基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃連有效成分治療糖尿病性心肌病的作用機制

董麗妍,方紅城,陳 潔,冼紹祥,李志芳,葉夢思,林劍華,黃小靖

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的并發(fā)癥之一,以左心室擴張和肥大、心臟功能下降為特點[1],主要發(fā)病機制為代謝紊亂、微血管病變、心肌細胞凋亡、心肌纖維化等[2],最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生,危及生命?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)診治糖尿病性心肌病方面取得巨大進步,如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)等藥物可用于逆轉(zhuǎn)糖尿病性心肌病心室重構(gòu);注射用胰高血糖素樣肽1類似物(GLP-1)可用于抑制心肌細胞凋亡,減少心肌受損[3-4]。由于西藥具有副作用明顯、不足以延緩或控制疾病發(fā)展等特點,西藥診治糖尿病性心肌病仍存在局限性。中醫(yī)藥具有多靶點、毒副作用少等諸多優(yōu)勢[5],在診治糖尿病性心肌病方面可以彌補西藥的不足,近年來備受關(guān)注。

古文獻中未記載糖尿病性心肌病的病名,根據(jù)其癥狀可歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“消癉”“胸痹”等范疇。中醫(yī)學(xué)認為,糖尿病性心肌病的發(fā)生多與先天稟賦不足,后天飲食不節(jié)、過勞縱欲、情志不暢等因素相關(guān),陰虛燥熱是其發(fā)病病機[6],中藥黃連具有清熱燥濕之效,故可用于治療糖尿病性心肌病。古代醫(yī)家多用黃連治療消渴及其并發(fā)癥。《名醫(yī)別錄》有云:黃連能夠“止消渴”[7]。黃連排在《太平圣惠方》治療消渴病常用藥中的前3位。《普濟方》中記載治療消渴的黃連復(fù)方13個[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)亦表明,黃連具有降糖、改善胰島素抵抗、抗炎、調(diào)脂、抗氧化等作用,用于治療糖尿病性心肌病療效顯著[9-12],然而其作用機制仍有待進一步深入研究,故基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃連治療糖尿病性心肌病的作用機制具有重要意義[13]。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

主要數(shù)據(jù)庫包括:中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/),GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/),STRING數(shù)據(jù)庫 (https://string-db.org/cgi/input.pl),Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),G:profile數(shù)據(jù)庫(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)和Cytoscape 3.7.1軟件。

1.2 方法

1.2.1 篩選中藥黃連化學(xué)成分和靶點

運用TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫收集得到黃連的化學(xué)成分,根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug like,DL)≥0.18[14]選取中藥黃連主要活性成分。

1.2.2 疾病靶點的獲取

以“diabetic cardiomyopathy”為關(guān)鍵詞,運用OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫進行檢索,在GeneCards數(shù)據(jù)庫中選擇relevance score≥10的靶點,與OMIM數(shù)據(jù)庫得到的靶點取交集,得到與糖尿病性心肌病相關(guān)的疾病靶點。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的黃連成分靶點與糖尿病性心肌病靶點交集,通過Cytoscape 3.7.1軟件制作“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 核心靶點篩選

運用STRING數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入交集靶點,選擇“homo sapiens”物種,制作靶點的蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 富集分析

根據(jù)DAVID數(shù)據(jù)庫行基因本體(gene ontology,GO)生物過程富集分析結(jié)果繪制柱狀圖,根據(jù)京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析結(jié)果繪制氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 黃連素成分收集及篩選

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺,根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18,檢索并篩選中藥黃連有效化學(xué)活性成分,共搜集到14個黃連符合的活性成分;將其通過PubChem數(shù)據(jù)庫進行結(jié)果辨別,最后得到黃連有效成分10個(見表1)。通過UniProt數(shù)據(jù)庫進行GeneSymbol轉(zhuǎn)換,得到對應(yīng)靶標88個。

