膝三針對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨形態(tài)學(xué)及行為學(xué)改變的影響

李仁重 孫 奎

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230061；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 安徽省針灸醫(yī)院骨二科，安徽合肥 230061

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，涉及關(guān)節(jié)軟骨和滑膜關(guān)節(jié)周圍的組織，表現(xiàn)為疼痛、腫脹、僵硬和功能障礙，其發(fā)病與肥胖、性別、衰老等多種因素有關(guān)[1]。KOA 的患病率、致殘率高，60 歲以上人群的患病率可達(dá)50%，致殘率高達(dá)53%，降低了老年人的生活質(zhì)量，同時(shí)增加了社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。目前西醫(yī)主要采用以減輕疼痛、消炎等控制癥狀為主的治療方法，長期服用西藥可能會(huì)帶來諸多不良反應(yīng)，且無明顯的軟骨保護(hù)作用[3]。中醫(yī)治療KOA 具有效果全面和安全可靠的獨(dú)特優(yōu)勢，而針刺又是中醫(yī)治療KOA 較為有效的方法之一，并以其療效顯著、操作簡便、經(jīng)濟(jì)安全、防治結(jié)合而受到廣大患者的青睞[4]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，觀察膝三針對KOA 模型大鼠行為學(xué)和軟骨組織的形態(tài)學(xué)的影響，為針刺治療該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

28 只3～4 周齡雄性SPF 級SD 大鼠，體重180～220 g[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：110322211102387552，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008，北京華阜康生物科技股份有限公司]，室溫（20±1）℃、濕度（55±15）%、晝夜各12 h 更替、自由進(jìn)食水適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白組、模型組各8 只，針刺組、西藥組各6 只?？瞻捉M和模型組各隨機(jī)取2 只用于模型驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物的處理符合中國科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》（2021093001）。

1.2 試劑和儀器

主要試劑：雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（批準(zhǔn)文號：H19990291，北京諾華制藥有限公司）；無菌針灸針φ0.3 mm×40.0 mm（注冊證號：20172270468，北京珞亞山川醫(yī)療器械有限公司）；蘇木精染液（批號：ZLI-961，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；伊紅染色液（批號：G1100）、Scott 藍(lán)化液（批號：G1865）均來自Solarbio 公司；超凈高級封片膠（批號：YZB，BASO公司）。

主要儀器：ABM-100 型小動(dòng)物麻醉（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；BYC-310 型藥品冷藏柜（山東博科生物技術(shù)有限公司）；CX43 型顯微鏡（OLYMPUS）；2235 型切片機(jī)（德國，Leica）；HGZF-101-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 模型的建立

除空白組外，其他三組大鼠參照陳益丹等[5]前交叉韌帶橫斷術(shù)方法制備KOA 模型。4 周后大鼠的左側(cè)后肢出現(xiàn)了腫脹、屈伸功能障礙等現(xiàn)象。從空白組與模型組各隨機(jī)取2 只大鼠進(jìn)行左膝關(guān)節(jié)X 線掃描。與空白組比較，若模型組左膝關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，關(guān)節(jié)面變模糊，部分有融合及骨贅形成，提示造模成功。

1.4 干預(yù)方法

①空白組：常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何干預(yù)。②模型組：造模后常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何干預(yù)。③針刺組：造模5 周后進(jìn)行大鼠左膝關(guān)節(jié)針刺干預(yù)，每天1 次，連續(xù)5 d 休息2 d，共治療3 周。操作：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]尋找大鼠左膝關(guān)節(jié)的內(nèi)膝眼、犢鼻、鶴頂作為進(jìn)針點(diǎn)。常規(guī)備皮消毒后，選用0.3 mm×40.0 mm 毫針，諸穴均直刺3～5 mm，針尖抵達(dá)軟骨表面，實(shí)際刺激其關(guān)節(jié)軟骨。使用平補(bǔ)平瀉捻轉(zhuǎn)手法（捻轉(zhuǎn)角度為90°～180°，速度為60～120 次/min）各30 s 后留針30 min，治療結(jié)束拔針并用無菌棉球按壓止血。④西藥組：為陽性對照組，左膝局部外搽雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，與針刺治療同時(shí)進(jìn)行。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測方法

