MCC950 通過抑制NLRP3 炎癥小體通路引發(fā)的焦亡緩解原發(fā)性痛經(jīng)*

汪少華 潘思安 薛 曉 袁菡鈺 李 娟 岳增輝 劉 余

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208）

原發(fā)性痛經(jīng) (primary dysmenorrhoea, PDM) 被定義為沒有盆腔器質(zhì)性病變的月經(jīng)期疼痛性疾病，通常以痙攣性恥骨上疼痛為特征[1,2]。PDM 影響50%～90%年輕女性的生活，包括人際關(guān)系、學(xué)習(xí)和工作，而且引發(fā)焦慮[3,4]。目前治療PDM 的一線藥物為非甾體抗炎藥 (non steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)，存在著惡心、嘔吐、食欲減退甚至消化道潰瘍等不良反應(yīng)[5,6]。目前，沒有足夠的證據(jù)說明單獨(dú)使用NSAIDs 是最有效且安全的[7]。因此，尋找安全有效治療或緩解PDM的藥物是有必要的。

核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB) 蛋白復(fù)合物家族在B 細(xì)胞成熟過程中被誘導(dǎo)，并作為二聚體發(fā)揮作用[8]。NF-κB 家族包括五種蛋白質(zhì)二聚體，存在于典型的p50/p65 型中[9]。p50/p65 二聚體可在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中觸發(fā)NF-κB 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用，從而在炎癥的病理生理過程中發(fā)揮作用[10,11]。在對(duì)外源性信號(hào)的反應(yīng)中，IκB 的翻譯后修飾導(dǎo)致IκB 磷酸化，導(dǎo)致NF-κB 二聚體進(jìn)入細(xì)胞核并激活靶基因，從而進(jìn)一步加劇炎癥[12]?？傊?，NF-κB 是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子。

含核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3, NLRP3) 炎癥小體是由NLRP3、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)和含有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 (apoptosis-associated specklike protein containing a caspase recruitment domain, ASC) 組裝而成的細(xì)胞質(zhì)多蛋白復(fù)合體[13,14]。PDM 中出現(xiàn)NLRP3 蛋白寡聚化，NLRP3 選擇性抑制劑MCC950 通過NF-κB/COX-2/PG 通路抑制PDM 大鼠子宮組織NLRP3 炎癥小體激活并減輕炎癥[15]。NLRP3 的寡聚化驅(qū)動(dòng)caspase-1 依賴性的蛋白裂解以及IL-1β 和IL-18 的成熟和釋放[16,17]。激活的caspase-1 將gasdermin D(GSDMD) 裂 解 成GSDMD-N 末 端 (GSDMD-N)，GSDMD-N 進(jìn)入質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，最后細(xì)胞焦亡[18]。因此，NLRP3 炎癥小體作為炎癥反應(yīng)的核心，參與了PDM 的發(fā)生發(fā)展，可能是治療或緩解PDM 的新靶點(diǎn)。

PDM 中發(fā)生了NLRP3 炎性小體的激活，但PDM大鼠子宮組織損傷的機(jī)制尚不完全清楚。因此，為進(jìn)一步研究PDM 大鼠子宮損傷的機(jī)制，本研究使用苯甲酸雌二醇和催產(chǎn)素構(gòu)建PDM 大鼠模型，探討MCC950 治療或緩解PDM 的機(jī)制。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康未孕雌性SPF 級(jí)Sprague-Dawleg (SD)大鼠30 只，6～8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。大鼠被飼養(yǎng)在20℃～25℃的適宜溫度下，自由飲水和進(jìn)食。1 周后采用隨機(jī)數(shù)表法將30 只大鼠隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組、模型組（PDM組）和MCC950 組，每組10 只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（倫理批號(hào)LL2021040703），符合中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物-動(dòng)物福利倫理審查指南》(GB/T 35892-2018)。

