亞低溫輔助治療缺血性腦病分子機制研究

張華霖, 王 碩, 楊 華, 王加璐, 周大偉, 毛 琪

1.聯(lián)勤保障部隊第九六七醫(yī)院 急診科,遼寧 大連 116000;2.聯(lián)勤保障部隊第九六八醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 朝陽 122000;3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 沈陽 110000

缺血性腦病是造成人類死亡的重要疾病之一。腦缺血后的炎癥反應(yīng)在缺血性再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用,其中,相關(guān)的細(xì)胞因子主要有腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、IL-10等[1-3]。有研究報道,腦缺血再灌注可導(dǎo)致TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子表達(dá)水平明顯升高,這些高表達(dá)的炎癥因子又進(jìn)一步加重了腦損傷[4-6]。亞低溫對于急性缺血性腦病的治療具有良好的輔助及保護作用,具有療效確切、不良反應(yīng)少、便于推廣等特點[7-9],但其具體的作用機制尚未完全闡明。本研究旨在探討亞低溫輔助治療缺血性腦病的分子機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 將24只4周齡雄性SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)隨機分為陰性對照組、假手術(shù)組、實驗組和亞低溫實驗組,每組各6只。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human cerebral microvascular endothelial cells,hCMEC/D3)、人外周血單核細(xì)胞系(humanacute monocytic leukemia cell line,THP-1)均由本實驗室保存。

1.2 研究方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建 實驗組參照線栓法[10]制備SD大鼠大腦中動脈閉塞模型,2%異戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉大鼠,逐步分離直至顯露右側(cè)的頸總動脈和迷走神經(jīng),再依次分離顯露頸總動脈分叉部、頸內(nèi)動脈、頸外動脈,然后將尼龍縫合線從頸總動脈插入頸內(nèi)動脈并向前推動,阻斷至大腦中動脈,直至出現(xiàn)輕微阻力。栓塞2 h后,去除阻塞的縫合線,制備再灌注模型,通過懸尾實驗判斷造模是否成功。假手術(shù)組手術(shù)步驟同實驗組,僅未插入線栓。陰性對照組未給予任何手術(shù)干預(yù)措施。亞低溫實驗組在實驗組的基礎(chǔ)上增加亞低溫處理。

1.2.2 亞低溫處理方法 將亞低溫實驗組大鼠放入裝有冰袋的代謝籠中,前30 min內(nèi)將大鼠肛溫降至(33±1)℃,具體測試方法為將大鼠肛溫溫度計插入大鼠肛門約4 cm;鼓膜的溫度降至(31±1)℃(用數(shù)位溫度表測量),每10 min測量1次;溫度控制穩(wěn)定后,每1 h監(jiān)測肛溫與鼓膜溫度1次,持續(xù)亞低溫72 h[11]。

1.2.3 腦組織炎癥因子檢測 處死大鼠,取大鼠腦組織研磨液,離心處理后取上清,采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法對大鼠腦組織研磨液上清中的TNF-α、IL-6和IL-8表達(dá)含量進(jìn)行檢測。ELISA試劑盒購自美國Life technology公司。

1.2.4 hCMEC/D3、THP-1細(xì)胞中炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平檢測 分別設(shè)置陰性對照組、實驗組和亞低溫實驗組。兩種細(xì)胞株每種處理條件下備6組細(xì)胞。陰性對照組37℃控溫處理。實驗組在37℃溫度條件下,利用革蘭氏陰性菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)分別作用0、2、4 h。亞低溫實驗組在LPS處理的基礎(chǔ)上,采用亞低溫(33℃)分別處理0、2、4 h。Trizol法提取細(xì)胞株中總RNA,去除DNA污染后的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測IL-6、IL-8、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平,反應(yīng)體系為SYBR Green Mix(2×)10 μl、反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物(模板)1 μl、引物(total)1 μl和RNase-Free H2O 8 μl,共20 μl,反應(yīng)條件為95℃、10 min,95℃、15 s,60℃、60 s,40個循環(huán)。引物分別為F-ACCTCAGATTGTTGTTGT,R-GTCCTAACGCTCATACTT;F-AATTCATTCTCTGTGGTATC R-CCAGGAATCTTGTATTGC;F-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT,R-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG。

