miR-145-5p靶向FGF5對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響

賈燕燕,張小林,潘 燕,趙 迪

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)是具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的急性腦血管疾病[1-2],其中缺血性腦卒中的發(fā)病率占所有腦卒中的87%,臨床通常采用及時(shí)溶栓、介入等方式恢復(fù)缺血區(qū)域的血流再灌注,但血流再灌注可能引發(fā)缺血性再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/R)。神經(jīng)元細(xì)胞是對(duì)缺血缺氧最敏感的細(xì)胞,I/R對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷非常大。研究表明,缺血性腦卒中的病理生理機(jī)制包括興奮神經(jīng)毒性神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細(xì)胞內(nèi)Ca2+積聚、自由基損傷、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥及脂質(zhì)分解等[3],但I(xiàn)/R的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚,因此,進(jìn)一步研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制以尋找潛在的治療靶點(diǎn),從而提高缺血性腦卒中療效,降低病人死亡率和致殘率。miRNA是真核生物中具有調(diào)控功能的短鏈非編碼RNA[4],包含21～23個(gè)核苷酸序列[5],可與目標(biāo)基因mRNA的3′-非編碼區(qū)(3-UTR)堿基配對(duì)結(jié)合,對(duì)目標(biāo)基因發(fā)揮調(diào)控作用。近年來(lái)的研究表明,miRNA對(duì)缺血再灌注損傷具有調(diào)控作用,如miR-429的表達(dá)可緩解氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷[6],而microRNA-320可通過(guò)抑制胰島素生長(zhǎng)因子-1調(diào)控腦缺血/再灌注損傷[7];miR-145-5p受長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG14調(diào)控,參與腦梗死的發(fā)生發(fā)展[8]。最近的研究表明,缺血時(shí)miR-145-5p表達(dá)水平的改變可影響神經(jīng)元的活性[9]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5(FGF5)是小鼠擬胚體外胚層標(biāo)志物,在胚胎發(fā)育和神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞為研究對(duì)象,構(gòu)建OGD/R模型,研究miR-145-5p與FGF5的靶向關(guān)系及其對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,為腦缺血再灌注提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);miR-145-5p inhibitor由廣州銳博生物有限公司合成;小干擾RNA(siRNA)靶向FGF5購(gòu)自上海Genechem公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與OGD/R模型建立

細(xì)胞培養(yǎng):采用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HT22細(xì)胞,培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。OGD/R模型建立:HT22細(xì)胞置于無(wú)糖平衡鹽溶液中,在三氣缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2)中培養(yǎng)4 h后,更換為含4.5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基,常規(guī)復(fù)氧培養(yǎng)(95%空氣、5%CO2)12、24 h制備OGD/R模型,對(duì)照組不進(jìn)行OGD/R處理,常規(guī)條件下培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

將HT22細(xì)胞(密度為2×105個(gè)/mL)接種于六孔板,按上述OGD/R模型建立方法處理HT22細(xì)胞6、12、24 h,收集細(xì)胞并離心,用預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌兩次,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。將5 μL的V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和10 μL的碘化丙啶(PI)加入100 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞懸液中混勻,室溫避光孵育5 min,最后加入400 μL的1×Binding Buffer混勻,在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè),并采用BD FAC-Suite軟件作圖。

1.4 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)

復(fù)氧24 h后收集各組細(xì)胞,加入RIPA蛋白裂解液冰上裂解30 min,在低溫冷凍離心機(jī)上以12 500 r/min離心10 min,取上清,采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白總濃度。取50 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),Tris 緩沖鹽溶液(TBS)洗膜10 min,5%牛血清白蛋白封閉2 h,加一抗4 ℃孵育過(guò)夜,次日加入相應(yīng)二抗孵育1～2 h,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑(ECL)顯色,采用Image J2x圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。

1.5 氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)

分別采用MDA、SOD、ROS及LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞MDA、SOD、ROS及LDH含量。

1.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系

采用Targetscan 和MiRDB生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-145-5p和FGF5的結(jié)合位點(diǎn),合成攜帶miR-145-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT)FGF5 3′-UTR,并將其克隆至pMIR-control熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中,293T細(xì)胞接種到95孔板中,使用Lipofectamine3000將pcDNA3.0-FGF5 WT和突變型(MUT)質(zhì)粒分別與miR-145-5p mimic共轉(zhuǎn)染,48 h后,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將siRNA靶向FGF5和對(duì)照siRNA分別插入pcDNA3.0質(zhì)粒,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT22細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL,接種于24孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,采用Lipofectamine 3000將上述pcDNA3.0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HT22細(xì)胞。