表1 中藥黃連有效活性成分

2.2 “疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

以“diabetic cardiomyopathy”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索有關(guān)糖尿病性心肌病的基因,按照relevance score≥10,與在OMIM數(shù)據(jù)庫獲取的靶點取交集,提取靶點856個,將相關(guān)靶點信息錄入UniProt數(shù)據(jù)庫中檢索,選擇人源靶點,最終獲得疾病靶點786個。運用Venny 2.1在線數(shù)據(jù)庫取交集,繪制88個黃連生物堿化合物靶點與786個糖尿病性心肌病相關(guān)疾病靶點基因韋恩圖,得到70個交集靶點基因,可能是黃連治療糖尿病性心肌病的關(guān)鍵靶點(見圖1)。通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建糖尿病性心肌病與黃連相關(guān)“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。網(wǎng)絡(luò)中共有82個節(jié)點(其中疾病靶點1個,藥物靶點1個,藥物化合物節(jié)點10個,靶基因節(jié)點70個)和186條連接邊。其中紅色六邊形代表疾病(糖尿病性心肌病),黃色圓形代表中藥(黃連),綠色箭頭代表黃連有效成分,藍色三角形代表疾病與藥物有效成分相關(guān)的作用靶點。其中連接度越大,則節(jié)點形狀越大,提示節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的位置越重要。對“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析,連接度排在前3位的活性成分為槲皮素、小檗堿及巴馬汀,提示該3種活性成分是整個網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵,可能是黃連治療糖尿病性心肌病的主要化合物。

圖1 糖尿病性心肌病-黃連相關(guān)靶點基因韋恩圖

圖2 糖尿病性心肌病-黃連藥物活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 黃連有效成分作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點聚類

已有研究表明,網(wǎng)絡(luò)中蛋白的度值(Degree)越大,其重要性越大。對黃連及糖尿病性心肌病的交集靶點網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析,選取度值排名前20位的靶點(見表2)。黃連有效成分作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3所示。通過“MCODE”插件行聚類分析PPI網(wǎng)絡(luò),最終產(chǎn)生4個子網(wǎng)絡(luò)。子網(wǎng)絡(luò)1得分為4.571分,有5個節(jié)點、9條邊,包含的節(jié)點有原癌基因(MYC)、B細胞κ輕肽基因增強子核因子抑制因子α(NFKBIA)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARA)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1和一氧化氮合酶2(NOS2);子網(wǎng)絡(luò)2得分為3.000分,有4個節(jié)點、6條邊,包含節(jié)點趨化因子配體2(CCL2)、細胞間黏附分子1(ICAM1)、白細胞介素8(CXCL8/IL-8)和白細胞介素10(IL-10);子網(wǎng)絡(luò)3得分為3.000分,有8個節(jié)點、10條邊,包含節(jié)點基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-2、胰島素樣生長因子2(IGF2)、血管內(nèi)皮生長因子 A (VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)、牛蛋白激酶Cβ1(PRKCB)、人蛋白激酶(PRKCA)和嗜中性粒細胞胞漿因子1(NCF1);子網(wǎng)絡(luò)4得分為3.000分,有3個節(jié)點、3條邊,包含節(jié)點血紅素氧合酶1(HMOX1)、核因子紅細胞2相關(guān)因子2(NFE2L2)和FOS。詳見圖4。

圖3 黃連有效成分作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 聚類分析子網(wǎng)絡(luò)

表2 黃連對糖尿病性心肌病作用靶點的拓撲學(xué)分析(連接度排名前20位)

2.4 靶點生物學(xué)功能分析及GO功能富集分析

對糖尿病性心肌病-黃連有效成分交集的70個靶點進行GO分析,GO分析包括分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)及細胞組分(cellular component,CC)3個部分。將70個靶點導(dǎo)入g:Profile數(shù)據(jù)庫進行GO分析,在MF、BP、CC中分別選擇P<0.05且P最小的前10條路徑(P值越小,則通路越關(guān)鍵),運用Excel制作條形圖(見圖5)。其中,MF富集的前10條通路包括:酶結(jié)合(enzyme binding)、信號受體結(jié)合(signaling receptor binding)、相同的蛋白結(jié)合(identical protein binding)、細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、細胞因子活性(cytokine activity)、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)。BP富集的前10條通路包括:細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)(cellular response to chemical stimulus)、化學(xué)反應(yīng)(response to chemical)、對含氧化合物的反應(yīng)(response to oxygen-containing compound)、對有機物質(zhì)的反應(yīng)(response to organic substance)、細胞對有機物質(zhì)的反應(yīng)(cellular response to organic substance)、細胞對含氧化合物的反應(yīng)(cellular response to oxygen-containing compound)、細胞表面受體信號通路(cell surface receptor signaling pathway)、細胞過程的正調(diào)控(positive regulation of cellular process)、對刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)(regulation of response to stimulus)、生物過程的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of biological process)。CC富集的前10條通路包括:膜小凹(caveola)、細胞外間隙(extracellular space)、細胞器內(nèi)腔(organelle lumen)、微管確定膜性細胞腔(membrane-enclosed lumen)、胞膜外區(qū)(extracellular region)、質(zhì)膜筏(plasma membrane raft)、膜筏(membrane raft)、膜質(zhì)微區(qū)(membrane microdomain)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物(plasma membrane protein complex)、質(zhì)膜的內(nèi)在成分(intrinsic component of plasma membrane)。