2.材料和方法

（1）主要藥品和儀器

苯甲酸雌二醇 [生產(chǎn)批號(hào)：(2020) 11025，寧波第二激素廠，中國(guó)]；催產(chǎn)素（貨號(hào)：P1029，批次：07；分子式：C45H70N12O14S2；分子量：1067.2；純度：98.52%）和MCC950（貨號(hào)：S7809，批次：07；分子式：C20H23N2O5S.Na；分子量：426.46；純度：99.40%）均購自美國(guó)Selleck；大鼠PGE2 ELISA 試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20211111-J2944）和大鼠PGF2α ELISA 試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20211111-J3106）均購自湖南艾方生物科技有限公司；NF-κB p65 抗體（貨號(hào)：GB12142），phospho-NF-κB p65 抗體（貨號(hào)：GB11142-1），HRP-山羊抗鼠二抗（貨號(hào)：GB-23301）和HRP-山羊抗兔二抗（貨號(hào)：GB23303）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；NLRP3 抗體（貨號(hào)：ab263899），GSDMD 抗體（貨號(hào)：ab-219800）和N-terminal GSDMD 抗體（貨號(hào)：ab215-203）均購自英國(guó)abcam；caspase-1 抗體（貨號(hào)：#2225），cleaved caspase-1 抗體（貨號(hào)：#89332）和IL-1β 抗體（貨號(hào)：#12242）均購自美國(guó)Cell Signaling Technology；ASC 抗體（貨號(hào)：bs-6741R）購自美國(guó)Bioss Antibodies；IL-18 抗體（貨號(hào)：10663-1-AP）購自美國(guó)Proteintech；β-actin（貨號(hào)：AF5001）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

酶標(biāo)儀（型號(hào)：RT-6100，Rayto，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：BA410E，Motic，中國(guó)），切片機(jī)（型號(hào)：UC7，Leica，德國(guó)），高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Sorvall ST 16R，Thermo Fisher，美國(guó)），電泳槽（Bio-rad，美國(guó)），化學(xué)發(fā)光儀（型號(hào)：6300，CLINX，中國(guó)），灰度分析軟件（alphaEaseFC，Alpha Innotech，美國(guó)）。

（2）PDM 大鼠模型的建立

采用苯甲酸雌二醇和催產(chǎn)素聯(lián)合給藥建立大鼠PDM 模型。雌激素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成和增加催產(chǎn)素受體 (oxytocin receptor, OTR) mRNA表達(dá)來提高子宮敏感性[19,20]。催產(chǎn)素能有效誘導(dǎo)子宮收縮，引起子宮相對(duì)缺血和缺氧，導(dǎo)致疼痛[21]。對(duì)照組大鼠皮下注射0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)注射10 天，第11 天腹腔注射0.9%氯化鈉注射液。另外兩組大鼠每日早上9 時(shí)皮下注射苯甲酸雌二醇（劑量：第1 天2 mg/kg，第2～9 天0.8 mg/kg，第10 天2 mg/kg）。苯甲酸雌二醇的劑量和時(shí)間參考其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究[22]。第11 天上午9 時(shí)，PDM 組和MCC950 組每只大鼠腹腔注射2 U 催產(chǎn)素（濃度5 mg/ml，體積0.4 ml）。MCC950 組第11 天在注射苯甲酸雌二醇30 min 后腹腔注射10 mg/kg 的MCC950（濃度5 mg/ml）。

（3）大鼠扭體反應(yīng)的測(cè)定

大鼠扭體反應(yīng)參考Wei 等[23]的報(bào)道。記錄大鼠在注射催產(chǎn)素后30 min 內(nèi)的扭體次數(shù)和扭體潛伏期。扭體潛伏期是從注射催產(chǎn)素到第1次扭體的時(shí)間。發(fā)生扭體反應(yīng)后，使用2%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，切除子宮組織。最后，對(duì)老鼠實(shí)施安樂死。用無菌手術(shù)剪刀將約5 mm×5 mm×5 mm大小的子宮組織置于4%多聚甲醛溶液中固定。其余的組織被放置在液氮中進(jìn)行后續(xù)檢查。扭體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常運(yùn)動(dòng)、探索行為以及軀干和后肢伸展記0 分；腹部凹陷、身體傾斜記1 分；后肢伸展、后爪背屈、骨盆旋轉(zhuǎn)的身體伸展記2 分；腹肌收縮、后肢向后伸展、身體有僵直的扭轉(zhuǎn)評(píng)分記3 分。

