)素針對臨床上的MDR菌具有很高的活性,它可與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合,將氨酰-tRNA阻擋在核糖體A位外,從而阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成,被認(rèn)為是治療該類細(xì)菌嚴(yán)重感染的最后有效措施[7-8]。臨床上,正確應(yīng)用替加環(huán)素需要可靠的藥敏試驗(yàn)方法進(jìn)行指導(dǎo),探尋便于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展且結(jié)果可靠的替加環(huán)素敏感性檢測方法尤為必要。有研究表明,FDA的替加環(huán)素敏感性判定折點(diǎn)優(yōu)于EUCAST[9-10],因此本研究采用FDA的判讀標(biāo)準(zhǔn)來評估各種方法檢測各菌種對替加環(huán)素藥敏試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

BMD法被稱為藥敏試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,可以準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化地定量測定菌株對抗菌藥物的MIC值,但對于大批量菌株的藥敏試驗(yàn),由于需要嚴(yán)格保證MH肉湯為新鮮配制[11],工作量大,耗時較長,臨床上不易常規(guī)開展。E-test法操作簡便、結(jié)果直觀,適用于單個樣本的檢測[12],是傳統(tǒng)基于稀釋藥敏試驗(yàn)方法的便捷替代品。本研究結(jié)果顯示,E-test法檢測耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌對替加環(huán)素的敏感性與BMD法具有非常好的一致性(κ>0.750),EA、CA、ME、mE、VME等評價指標(biāo)均在可接受范圍內(nèi),且所研究的4種細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法比較均無明顯差異,適合對替加環(huán)素敏感性的檢測。E-test法檢測價格較貴,難以在臨床上大批量常規(guī)開展,但在常規(guī)方法不能準(zhǔn)確檢測藥敏結(jié)果時,該方法不失為一種可靠的復(fù)檢手段。

當(dāng)前,微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展藥敏試驗(yàn)最多采用的是儀器法和KB法。儀器法高效、便捷,受到微生物檢測人員青睞。本研究結(jié)果顯示,儀器法檢測大腸埃希菌和陰溝腸桿菌對替加環(huán)素的敏感性結(jié)果與BMD法具有較好的一致性,各項(xiàng)評價指標(biāo)均在可接受范圍;但檢測肺炎克雷伯菌時替加環(huán)素的敏感率明顯低于BMD法(P<0.05),而中介率和耐藥率明顯高于BMD法(P<0.05);檢測鮑曼不動桿菌時替加環(huán)素的敏感率明顯低于BMD法(P<0.05),中介率明顯高于BMD法(P<0.05);這兩種細(xì)菌的儀器法結(jié)果與BMD法相比,一致性較差(κ<0.40),且評價指標(biāo)超出范圍不可接受(肺炎克雷伯菌ME為4.2%,鮑曼不動桿菌mE為11.3%、ME為3.2%),提示對儀器法檢測的上述兩種細(xì)菌的替加環(huán)素藥敏試驗(yàn)結(jié)果需謹(jǐn)慎解讀,這一結(jié)論與文獻(xiàn)報道一致[6,12]。

KB法操作簡便、成本低廉,為臨床使用最多的藥敏試驗(yàn)方法之一。研究顯示,替加環(huán)素理化性質(zhì)活潑,KB法的藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定易受實(shí)驗(yàn)條件中的光照、氧氣含量、實(shí)驗(yàn)時間等因素影響[8]。本研究通過比較常規(guī)KB法(KB2法)結(jié)果與BMD法,發(fā)現(xiàn)二者的一致性均不理想(大腸埃希菌κ=0.639,其他κ<0.400),除了大腸埃希菌的評價指標(biāo)在可接受范圍(陰溝腸桿菌的mE為20%,超出評價范圍),其余細(xì)菌的評價指標(biāo)均不可接受。本研究結(jié)果進(jìn)一步印證了常規(guī)KB法不適合檢測肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性的結(jié)論[6,11-12]。另外,本研究還采用了在常規(guī)KB法的基礎(chǔ)上滴加替加環(huán)素復(fù)敏液,即KB1法檢測細(xì)菌對替加環(huán)素的敏感性,復(fù)敏液為EDTA溶液,本身無抑菌作用,但可以消除替加環(huán)素抗菌活性的影響因素,恢復(fù)藥物的抗菌活性[8]。KB1法的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與BMD法表現(xiàn)出較好的一致性(κ>0.750),評價指標(biāo)均在可接受范圍,除鮑曼不動桿菌的中介率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)外,其余結(jié)果均與BMD法比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),KB1法檢測肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌敏感株對替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果明顯優(yōu)于KB2法。對于鮑曼不動桿菌,KB1法的mE(9.7%)接近可接受范圍的上限,可能與此方法檢測該菌的中介率明顯增高有關(guān)(與BMD法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),因此,當(dāng)KB1法檢測到鮑曼不動桿菌中介株時,需通過定量檢測法再次確認(rèn)。需要指出的是,本研究中陰溝腸桿菌菌株數(shù)量太少,需收集大樣本量的菌株進(jìn)一步證實(shí)KB1法是否適用于其對替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)檢測。

綜上所述,對于耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌,儀器法和KB1法可以常規(guī)檢測大腸埃希菌對替加環(huán)素的敏感性;而對于肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌,可以用KB1法檢測其對替加環(huán)素的敏感性;當(dāng)KB1法在檢測鮑曼不動桿菌中介株時需謹(jǐn)慎對待,可通過簡便有效的E-test法進(jìn)行復(fù)檢。