圖5 黃連靶向糖尿病性心肌病網(wǎng)絡(luò)靶點的GO分析

選取經(jīng)R語言運行后得到的前20個功能的GO功能富集分析結(jié)果(共99個),繪制柱狀圖見圖6。其中,富集最多的通路包含13個靶基因,包括:細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、信號受體配體活性(signaling receptor ligand activity)等。

圖6 黃連-糖尿病性心肌病作用靶點GO富集柱狀圖

2.5 靶點通路分析

通過KEGG通路富集分析黃連治療糖尿病性心肌病的可能機制及途徑。KEGG分析獲得153條通路,其中128條有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。P-adjust數(shù)值越小,提示顯著性越大,由低到高選取排名前20名制作氣泡圖(見圖7)。圖中排序越靠前,表明其通路作用影響越大。KEGG通路富集分析主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的糖化終末產(chǎn)物及其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切力及動脈硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信號通路(PI3K-AKT signaling pathway)、蛋白聚糖在癌癥(proteoglycans in cancer)、甲型流感(influenza A)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人類巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路(TNF signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、白細胞介素17(IL-17)信號通路(IL-17 signaling pathway)、美洲錐蟲病(Chagas disease)、丙型肝炎(hepatitis C)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、膀胱癌(bladder cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、利什曼病(Leishmaniasis)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、瘧疾(malaria)、非洲錐蟲病(African trypanosomiasis)。

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

研究表明,糖尿病性心肌病的發(fā)病機制與代謝異常、線粒體功能障礙、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活、氧化應(yīng)激、自噬、炎癥和心臟微血管功能障礙等相關(guān)[15]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在診治糖尿病性心肌病方面取得重要進展,然而,仍然存在副作用多、不足以延緩疾病進展等局限,中醫(yī)藥治療糖尿病性心肌病療效顯著,能彌補西藥的不足,相輔相成。中藥具有多靶點、多作用途徑,在治療糖尿病性心肌病方面療效確切,目前關(guān)于中藥單味藥或復(fù)方作用于糖尿病性心肌病的機制研究已成為熱點,具有廣闊的應(yīng)用前景[16]。

本研究主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析黃連治療糖尿病性心肌病的潛在作用機制。在活性成分研究中,共篩選出黃連的有效成分10個,其中,槲皮素、小檗堿及巴馬汀位居前3位,提示該3種成分是整個網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵,可能是黃連發(fā)揮療效治療糖尿病性心肌病的主要化合物。槲皮素廣泛存在于多種中藥中,能夠抗炎、抗病毒、抗癌及治療糖尿病及其并發(fā)癥[17]。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可通過防止三磷酸腺苷(ATP)水平降低和過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1(PGC-1)、線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)表達的改變,改善氧化應(yīng)激狀態(tài),達到減少心肌纖維化、肥大的作用,能夠用于防治糖尿病性心肌病引起的心肌細胞受損[18-21]。黃連的另一個主要有效成分小檗堿又名黃連素[22],可抑制高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞增殖和心肌細胞肥大,減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)含量,提高一氧化氮(NO)水平,進而改善心臟結(jié)構(gòu)。另外,小檗堿可影響糖脂代謝途徑中關(guān)鍵酶的含量,調(diào)節(jié)PPARα、PPARγ和第四型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4)的基因和蛋白表達,增加心肌脂肪的降解與轉(zhuǎn)運及葡萄糖降解,進而降低心肌游離脂肪酸含量,減輕其對心臟的損害。巴馬汀則以抗感染作用為主[23]。