（4）顯微鏡檢查

采用隨機(jī)數(shù)表法每組選取5 只大鼠，從每只大鼠的同側(cè)采集同一節(jié)段的子宮組織進(jìn)行顯微鏡觀察。將大鼠子宮組織在4%多聚甲醛中室溫固定24 h，脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以厚度5 μm切片。組織隨后用二甲苯和乙醇脫蠟，干燥并用蘇木精-伊紅染色。用中性樹膠封片后，光學(xué)顯微鏡觀察大鼠子宮的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。大鼠子宮病理損傷評(píng)分參考Wei 等[24]的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)顯微鏡下子宮的形態(tài)特征，無病理的子宮記為0 分；子宮內(nèi)膜變性壞死記為1 分；固有層水腫記為2 分；固有層腺體增加記為3；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)固有層評(píng)分記為4 分；子宮肌層炎癥評(píng)分記為5 分。

（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)大鼠血清PG 變化

取腹主動(dòng)脈的血液在室溫下自然凝固10～20 min，離心20 min 左右 (2000～3000 r/min)，仔細(xì)收集血液上清液。根據(jù)ELISA 試劑盒的說明進(jìn)行血清中PGE2 和PGF2α 的測(cè)定。

（6）Western blot 檢測(cè)

采用隨機(jī)數(shù)表法每組選取5 只大鼠，取大鼠同側(cè)同段子宮組織約30 mg，用勻漿器低溫研磨。加入預(yù)冷的RIPA 裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑，置于冰上30 min。4℃，12,000 r/min離心10 min，除去含有蛋白的上清，加入樣品緩沖液，在沸水浴中加熱10 min，使蛋白完全變性。采用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)電泳、PVDF 膜轉(zhuǎn)移和阻斷后，用Tris 緩沖鹽水Tween-20 (TBST) 稀釋特異性一抗。膜與以下主要抗體在4℃孵育過夜：NF-κB p65 (1:2000)，phospho-NF-κB p65 (1:3000)，NLRP3(1:1000)，caspase-1 (1:3000)，cleaved caspase-1(1:3000)，ASC (1:3000)，IL-1β (1:3000)，IL-18(1:3000)，β-actin (1:2000)，GSDMD (1:1000) 和GSDMD-N (1:1000)。然后，用TBST 沖洗膜，并與稀釋的二抗孵育60 min，ECL 法曝光。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 IBM SPSS Statistics 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)描述均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。如果數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性和方差齊性，則使用單因素方差分析；若不滿足正態(tài)性，使用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。顯著性水平α =0.05，P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MCC950 可減少PDM 大鼠的扭體次數(shù)，延長(zhǎng)扭體潛伏期

在注射催產(chǎn)素30 min 內(nèi)，對(duì)照組沒有扭體反應(yīng)。與對(duì)照組相比，PDM 組大鼠的扭體次數(shù)（P＜ 0.001，見圖1A）和評(píng)分（P＜ 0.001，見圖1B）明顯增加，說明PDM 大鼠模型構(gòu)建成功。與PDM 組相比，MCC950 組的扭體次數(shù)（P＜ 0.05，見圖1A）和評(píng)分（P＜ 0.05，見圖1B）顯著降低。由于無扭體反應(yīng)，對(duì)照組無扭體潛伏期。與PDM 組相比，MCC950組扭體潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜ 0.05，見圖1C）。

圖1 各組大鼠注射催產(chǎn)素30 min 后扭體次數(shù)、扭體評(píng)分及扭體潛伏期比較(n = 10,±SD)Fig.1 Comparison of writhing times, writhing scores and writhing incubation periods 30 min after oxytocin injection in each group (n = 10,±SD)

2.MCC950 可減輕PDM 大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞損傷，降低子宮病理損傷評(píng)分