1.2.5 hCMEC/D3細(xì)胞凋亡率檢測 37℃條件下,利用LPS下分別刺激實驗組hCMEC/D3細(xì)胞1 h和4 h。33℃條件下,利用LPS分別刺激亞低溫實驗組hCMEC/D3細(xì)胞1 h 和4 h。陰性對照組為含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液,置于37℃條件下培養(yǎng)。刺激結(jié)束后,根據(jù)AnnenxinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡的定量檢測。

1.2.6 蛋白免疫印跡法 采用蛋白免疫印跡法檢測核因子κβ(nuclear factor κβ,NF-κβ)、凋亡級聯(lián)效應(yīng)因子天冬氨酸蛋白水解酶(aspartate proteolytic enzyme,Caspase-3)、凋亡相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域受體Fas蛋白,內(nèi)參蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GADPH)?？贵w購自Abcom公司。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較 實驗組、亞低溫實驗組處理6、24、48 h的TNF-α、IL-8、IL-6均高于陰性對照組,且實驗組高于亞低溫實驗組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較

2.2 各組hCMEC/D3、THP-1細(xì)胞中炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平 實驗組與亞低溫實驗組處理后4、8 h的hCMEC/D3細(xì)胞中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、IL-8 mRNA表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組與亞低溫實驗組處理2 h的hCMEC/D3細(xì)胞中TNF-α mRNA、IL-8 mRNA表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組與亞低溫實驗組處理2、4、8 h的THP-1細(xì)胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-8 mRNA表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2～3。

表2 各組hCMEC/D3細(xì)胞中炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平比較

表3 各組THP-1細(xì)胞中炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平比較

2.3 各組hCMEC/D3細(xì)胞凋亡率比較 亞低溫實驗組處理1、4 h的hCMEC/D3細(xì)胞凋亡率分別為7.0%、17.0%,分別低于實驗組的12.0%、28.0%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。陰性對照組處理1、4 h的hCMEC/D3細(xì)胞凋亡率分別為2.0%、3.1%,與亞低溫實驗組、實驗組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 各組相關(guān)信號通路標(biāo)志蛋白表達(dá)結(jié)果 亞低溫實驗組、實驗組NF-κB、Caspase-3、Fas蛋白表達(dá)量均明顯高于陰性對照組,且實驗組高于亞低溫實驗組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 相關(guān)信號通路標(biāo)志蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

供血中斷后,腦組織會出現(xiàn)一系列缺血相關(guān)級聯(lián)反應(yīng);供血恢復(fù)后,腦組織又會出現(xiàn)腦缺血再灌注損傷[12]。腦缺血再灌注損傷會改變腦血管的形態(tài)及功能,進(jìn)而影響大腦的物質(zhì)交換能力,造成血氧供應(yīng)下降,最終損傷腦細(xì)胞[13],引起一系列癥狀或體征,通常表現(xiàn)為肢體無力、偏癱、感覺及語言障礙、共濟失調(diào)等[14]。缺血性腦病的發(fā)病原因和機制相對復(fù)雜。目前,臨床對腦缺血再灌注損傷發(fā)病機制的研究主要集中在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸、線粒體功能障礙等,其中腦缺血后的炎癥反應(yīng)在缺血性再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用[1]。再灌注后,血流復(fù)灌不僅給細(xì)胞帶來營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,也使炎癥級聯(lián)反應(yīng)加重,相關(guān)的細(xì)胞因子主要有TNF-α、IL-8、IL-6、IL-10等[2-3]。

本研究發(fā)現(xiàn),亞低溫處理可明顯降低缺血再灌注后大鼠腦組織內(nèi)部分相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平,對腦組織損傷具有一定的緩解作用,與既往研究[15]結(jié)果一致。TNF-α由被激活的巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等分泌。在腦缺血早期,TNF-α分泌及合成增加是腦梗死形成的主要原因[2]。TNF-α的大量表達(dá)會促進(jìn)腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng),加重腦損傷[4]。作為趨化因子,TNF-α激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的IL-6。而IL-6主要參與機體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),協(xié)同IL-8、IL-10等細(xì)胞因子促進(jìn)B/T細(xì)胞活化,誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。IL-6的過量表達(dá)會加劇神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[3]。機體內(nèi)IL-6的表達(dá)水平是判斷缺血再灌注損傷程度的一個重要參考指標(biāo)[5]。有研究報道,腦缺血再灌注可導(dǎo)致TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子表達(dá)量明顯升高,這些高表達(dá)的炎癥因子又進(jìn)一步加重了腦損傷[6]。