①左膝關(guān)節(jié)X 線掃描：對空白組與模型組選出的大鼠進(jìn)行麻醉，使用X 線成像系統(tǒng)對大鼠左膝關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描。②一般情況觀察及Lequesne MG 評分：治療前（4 周后驗(yàn)證造模成功后）及治療后均由同1名不參與實(shí)驗(yàn)的課題組成員進(jìn)行評估。觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況等，并用Lequesne MG 的膝關(guān)節(jié)評估方法[7]對大鼠膝關(guān)節(jié)局部反應(yīng)（分為4 級）、步態(tài)改變（分為4 級）、關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍（分為4 級）及腫脹程度（分為3 級）進(jìn)行評估，Lequesne MG 評分為4 個(gè)指標(biāo)之和。癥狀越明顯，級別與分?jǐn)?shù)越高。③膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察：術(shù)后8 周處死各組大鼠，取其膝關(guān)節(jié)處軟骨組織進(jìn)行大體觀察。④蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)：將觀察后的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織用4%中性甲醛溶液固定，用濃度梯度醇脫水，用二甲苯透明，石蠟包埋，切片，顯微鏡下觀察。根據(jù)Mankin’s 評分[8]進(jìn)行評估，評分越高提示軟骨破壞越嚴(yán)重。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析或t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左膝關(guān)節(jié)X 線檢查結(jié)果

空白組大鼠關(guān)節(jié)間隙可見，未見骨贅形成，脛骨近端和股骨遠(yuǎn)端骨結(jié)構(gòu)均勻可見，未發(fā)現(xiàn)軟骨下硬化和骨囊腫。而模型組大鼠關(guān)節(jié)間隙變窄，脛骨平臺(tái)平面出現(xiàn)粗糙，股骨遠(yuǎn)端出現(xiàn)硬化，有骨贅形成。兩組X線情況比較，提示造模成功。見圖1。

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)X 線情況比較

2.2 各組大鼠治療前后Lequesne MG 評分比較

治療前，模型組Lequesne MG 評分高于空白組（P＜0.05）；治療后，模型組的Lequesne MG 評分高于空白組（P＜0.05），而針刺組低于模型組（P＜0.05）。治療后，模型組、針刺組、西藥組Lequesne MG 評分低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠治療前后Lequesne MG 評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠治療前后Lequesne MG 評分比較（分，±s）

注與空白組同期比較，aP＜0.05；與模型組同期比較，bP＜0.05?！?”表示無數(shù)據(jù)。

2.3 膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察

肉眼可見空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑呈淡藍(lán)色半透明狀，無裂紋及軟骨缺失，關(guān)節(jié)間隙未見狹窄，邊緣規(guī)整，未見明顯纖維化及裂紋形成，無軟骨下骨外露且無骨贅形成；模型組可見軟骨表面粗糙，灰暗失去光澤，關(guān)節(jié)間隙狹窄，有明顯纖維束狀改變，軟骨軟化和軟骨下骨外露現(xiàn)象，邊緣明顯骨贅形成；針刺組可見軟骨表面輕微粗糙，略暗淡有光澤，較平滑，有輕微軟骨軟化及軟骨剝脫現(xiàn)象。見圖2。

2.4 各組大鼠軟骨形態(tài)學(xué)比較

2.4.1 細(xì)胞形態(tài)比較 空白組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑整齊，表層軟骨細(xì)胞平坦而小，數(shù)量較多，排列整齊，層次清晰，細(xì)胞核清晰可見，染色質(zhì)分布均勻；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面有較多裂隙，軟骨基質(zhì)著色不均，軟骨面粗糙，表層和中間區(qū)域的軟骨細(xì)胞數(shù)量減少且排列紊亂，可見軟骨細(xì)胞增生與腫脹，細(xì)胞核皺縮，潮線模糊、斷裂；針刺組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面相對整齊，軟骨組織結(jié)構(gòu)尚清晰可見，軟骨膜附近可見少量成軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞數(shù)量略有增加，排列較有序，潮線染色較淺，結(jié)構(gòu)基本清晰。見圖3。

圖3 四組軟骨細(xì)胞蘇木精-伊紅染色比較（A、B、C、D：40×；E、F、G、H：200×）

2.4.2 軟骨組織病理Mankin’s 評分 與空白組比較，模型組評分明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組評分明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s 評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s 評分比較（分，±s）

注 與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

3 討論

KOA 是一種慢性退行性肌肉骨骼疾病，常因關(guān)節(jié)勞損、肥胖、機(jī)械創(chuàng)傷等多種因素引起。其特點(diǎn)是進(jìn)行性軟骨侵蝕，軟骨下骨轉(zhuǎn)換和骨贅形成，以及關(guān)節(jié)內(nèi)的其他病理改變[9-10]。中醫(yī)認(rèn)為KOA 屬于“骨痹”范疇，《素問·長刺節(jié)論》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹。”病因病機(jī)多因年老體衰，感受外邪、肝腎虧虛和痰濁瘀血，導(dǎo)致骨失滋養(yǎng)，進(jìn)而出現(xiàn)筋骨關(guān)節(jié)及肌肉疼痛、麻木、屈伸不利等癥狀[11]。