對(duì)大鼠子宮進(jìn)行HE 染色，觀察MCC950 對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組子宮未見明顯組織學(xué)改變。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列整齊，柱狀，生理性變性少，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。PDM 組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞大量空泡化壞死，多螺旋小動(dòng)脈充血，可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。MCC950 組子宮上皮出現(xiàn)少量空泡變性壞死，無充血，有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖2A-C）。病理評(píng)分以顯微鏡評(píng)價(jià)為基礎(chǔ)，對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)分進(jìn)行累積評(píng)價(jià)。與對(duì)照組相比，PDM 組子宮組織病理學(xué)損傷評(píng)分顯著升高（P＜ 0.01，見圖2D）。與PDM 組相比，MCC950 組病理評(píng)分明顯降低（P＜ 0.05，見圖2D）。綜上所述，MCC950 對(duì)PDM 大鼠子宮損傷有保護(hù)作用。

圖2 各組大鼠子宮組織組織病理學(xué)變化及病理損傷評(píng)分比較(n = 5,±SD)Fig.2 Histopathological changes and comparison of pathological damage scores in the uterine tissue of rats in each group (n = 5,±SD)

3.MCC950 下調(diào)PDM 大鼠血清中PGF2α 含量及PGF2α/PGE2 比值

前列腺素(prostaglandin, PG)是PDM 的發(fā)病機(jī)制之一。此外一項(xiàng)人體試驗(yàn)表明，PGF2α 抑制劑對(duì)治療PDM 有效[25]。因此，PG 可以用來評(píng)價(jià)PDM動(dòng)物模型的成功與否。與對(duì)照組相比，PDM 組大鼠血清中PGF2α（P＜ 0.01，見圖3A）及PGF2α/PGE2 比值（P＜ 0.001，見圖3B）顯著升高。與PDM 組比較，MCC950 組大鼠血清中PGF2α（P＜0.05，見圖3A）及PGF2α/PGE2 比值（P＜ 0.001，見圖3B）明顯降低。

4.MCC950 抑制PDM 大鼠子宮組織NF-κB 的激活

采用Western blot 法測(cè)定大鼠子宮組織中NF-κB的含量。與對(duì)照組相比，PDM 大鼠子宮組織中NF-κB p65 和 磷 酸 化NF-κB p65 (phospho-p65) 蛋 白 的 表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.001，見圖4）。此外，與PDM 組相比，MCC950 組大鼠子宮組織NF-κB p65(P＜ 0.01)和磷酸化NF-κB p65（P＜ 0.001，見圖4）水平明顯降低。

圖4 各組大鼠子宮組織NF-κB p65 及磷酸化NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較(n = 5,±SD)Fig.4 Comparison of protein expression levels of NF-κB p65 and phosphorylated NF-κB p65 in the uterine tissue of rats in each group (n = 5,±SD)

5.MCC950 抑制NLRP3 炎癥小體蛋白的表達(dá)和下游cleaved caspase-1 的釋放

為了證實(shí)MCC950 對(duì)炎癥小體及其下游caspase的作用，通過Western blot 分析了炎癥小體蛋白和cleaved caspase-1（見圖5A）。與對(duì)照組相比，PDM組大鼠子宮組織NLRP3（P＜ 0.001，見圖5B）、ASC（P＜ 0.001，見圖5C）、caspase-1（P＜ 0.01，見圖5D）、cleaved caspase-1（P＜ 0.01，見圖5E）蛋白表達(dá)水平顯著升高。與PDM 組比較，MCC950組NLRP3（P＜ 0.001，見圖5B）、ASC（P＜ 0.01，見圖5C）、caspase-1（P＜ 0.05，見圖5D）、cleaved caspase-1（P＜ 0.05，見圖5E）蛋白表達(dá)水平顯著降低。

圖5 各組大鼠子宮組織NLRP3 炎癥小體組件NLRP3、ASC、caspase-1、cleaved caspase-1 蛋白表達(dá)水平的比較(n = 5,±SD)Fig.5 Comparison of the protein expression levels of the NLRP3 inflammasome components NLRP3, ASC, caspase-1 and cleaved caspase-1 in the uterine tissue of rats in each group (n = 5,±SD)

6.MCC950 下調(diào)焦亡蛋白和炎癥因子的表達(dá)