本研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注后,NF-κβ的表達(dá)均明顯增加;亞低溫處理后,大鼠腦組織中的NF-κβ的表達(dá)量明顯降低,提示亞低溫處理可明顯降低NF-κβ的表達(dá),從而發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。NF-κβ是一組存在于細(xì)胞和病毒中,調(diào)控許多基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。腦缺血再灌注時,NF-κβ的激活是造成炎癥介質(zhì)釋放的關(guān)鍵因素,NF-κβ與諸多細(xì)胞因子間的復(fù)雜相互作用會進(jìn)一步增強炎癥反應(yīng)[16]。有研究報道,使用對NF-κβ表達(dá)具有抑制作用的藥物及治療手段,可明顯減輕腦缺血再灌注損傷,發(fā)揮保護腦功能的作用[17]。

Caspase-3是引起凋亡級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因子。正常情況下,Caspase-3以酶原形式存在于細(xì)胞中,被激活后形成二聚體形式,并進(jìn)一步切割不同的底物,級聯(lián)反應(yīng)逐步擴大,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有研究報道,腦缺血時,Caspase-3參與的級聯(lián)反應(yīng)和多種細(xì)胞內(nèi)容物的水解是缺血性細(xì)胞凋亡的重要原因[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn),亞低溫治療通過抑制Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)影響細(xì)胞凋亡水平,進(jìn)而在腦缺血再灌注模型中保護腦細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血性再灌注后,腦組織中的Caspase-3表達(dá)量較陰性對照組明顯增多,而經(jīng)過亞低溫處理后,Caspase-3的表達(dá)量明顯降低。這提示,亞低溫處理減輕了大鼠腦缺血性再灌注損傷,可能與其抑制了Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

Fas是一種與凋亡密切相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域受體,可與細(xì)胞外的配體Fas-L、TNF-α、TRAIL結(jié)合活化,從而增強Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并且可使胞內(nèi)的Caspase-8前體發(fā)生催化激活,進(jìn)一步激活 Caspase-3等相關(guān)蛋白。有研究報道,腦缺血損傷大鼠腦組織中Fas的表達(dá)增加,而未表達(dá)Fas的突變大鼠腦缺血后損傷較小[20]。本研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注大鼠腦組織中Fas蛋白的表達(dá)量明顯高于陰性對照組,亞低溫處理后,Fas蛋白的表達(dá)量明顯減少,推測Fas參與了亞低溫降低腦缺血再灌注損傷的保護機制。

目前,亞低溫治療已經(jīng)在腦缺血、重型顱腦損傷、脊髓損傷、難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)等疾病中被應(yīng)用。亞低溫治療在缺血再灌注時間窗內(nèi)通過多種作用機制同時激活多條通路,發(fā)揮對神經(jīng)血管單元的保護作用,進(jìn)而產(chǎn)生有效的神經(jīng)保護作用[7]。動物研究發(fā)現(xiàn),亞低溫能明顯抑制炎癥細(xì)胞在缺血區(qū)血管內(nèi)的聚集和粘附,以及隨后在缺血區(qū)腦實質(zhì)內(nèi)的浸潤,從而阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng),起到腦保護作用[21];低體溫抑制了Caspase激活,刺激了Bcl-2家族中選擇性抗凋亡蛋白發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用,延長了神經(jīng)元的存活時間[22]。

綜上所述,亞低溫處理可顯著降低NF-κB、Caspase-3的表達(dá),同時減少與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的Fas蛋白的表達(dá),在腦組織缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮保護作用。本研究存在局限性,由于檢測水平的限制,pNF-kB、cleaved-Caspase-3等的表達(dá)情況未能檢測,相關(guān)機制仍需進(jìn)一步驗證。