1.8 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以cDNA為模板采用SYBR Gene RealtimePCRMaster Mix進(jìn)行RT-PCR,使用Fast Real-time PCR 7300系統(tǒng)分析miR-145-5p的mRNA水平,反應(yīng)均以U6為內(nèi)參計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量,采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。詳見(jiàn)表1。

表1 基因名稱及引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 OGD/R處理對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪后復(fù)氧,細(xì)胞ROS、MDA及細(xì)胞上清LDH含量隨復(fù)氧時(shí)間的增加而增加,而SOD活性則隨復(fù)氧時(shí)間的增加而降低,OGD/R 6、12、24 h時(shí)ROS、MDA、LDH、SOD水平與0 h比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 OGD/R處理對(duì)神經(jīng)細(xì)胞LDH、SOD水平的影響

圖2 OGD/R處理對(duì)神經(jīng)細(xì)胞ROS、MDA水平的影響

2.2 OGD/R處理對(duì)miR-145-5p表達(dá)的影響

神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪后復(fù)氧不同時(shí)間,miR-145-5p表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.01),并且隨著復(fù)氧時(shí)間的增加,miR-145-5p表達(dá)量增加,提示OGD/R能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中miR-145-5p的表達(dá),詳見(jiàn)圖3。神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic后氧糖剝奪,miR-145-5p表達(dá)水平明顯高于OGD/R 24 h;而miR-145-5p inhibitor組miR-145-5p表達(dá)水平明顯低于OGD/R 24 h組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),詳見(jiàn)圖4。提示miR-145-5p的高表達(dá)與I/R損傷相關(guān)。

圖3 神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)OGD/R不同時(shí)間miR-145-5p表達(dá)比較

圖4 神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic后氧糖剝奪對(duì)miR-145-5p表達(dá)的影響

2.3 OGD/R處理對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與0 h比較,OGD/R處理6、12、24 h神經(jīng)元凋亡細(xì)胞及凋亡率均增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT22神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況

圖6 OGD/R處理對(duì)HT22神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 miR-145-5p與FGF5的靶向關(guān)系

miR-145-5p在miRTar base、Target scan、Target miner及miRDB在線軟件中分別存在15 064、890、1 305、495個(gè)潛在靶基因,經(jīng)過(guò)繪制Venn圖并取其交集共有100個(gè)潛在的靶基因,FGF5為其中之一。詳見(jiàn)圖7。

圖7 Venn圖

采用Targetscan 驗(yàn)證miR-145-5p與FGF5的靶向關(guān)系,結(jié)果顯示,miR-145-5p與FGF5的3′-UTR有互補(bǔ)序列。熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,WT FGF5 3′-UTR與miR-145-5p mimic共轉(zhuǎn)染后,熒光素酶的活性明顯降低;MUT FGF5 3′-UTR與miR-145-5p mimic共轉(zhuǎn)染后,熒光素酶的活性變化不明顯。與OGD/R比較,miR-145-5p inhibitor明顯上調(diào)FGF5表達(dá),FGF5 siRNA明顯下調(diào)FGF5表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)圖8、圖9。

圖8 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FGF5與miR-145-5p的靶向關(guān)系

圖9 miR-145-5p靶向負(fù)向調(diào)控FGF5表達(dá)

2.5 miR-145-5p inhibitor 抑制OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡

與OGD/R組比較,OGD/R+miR-145-5p inhibitor組HT22細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01),OGD/R+FGF5 siRNA組HT22細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)。OGD/R+miR-145-5p inhibitor+FGF5 siRNA組與OGD/R+FGF5 siRNA組比較,HT22細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖10、圖11。

圖10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT22神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況

圖11 miR-145-5p inhibitor 抑制OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡

2.6 miR-145-5p inhibitor 減輕OGD/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷

細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷檢測(cè)結(jié)果顯示,與OGD/R組比較,OGD/R+miR-145-5p inhibitor組細(xì)胞MDA、ROS和LDH含量均明顯降低,SOD活性明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);OGD/R+FGF5 siRNA組細(xì)胞MDA、ROS和LDH含量均明顯增加,SOD活性明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。OGD/R+miR-145-5p inhibitor+FGF5 siRNA組與OGD/R+FGF5 siRNA組比較,細(xì)胞MDA、ROS和LDH含量均明顯降低,SOD活性明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)圖12、圖13。

圖12 miR-145-5p inhibitor對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的LDH、SOD水平的影響

圖13 miR-145-5p inhibitor對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的ROS、MDA水平的影響