為了確定PDM 大鼠子宮組織損傷和焦亡的原因，通過Western blot 檢測(cè)GSDMD、GSDMD-N、IL-1β 和IL-18 的蛋白表達(dá)水平（見圖6A）。與對(duì)照組相比，PDM 組大鼠子宮組織中GSDMD（P＜0.001，見圖6B）、IL-1β（P＜ 0.001，見圖6C）、GSDMD-N（P＜ 0.01，見圖6D）、IL-18（P＜ 0.001，見圖6E）蛋白表達(dá)水平明顯升高。與PDM 組比較，MCC950 組大鼠子宮組織中GSDMD（P＜ 0.001，見圖6B）、IL-1β（P＜ 0.001，見圖6C）、GSDMD-N（P＜ 0.05，見圖6D）、IL-18（P＜ 0.001，見圖6E）蛋白表達(dá)水平顯著降低。

圖6 各組大鼠子宮組織中焦亡蛋白及炎癥因子的比較(n = 5,±SD)Fig.6 Comparison of pyroptotic proteins and inflammatory factors in the uterine tissue of rats in each group (n = 5,±SD)

討 論

NLRP3 炎癥小體活化而引起的炎癥是許多疾病的基礎(chǔ)[26]。NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)炎癥、組織損傷和婦科疾病如子宮內(nèi)膜異位癥、婦科腫瘤和多囊卵巢綜合征等[27]。NLRP3 炎癥小體的組裝是由模式識(shí)別受體對(duì)危險(xiǎn)相關(guān)分子模式和病原體相關(guān)分子模式做出反應(yīng)決定的[13]。本研究結(jié)果顯示，PDM大鼠子宮組織中NLRP3 炎癥小體組件蛋白表達(dá)上升，NF-κB 和磷酸化NF-κB 的表達(dá)也上升。NLRP3炎癥小體的激活包括兩個(gè)過程：一是上調(diào)NLRP3 的炎癥小體成分（包括NLRP3、ASC 和caspase-1），并對(duì)NLRP3 進(jìn)行翻譯后修飾，獲得激活條件；二是對(duì)NLRP3 激活子的識(shí)別和NLRP3 炎癥小體的形成[28]。在PDM 中，NLRP3 炎癥小體激活可能由toll 樣受體等模式識(shí)別受體引起，導(dǎo)致NF-κB 激活和基因轉(zhuǎn)錄，或由線粒體功能障礙引起[29～31]。因 此PDM 中 出 現(xiàn)NLRP3 炎 癥 小 體 和NF-κB 通路的活化。本研究結(jié)果顯示PDM 大鼠子宮組織GSDMD 和GSDMD-N 顯著升高。NLRP3 炎癥小體激活后，caspase-1 被剪切形成具有活性的cleaved caspase-1，基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)[32]。cleaved caspase-1 剪切GSDMD 形成GSDMD-N，GSDMD-N在細(xì)胞膜上形成孔，引起焦亡[18]。此外，ASC 可以增加GSDMD 的含量，促進(jìn)GSDMD 活化[33]。相反，靶向敲低GSDMD 基因阻斷了細(xì)胞焦亡，而在增加外源性GSDMD 表達(dá)后，焦亡被重新激活[34]。這些實(shí)驗(yàn)表明GSDMD 是焦亡的執(zhí)行蛋白。因此可以推斷，在PDM 大鼠子宮組織中，NLRP3 炎癥小體發(fā)生活化并引發(fā)了焦亡。此外，本研究結(jié)果顯示，在PDM 大鼠子宮組織中，IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)升高。PDM 模型大鼠血清中PGF2α 以及PGF2α/PGE2 表達(dá)明顯升高。Lim 等的研究表明[35]，分娩時(shí)人的子宮收縮，NLRP3 蛋白表達(dá)增加，PGF2α 表達(dá)也增加。靶向敲除NLRP3 后，PGF2α 表達(dá)明顯降低。PG 中特別是可引起子宮收縮的PGF2α，參與了PDM 的發(fā)病[36]。隨著PGF2α/PGE2 比值升高，導(dǎo)致子宮平滑肌收縮加重[37]，從而加重PDM。這些結(jié)果提示，NLRP3 激活引起的PG 升高是PDM 的發(fā)病機(jī)制之一。細(xì)胞死亡命名委員會(huì)將細(xì)胞焦亡定義為依賴caspase-1 導(dǎo)致染色質(zhì)碎裂、質(zhì)膜透化的細(xì)胞腫脹和炎性內(nèi)容物IL-1β 和IL-18 釋放的程序性細(xì)胞死亡[38]。通常，細(xì)胞焦亡會(huì)引起組織損傷，炎癥物質(zhì)IL-1β 和IL-18 本身就是致痛源[39～41]。因此，PDM 的組織損傷和疼痛可能是由焦亡過程中釋放的IL-1β 和IL-18 介導(dǎo)的。