目前KOA 主要以細(xì)胞因子、炎癥因子、基因表達(dá)、信號通路等方面的研究為主[12]。研究發(fā)現(xiàn)，KOA 的發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmie retieulum stress，ERS）引起的軟骨細(xì)胞的凋亡有關(guān)[13]。ERS 通過激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）在軟骨細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的過程中起著重要的調(diào)控作用[14]。PERK 通路是UPR 的一種，在KOA 進(jìn)展中，ERS 標(biāo)志物PERK和CHOP 的表達(dá)水平增加；CHOP 可通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加速關(guān)節(jié)軟骨退變，損傷軟骨組織[15-16]。芮靖琳等[17]發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重或長時(shí)間的ERS 將激活PERKCHOP 信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。KOA 的發(fā)生與軟骨細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切，而抑制軟骨細(xì)胞凋亡則能夠有效地阻止KOA 的進(jìn)展[18]。因此，對于PERK-CHOP 信號通路的調(diào)控與KOA 病程的發(fā)展密切相關(guān)。

由于西醫(yī)治療KOA 的局限性，故針對中醫(yī)藥治療KOA 的研究越來越多，中醫(yī)融合了多種治療方法，包括針刺[19]。目前，針刺已被廣泛接受為一種重要的主流補(bǔ)充和替代療法，改善膝關(guān)節(jié)功能，緩解疼痛，延緩關(guān)節(jié)退化，達(dá)到聯(lián)系臟腑、調(diào)整氣血、協(xié)調(diào)陰陽、扶正祛邪的目的，從而防止KOA 的發(fā)展[20]。膝三針是在長期臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，集歷代名醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的針對膝關(guān)節(jié)疾病的療法，由內(nèi)膝眼、犢鼻，陰陵泉、陽陵泉及血海、梁丘和鶴頂?shù)妊ㄎ唤M成[21]。其中內(nèi)膝眼、犢鼻和鶴頂是最常見的壓痛點(diǎn)，屬于局部取穴，體現(xiàn)了“腧穴所在，主治所及”的選穴原則，具有疏通氣血，祛風(fēng)散寒，通利關(guān)節(jié)，除痹止痛之功效[22-23]。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)膝三針療法能直達(dá)膝關(guān)節(jié)病灶，產(chǎn)生較快的針刺止痛作用[24]。孫奎等[25]選取膝三針的穴位進(jìn)行針刺，采用WOMAC 問卷、VAS、關(guān)節(jié)功能評分進(jìn)行評估，得出了膝三針療法能較理想的改善膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬等癥狀，提高生活能力，防止病情復(fù)發(fā)。本研究以膝三針療法為切入點(diǎn)，觀察膝三針對KOA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)及行為學(xué)的影響。

本研究采用前交叉韌帶橫斷術(shù)建立大鼠KOA 模型，HE 染色可見空白組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中軟骨細(xì)胞和分布均勻，有多個(gè)軟骨細(xì)胞，軟骨下有明顯潮紅；與空白組比較，模型組可見軟骨層變薄、軟骨表面缺損破壞，軟骨細(xì)胞較少，Mankin’s 評分明顯增加；與模型組比較，針刺組的軟骨層更厚，軟骨細(xì)胞更多，軟骨下的組織更清晰，Mankin’s 評分降低，提示針刺可以在一定程度上減少軟骨的退變，修復(fù)軟骨組織的損傷。治療后針刺組Lequesne MG 評分較模型組明顯下降，提示針刺能緩解KOA 的行為學(xué)惡化。

由大鼠模擬人類患KOA，如關(guān)節(jié)功能障礙、疼痛，并引起軟骨退化的病理改變，得出膝三針療法改善了KOA 大鼠的關(guān)節(jié)活動(dòng)度與活動(dòng)步態(tài)，有效地減輕了關(guān)節(jié)痛、功能障礙、變形等，抑制軟骨細(xì)胞退變，保護(hù)了關(guān)節(jié)軟骨，從而達(dá)到有效治療KOA 的作用。膝三針療法調(diào)控PERK-CHOP 信號通路是減少軟骨退變、修復(fù)軟骨組織損傷的可能機(jī)制，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供方向。