核心靶點分析中,根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)聚類分析的4個子網(wǎng)絡(luò),子網(wǎng)絡(luò)1中MYC、NFKBIA、PPARA、MAPK1和NOS2靶點主要涉及炎癥、脂質(zhì)代謝、細胞外信號調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激等;子網(wǎng)絡(luò)2中CCL2、ICAM1、CXCL8(IL-8)和IL-10主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié);子網(wǎng)絡(luò)3中MMP-1、MMP-2、IGF2、VEGFA、EGFR、PRKCB、PRKCA和NCF1主要涉及炎癥、氧化應(yīng)激、細胞分化增殖、血管內(nèi)皮增生、細胞黏附、細胞凋亡等有關(guān);子網(wǎng)絡(luò)4中HMOX1、NFE2L2和FOS與細胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化及細胞凋亡有關(guān)。結(jié)合GO富集分析結(jié)果,提示黃連可能通過細胞周期調(diào)節(jié)、細胞凋亡、改善微血管病變、調(diào)節(jié)代謝、抗炎、氧化應(yīng)激等途徑發(fā)揮治療糖尿病性心肌病的作用。

在KEGG通路富集分析方面,排除與癌癥、病毒相關(guān)的通路,黃連主要成分靶點主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的糖化終末產(chǎn)物及其受體信號通路、流體剪切力及動脈硬化、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、松弛素信號通路和PI3K-AKT信號通路。本研究結(jié)果顯示,糖尿病并發(fā)癥中的糖化終末產(chǎn)物及其受體信號通路是通路富集結(jié)果中顯著性最高的通路,AGE-RAGE能夠激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB),通過IL-6、TNF-α等炎性因子、生長因子及黏附因子等,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及細胞黏附反應(yīng),這是糖尿病性心肌病發(fā)生的主要機制之一[24]。同時,研究表明,流體剪切力及動脈粥樣硬化通路在改善胰島素抵抗、抗炎、抑制細胞凋亡等方面對糖尿病性心肌病有影響[25-26]。當(dāng)機體發(fā)生缺血缺氧時,HIF-1作為觸發(fā)各種應(yīng)激蛋白表達的主要轉(zhuǎn)錄因子[27],其減少可導(dǎo)致心肌肥厚[28]。HIF-1在心肌中高表達,其靶基因VEGF等可能參與保護心肌,從而達到減輕糖尿病小鼠心肌重構(gòu)的目的[29-30]。TNF信號通路具有多效生物學(xué)效應(yīng),研究表明,黃連素能阻止TNF-α誘導(dǎo)血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)mRNA增高,減弱細胞黏附作用[31]。同時,黃連素可通過增加脂聯(lián)素蛋白分泌,減少瘦素、TNF-α和IL-6等水平來改善胰島素抵抗[32],發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝的作用。IL-17是糖尿病病人發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要炎性因子之一,能夠啟動p38MAPK、P13K/AKT/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)等一系列炎性因子通路,發(fā)生炎癥反應(yīng)[33]。近年來研究發(fā)現(xiàn),松弛素信號通路除了與分娩有關(guān),還與減少氧化應(yīng)激損傷、保護高糖誘發(fā)心肌肥厚及細胞凋亡相關(guān)[34]。PI3K-AKT信號通路具有調(diào)節(jié)葡萄糖攝取、糖原合成與糖原合成激酶失活等作用[35],是胰島素發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路,參與細胞凋亡、血管生成、端粒酶活性及抗炎等過程[36],對糖尿病性心肌病的診治具有重要意義。

綜上所述,黃連治療糖尿病性心肌病的可能機制:黃連中的槲皮素、小檗堿及巴馬汀等主要活性成分作用于糖尿病并發(fā)癥中的糖化終末產(chǎn)物及其受體信號通路、流體剪切力及動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、松弛素信號通路及PI3K-AKT信號通路等,以MYC、NFKBIA、PPARA、MAPK1、NOS2、CCL2、ICAM1、CXCL和IL-10、MMP-1、MMP-2、IGF2、VEGFA、EGFR、PRKCB、PRKCA和NCF1、HMOX1、NFE2L2和FOS等為關(guān)鍵靶點,通過調(diào)節(jié)代謝、改善微血管病變、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡等作用機制來治療糖尿病性心肌病。由此可知,黃連治療糖尿病性心肌病是多成分、多靶點、多通路相互作用的結(jié)果。接下來,本團隊將通過基礎(chǔ)研究、臨床研究等途徑進一步驗證。