3 討 論

I/R是一個(gè)復(fù)雜的生理病理過(guò)程,涉及多種發(fā)病機(jī)制,如神經(jīng)元的死亡、膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥反應(yīng)等。miRNA在大腦功能中扮演重要角色,包括神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育、導(dǎo)致突觸可塑性發(fā)生改變的細(xì)胞反應(yīng)等。研究表明,miR-145-5p在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、心肌細(xì)胞存活及H2O2所致神經(jīng)元細(xì)胞損傷等過(guò)程中均明顯上調(diào)[10-11],小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R處理 2 h后和大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)12 h后大腦皮質(zhì)中miR-145-5p也明顯上調(diào)。以上研究表明,miR-145-5p可能在OGD/R過(guò)程中損傷神經(jīng)元細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)HT22細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪復(fù)氧不同時(shí)間后,細(xì)胞ROS、MDA、LDH含量明顯升高,SOD的活性明顯降低,提示造模成功。I/R發(fā)生后機(jī)體氧化和抗氧化能力失衡,發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)并產(chǎn)生大量氧自由基,清除自由基、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)是治療I/R的重要方式之一。本研究結(jié)果顯示,在I/R細(xì)胞模型中,miR-145-5p表達(dá)增加,抑制miR-145-5p表達(dá)后,細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)得到緩解。研究表明,氧自由基可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子,從而刺激腦血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá),引起再灌注的大量炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死[12]。ROS是高含氧活性小分子,有效清除過(guò)剩的ROS可改善缺血性腦卒中轉(zhuǎn)歸。SOD是清除氧自由基的蛋白酶,可通過(guò)磷酸化蛋白激酶B(AKT)降低缺血腦損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[13]。本研究中,神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪后復(fù)氧,細(xì)胞ROS、MDA及細(xì)胞上清LDH含量隨復(fù)氧時(shí)間的增加而增加,而SOD活性則隨復(fù)氧時(shí)間的增加而降低。

成熟miRNA通過(guò)與靶mRNA的3′-UTR的互補(bǔ)結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá),此種調(diào)節(jié)作用將導(dǎo)致靶mRNA降解或蛋白質(zhì)翻譯抑制,從而使細(xì)胞功能發(fā)生變化[14]。本研究中I/R損傷細(xì)胞miR-145-5p表達(dá)升高,并且FGF5受到抑制,通過(guò)生物信息學(xué)分析及熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者之間具有較強(qiáng)的靶向關(guān)系,HT22細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497-5p inhibitor后OGD/R,細(xì)胞中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡明顯減輕,而FGF5 siRNA轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞后,細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡增加,提示miR-145-5p靶向FGF5,調(diào)節(jié)I/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。

FGF5屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGFs)成員,在小鼠胚胎和成年小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及原腸胚、肌肉、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形成中被檢測(cè)到[15]。有研究表明,成年小鼠FGF5的信息水平在海馬、脊髓和大腦皮層比在其他神經(jīng)節(jié)、小腦、中腦和后腦略高,可視為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)持續(xù)釋放的營(yíng)養(yǎng)因子[16]。FGF5具有多種生物學(xué)功能,并發(fā)揮重要作用。Walter等[17]研究表明,FGF5及其主要受體FGFR1介導(dǎo)的信號(hào)可作為人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療靶點(diǎn)。Fang等[18]研究結(jié)果表明,miR-188-5p通過(guò)靶向FGF5基因抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,在肝癌中起抑癌作用。此外,FGF5在高血壓疾病中也發(fā)揮重要作用,FGF5基因內(nèi)部或附近區(qū)域是原發(fā)性高血壓的易感區(qū)域,原發(fā)性高血壓外周血中FGF5基因T/C突變與舒張壓和收縮壓呈正相關(guān),提示FGF5 mRNA和蛋白質(zhì)水平異常表達(dá)可能與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示,FGF5在OGD/R誘導(dǎo)的HT122中表達(dá)減少,并通過(guò)Targetscan證明FGF5是miR-145-5p的下游靶點(diǎn),此外,miR-145-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞后,FGF5蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷均得以改善。而FGF5 siRNA轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞后,FGF5蛋白表達(dá)減少,氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)。以上結(jié)果提示miR-145-5p通過(guò)抑制FGF5表達(dá)從而增加OGD/R環(huán)境下HT22細(xì)胞的凋亡和損傷。

綜上所述,miR-145-5p可通過(guò)靶向結(jié)合FGF5誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷,miR-145-5p可能是I/R的潛在治療靶點(diǎn)。但本研究?jī)H通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)探討相關(guān)機(jī)制,關(guān)于miR-145-5p對(duì)I/R的作用和影響機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。