基于多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選益氣活血解毒合劑的提取工藝

劉 敏 陳麗芳 李京峰 田佳懿 年宏蕾 曾蔚欣

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100038

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，臨床表現(xiàn)為四肢末端麻木、蟻行感、針刺樣疼痛等，發(fā)病率占糖尿病總?cè)藬?shù)的50%以上[1-3]，嚴(yán)重影響了患者的身心健康及生活質(zhì)量。益氣活血解毒方為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院（以下簡稱“我院”）臨床驗(yàn)方，由黃芪、丹參、當(dāng)歸等藥味組成，諸藥合用，補(bǔ)中有通，溫清并用，共奏益氣活血、養(yǎng)血化瘀、通絡(luò)解毒之功，臨床用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變，效果顯著[4-6]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷為處方中君藥黃芪的定量指標(biāo)，具有降低糖尿病大鼠血糖的藥理作用[7]；丹酚酸B 為處方中臣藥丹參的定量指標(biāo)，對糖尿病大鼠有降低血糖、改善胰島素抵抗的作用[8]。故本研究以君藥及臣藥指標(biāo)性成分的含量及浸膏得率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，優(yōu)選益氣活血解毒合劑的提取工藝，以期為該制劑的進(jìn)一步研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；FA1004B 型萬分之一電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；KQ-600DE 型數(shù)控超聲波清洗儀（上海舒美超聲儀器有限公司）；BY-R20 型離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；SCI-FS 固定式混勻儀（美國賽洛捷克公司）。

1.2 材料

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（純度98.0%，批號：DST200619-013，成都曼思特生物有限公司），丹酚酸B 對照品（純度96.6%，批號：111562-201917，中國食品藥品檢定研究院）；黃芪（批號：2007126）、丹參（批號：2006142）、雞血藤（批號：2001123）、蘇木（批號：2008061）、當(dāng)歸（批號：2003137）、黃連（批號：2010008）購于北京盛世龍藥業(yè)有限公司，經(jīng)我院主管中藥師年宏蕾鑒定，均符合2020 版《中華人民共和國藥典》[9]一部項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件Agilent EClipse C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件：0～10 min，15%→20%A；10～20 min，20%→30%A；20～25 min，30%A；25～30 min，30%→15%A；流速1.0 ml/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μl，檢測波長：毛蕊異黃酮葡萄糖苷（260 nm，0～15 min），丹酚酸B（286 nm，15～30 min）。

2.1.2 混合對照品溶液制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B 對照品適量，加甲醇制成濃度分別為10.68、100.28 mg/ml 的混合溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 按處方比例，稱取益氣活血解毒合劑處方藥材，加8 倍量水提取3 次，每次1 h，收集所得藥液，濃縮至100 ml，即得益氣活血解毒合劑樣品溶液；精密吸取樣品溶液200 μl，置于1.5 ml EP管中，加入400 μl 甲醇，混合均勻，25℃14 000 r/min離心10 min，離心半徑為13.5 cm，取上清液作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對照溶液制備 按益氣活血解毒合劑的處方，分別稱取缺黃芪、丹參的其他藥材，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5 專屬性考察 精密吸取上述3 種溶液各10 μl，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，陰性對照溶液中無相應(yīng)吸收峰，被測成分無干擾且峰形良好，結(jié)果見圖1。

2.1.6 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液，加甲醇逐級稀釋，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B 回歸方程分別為Y=34.31X+8.941（r=0.999 9）；Y=5.281X-4.971（r=0.999 9）。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.106 8～10.680 0 mg/ml、丹酚酸B 在1.00 28～100.280 0 mg/ml 內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度考察 取“2.1.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷RSD 為0.51%，丹酚酸B RSD 為0.79%，表明儀器具有良好的精密度。

2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于供試品制備后0、6、9、12、16、24 h 按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷RSD 為0.93%，丹酚酸B RSD 為1.57%，表明該樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，平行制備6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷RSD 為0.58%，丹酚酸B RSD 為0.31%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取已知含量的益氣活血解毒合劑樣品溶液5 ml，平行量取6 份，按照質(zhì)量濃度比約為1∶1 分別精密加入適量對照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)

采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9（34）,以煎煮時(shí)間（A）、煎煮次數(shù)（B）、加水量（C）為考察因素，精密量取9 個(gè)正交實(shí)驗(yàn)樣品溶液各20 ml，移至干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，稱量后水浴蒸干，于105℃干燥3 h，取出置干燥器中冷卻30 min，迅速稱量。浸膏得率（%）=（W×V）/（20×Wt）×100%；W 為浸膏重量，V 為定容體積，Wt 為飲片重量。對浸膏得率、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和丹酚酸B的含量進(jìn)行綜合評分，分別賦予權(quán)重0.2、0.4、0.4，計(jì)算公式如下：綜合評分（%）=（浸膏得率/組內(nèi)最高值×0.2+毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量/組內(nèi)最高值×0.4+丹酚酸B 含量/組內(nèi)最高值×0.4）×100%。根據(jù)表3 極差R 分析可知，對試驗(yàn)結(jié)果影響因素C＞A＞B。方差分析結(jié)果顯示，因素A、B 無顯著性影響，因素C 具有顯著性影響，且C3＞C2＞C1。綜合考慮生產(chǎn)成本、工時(shí)、能源消耗等因素，最終選擇加10 倍量水提取3次，每次1 h，即A2B1C3為最優(yōu)提取工藝。結(jié)果見表2～4。

表2 益氣活血解毒合劑提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按處方量稱取飲片3 份，每份86 g，按最優(yōu)工藝提取，測定收膏率及毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B含量。結(jié)果見表5。

表5 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

益氣活血解毒合劑的君藥為黃芪，臣藥為丹參，2020 年版《中華人民共和國藥典》[9]規(guī)定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷為黃芪的定量指標(biāo)，丹參酮ⅡA 和丹酚酸B 為丹參的定量指標(biāo)。由于黃芪甲苷在紫外波長范圍內(nèi)無響應(yīng)[10-15]；丹參酮ⅡA 具有脂溶性，對光敏感，長時(shí)間加熱可能會(huì)轉(zhuǎn)化分解[16-17]，故選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B 為評價(jià)指標(biāo)，分別賦予40%的權(quán)重。中藥方劑藥味多成分復(fù)雜，其療效是建立在多成分、多靶點(diǎn)的綜合作用的基礎(chǔ)上，單一成分的含量難以全面衡量中藥質(zhì)量[18-20]，為了更加全面的評價(jià)提取工藝，故將浸膏得率賦予20%的權(quán)重。

益氣活血解毒合劑成分復(fù)雜，單一檢測波長難以兼顧每個(gè)待測成分的最佳靈敏度，故最終采用多波長切換法[21-22]。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了不同的流動(dòng)相體系（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液）、磷酸比例（0.01%、0.05%、0.1%）、柱溫（25℃、30℃、35℃）、流速（0.5、0.8、1.0 ml/min）對色譜峰的影響，最終確定流動(dòng)相體系為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫）、柱溫為35℃、流速為1 ml/min。