MCC950 是一種選擇性NLRP3 抑制劑，對(duì)全身多個(gè)器官具有藥理作用[42]。MCC950 作用于NLRP3 蛋 白NACHT 結(jié) 構(gòu) 域 的Walker B 位 點(diǎn)，從 而 阻 斷ATP 水 解 和NLRP3 活 化[43]。NLRP3是一種包含氨基端pyrin 結(jié)構(gòu)域、羧基端富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域和中央NACHT 結(jié)構(gòu)域的三聯(lián)蛋白。刺激誘導(dǎo)NLRP3 寡聚化通過NLRP3 蛋白中央NACHT 結(jié)構(gòu)域的同型相互作用招募ASC，ASC 中的caspase 招募結(jié)構(gòu)域招募caspase-1[28]。在生理?xiàng)l件下，NLRP3中LRR-LRR與PYD的相互作用保持穩(wěn)定，避免過早激活[44]。最近的報(bào)道顯示[45]，MCC950 與天然NLRP3 蛋白形成穩(wěn)定的十聚體，提示MCC950可以有效結(jié)合NLRP3 并發(fā)揮抑制作用。本研究結(jié)果 顯 示，MCC950 干 預(yù) 后NF-κB 通 路 和NLRP3炎癥小體組件蛋白的表達(dá)均下降。NLRP3 蛋白是NLRP3 炎癥小體的傳感器[46]。抑制NLRP3 蛋白后，ASC 和caspase-1 的招募能力下降，NLRP3 炎癥小體受到抑制，不能有效產(chǎn)生cleaved caspase-1，進(jìn)而抑制IL-1β 的分泌。MCC950 能有效抑制NLRP3 蛋白激活，但MCC950 干預(yù)如何抑制NF-κB 的轉(zhuǎn)錄還不完全清楚。有證據(jù)表明，NLRP3 下游因子IL-1β 可通過磷酸化位點(diǎn)Ser316、Ser529 和Ser536 激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[47,48]，這可能與MCC950 干預(yù)抑制NF-κB有關(guān)。由于NLRP3 炎性小體和cleaved caspase-1 被抑制，導(dǎo)致下游GSDMD 的數(shù)量和活性降低，因此MCC950 干預(yù)抑制PDM 大鼠的子宮焦亡和炎癥物質(zhì)的釋放。本研究結(jié)果表明，MCC950 抑制了PGF2α的表達(dá)。由于NLRP3 被直接抑制，PGF2α 的產(chǎn)生也減少。與對(duì)照組相比，MCC950 組行為學(xué)和部分Western blot 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，子宮病理損傷評(píng)分、血清PG 和部分Western blot 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明經(jīng)過MCC950 的干預(yù)后，PDM 大鼠得到緩解。

本研究存在潛在的局限性：首先，沒有測(cè)量基因水平上的表達(dá)，沒有分離子宮細(xì)胞以獲得更精準(zhǔn)的藥物控制。此外，PDM 中NLRP3 炎癥小體激活的啟動(dòng)機(jī)制目前尚不清楚。因此，未來可以從以下方面開展研究：①從遺傳學(xué)角度出發(fā)，不排除基因編輯；②從子宮或其他組織中分離細(xì)胞并施加藥物干預(yù)，以獲得更精準(zhǔn)的靶點(diǎn)；③確定PDM 中NF-κB通路和NLRP3 炎癥小體激活的機(jī)制。

綜上所述，MCC950 可抑制PDM 中NF-κB 通路和NLRP3炎癥小體的活化，減少焦亡和組織損傷，從而緩解PDM。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。